張宏圖，董偉進，陳 南，徐乾達，高浩祥，何 強，曾維才,,

（1.四川大學(xué)食品工程系，四川成都 610065；2.四川大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)四川省高校重點實驗室，四川成都 610065）

糖尿病是一種因糖代謝紊亂而引發(fā)的慢性疾病，因其較高的患病率與死亡率而備受關(guān)注[1]。全球約90%糖尿病患者罹患的是Ⅱ型糖尿病[2]。大量研究表明，Ⅱ型糖尿病的發(fā)病與持續(xù)性的餐后高血糖癥密切相關(guān)。因此，有效延緩餐后血糖濃度的上升已成為治療糖尿病的重要舉措[3]。目前，市場上用于糖尿病治療的藥物主要為阿卡波糖、伏格列波糖等糖類水解酶抑制劑，這類藥物雖然可以有效抑制餐后血糖的上升，但長期服用會引發(fā)惡心、嘔吐、腸胃脹氣、腎功能紊亂等副作用以及抗藥性逐漸增強等問題[4-5]。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，來源于植物的無毒無害的多酚類提取物對α-淀粉酶具有較好的抑制活性[6-8]。因此，從天然植物資源中探尋安全、有效的多酚類抑制劑已成為食品、生物及醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。

茶多酚是茶葉內(nèi)多酚類物質(zhì)的總稱，也是其主要的天然活性物質(zhì)。茶多酚主要包括兒茶素類物質(zhì)，如表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）等。研究表明茶多酚具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種功效，同時茶多酚在蛋白質(zhì)沉淀、酶抑制方面表現(xiàn)出良好特性[9-10]。因此，研究茶多酚與α-淀粉酶的相互作用在多酚抑制劑的挑選中具有重要的意義。目前，國內(nèi)外相關(guān)研究主要集中在提取物制備工藝的優(yōu)化、提取溶劑的篩選與比較、不同種類及來源的茶葉抑制活性的差異及動物模型的活性評價[6-8]，而系統(tǒng)地從動力學(xué)、光譜學(xué)及分子相互作用角度由表及里、從現(xiàn)象到機理較為系統(tǒng)地探討和分析茶多酚對糖類消化酶抑制作用的研究較少。同時，通過觀察和分析茶多酚與糖類消化酶相互作用過程中分子作用力、分子結(jié)合位點、空間結(jié)構(gòu)的變化，進而探討茶多酚抑制糖類消化酶活性的相關(guān)研究也較少。因此，從分子相互作用角度系統(tǒng)研究茶多酚對α-淀粉酶活性的抑制作用有益于拓寬和提升茶多酚在相關(guān)領(lǐng)域的資源化利用。

本文以茶多酚和α-淀粉酶為對象，采用抑制動力學(xué)和光譜學(xué)，分析了茶多酚對α-淀粉酶活性的抑制作用，并通過對熒光色譜法和圓二色譜法觀察了茶多酚對α-淀粉酶空間結(jié)構(gòu)的影響，進一步采用分子對接技術(shù)探究了茶多酚與α-淀粉酶相互作用過程中分子作用力、分子結(jié)合位點、空間結(jié)構(gòu)的變化，從分子層面上初步揭示了茶多酚抑制α-淀粉酶活性的機理，為茶多酚在α-淀粉酶抑制劑方面的應(yīng)用提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶多酚（純度≥95%） 通澤生物科技有限公司；α-淀粉酶（酶活52 U/mg）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG） 阿拉丁試劑公司；實驗用水 蒸餾水；3,5-二硝基水楊酸、亞硝酸鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉、可溶性淀粉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉等試劑 均為分析純，成都科隆化工試劑廠。

ESJ210-4A型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；UV-2000型紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器公司；Milii-Q Element超低元素型超純水系統(tǒng) 上海晶儀科學(xué)儀器有限公司；F-7000型熒光色譜儀 日本Hitachi公司；Chirascan型圓二色譜儀英國應(yīng)用光物理公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多酚對α-淀粉酶的抑制作用 采用Bernfeld法測定茶多酚對α-淀粉酶的抑制作用[11]。取2.0 g可溶性淀粉溶于適量的磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH6.9），煮沸10 min，其間不斷攪拌，冷卻至室溫后定容至200 mL，備用；以相同的溶劑配制0.02 mg/mL的α-淀粉酶溶液（酶活52 U/mg），這里的酶活定義為1 min內(nèi)分解產(chǎn)生1 μmol麥芽糖所需要的α-淀粉酶的質(zhì)量（mg），4 ℃冷藏備用。

取0.25 mL酶溶液于37 ℃水浴1 min，加入0.25 mL不同濃度的茶多酚溶液（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mg/mL），37 ℃孵育4 min，隨后加入0.5 mL淀粉溶液，混勻后于37 ℃孵育4 min，然后加入1 mL DNS試劑[12]，沸水浴8 min，避光冷卻至室溫后加10 mL蒸餾水，于540 nm波長下測定混合溶液的吸光度。通過麥芽糖標準曲線（y=2.8167x-0.1421，其中x為吸光度，y為麥芽糖濃度（μmol/mL），R2=0.9932）計算酶活。以未添加α-淀粉酶的混合溶液為空白對照，計算茶多酚對于α-淀粉酶的抑制率，并求取半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：A為有抑制劑時α-淀粉酶的活性，U/mg；B為無抑制劑時α-淀粉酶的酶性，U/mg。

1.2.2 抑制動力學(xué)分析 參考1.2.1節(jié)的方法，取0.25 mL的α-淀粉酶溶液與0.25 mL茶多酚溶液（0、0.6、1.0、1.4和1.8 mg/mL）混合，再加入0.5 mL淀粉溶液（4、6、8、10、12、14和16 mg/mL），充分反應(yīng)后測定混合溶液的吸光度以得到不同底物濃度下的酶促反應(yīng)速率。采用Lineweave-Burk雙倒數(shù)作圖法，以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標，反應(yīng)速率（1/v）為縱坐標，繪制不同茶多酚濃度下的雙倒數(shù)曲線圖，判斷抑制類型[13]。

1.2.3 熒光光譜分析α-淀粉酶、茶多酚、EGCG溶液均用磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH6.9）配制。茶多酚反應(yīng)組：α-淀粉酶溶液（1.0 mg/mL，3 mL）與0.2 mL茶多酚溶液混勻，使得茶多酚的最終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mg/mL；EGCG反應(yīng)組：α-淀粉酶溶液（1.0 mg/mL，3 mL）與0.2 mL的EGCG溶液混勻，使得EGCG的最終濃度分別為0、20、40、60、80、100和120 μmol/L）。將各反應(yīng)組溶液置于不同溫度（20、30、37 ℃）孵育5 min，測定其熒光吸光度，上述溫度的選擇依據(jù)預(yù)實驗以及相似研究而定[14]。熒光激發(fā)波長為280 nm，掃描范圍為290～450 nm，激發(fā)和發(fā)射縫均為5 nm，掃描速率為700 nm/min。

1.2.4 圓二色譜（circular dichroism，CD）分析 以磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH6.9）為溶劑，配制α-淀粉酶溶液（1 mg/mL）和茶多酚溶液（0.5 mg/mL），分別取1.5 mL兩種溶液混勻，測定混合液的圓二色譜，掃描波長為260～200 nm，間隙為1 nm[15]，未添加茶多酚的α-淀粉酶溶液作空白對照。通過CDpro軟件（http://lamar.colostate.edu/～scream/CDPro）的Selcon3程序進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析。

1.2.5 分子對接 采用Discovery Studio 2019（Version 16.1，SanDiego，CA，USA）的CDOCKER模塊對α-淀粉酶與EGCG進行分子對接。α-淀粉酶結(jié)構(gòu)（1HNY）從RCSB Protein Data Bank（http://www.rcsb.org/pdb）數(shù)據(jù)庫中獲取，去除體系內(nèi)水分子后采用“Clean Protein”模塊優(yōu)化后使用；EGCG分子從Zinc數(shù)據(jù)庫（http://zinc.docking.org/）內(nèi)獲取，并采用CHARMM力場對其結(jié)構(gòu)優(yōu)化后使用。然后，通過“Find Sites from Receptor Cavities”模塊探尋α-淀粉酶和EGCG的最佳結(jié)合位點，選取最佳的結(jié)合位點，在“Receptor-Ligand Interactions”模塊下的“Dock Ligands（CDOCKER）”子模塊中展開分子對接，活性區(qū)域半徑設(shè)置為5 ?，以α-淀粉酶為受體，以EGCG為配體，其他參數(shù)按照默認設(shè)置，對接完成后選取“-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY”打分最高的結(jié)合方式分析兩者之間的分子作用力類型、占比和分子結(jié)合位點等情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)進行三次，結(jié)果以“平均值±標準差”的形式表示。實驗結(jié)果使用Origin（2019b for window，OriginLab Corporation，MA，USA）進行統(tǒng)計學(xué)分析及繪圖，顯著性差異P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對α-淀粉酶的抑制作用影響

茶多酚對α-淀粉酶的抑制能力以IC50值的大小進行表示，即α-淀粉酶的活力降低一半時所需茶多酚的濃度[16]。由圖1所示，隨著茶多酚濃度的增大，其對α-淀粉酶的抑制率顯著提高（P＜0.05），當(dāng)茶多酚濃度為1.6 mg/mL時，抑制率高達72.19%。此外，通過曲線擬合后得出茶多酚對于α-淀粉酶的半抑制濃度IC50值為1.35 mg/mL。雖然與臨床用藥物阿卡波糖（IC50=0.089 mg/mL）相比，茶多酚對于α-淀粉酶的抑制能力較低，但其與鼠尾草酸（IC50=1.12 mg/mL）等天然提取物的抑制效果相似[15]，且具有易于生產(chǎn)、價格低廉、綠色安全等優(yōu)點。結(jié)果表明，茶多酚在α-淀粉酶抑制劑的開發(fā)中具有潛在的價值。

圖1 茶多酚對α-淀粉酶的抑制作用Fig.1 Inhibition effort of tea polyphenols on α-amylase

2.2 茶多酚對α-淀粉酶的抑制動力學(xué)分析結(jié)果

由圖2所示，隨著茶多酚濃度的提高，直線的斜率增大，與y軸的交點上移，即最大反應(yīng)速率（Vmax）減小，且?guī)缀跛胁瓒喾邮茉嚌舛认碌闹本€都交于第二象限的一點，表明茶多酚對α-淀粉酶的抑制類型為非競爭性抑制。非競爭性抑制遵守動力學(xué)Cornish-Bowden方程[17]：

圖2 不同茶多酚濃度下的Lineweaver-Burk圖Fig.2 Lineweaver-Burk plots of α-amylase inhibition by various concentrations of tea polyphenols

式中：v為酶促反應(yīng)速率，mmol/（L·min）；Km為米氏常數(shù)，mg/mL；Vmax為最大反應(yīng)速率，mmol/（L·min）；C為抑制劑濃度，mg/mL；S為淀粉濃度，mg/mL；Kic為競爭性抑制常數(shù)；Kiu為反競爭性抑制常數(shù)。

由Cornish-Bowden方程可知，只有當(dāng)Kic和Kiu都存在時，1/v與1/[S]的雙倒數(shù)圖才可以在不同抑制劑濃度下恒過第二象限的定點，由此可以判斷茶多酚對于α-淀粉酶呈非競爭性抑制，即茶多酚既可以和α-淀粉酶結(jié)合又可以和α-淀粉酶-淀粉復(fù)合物結(jié)合。推測是由于茶多酚屬于混合物，其內(nèi)不同成分對于α-淀粉酶的抑制類型不盡相同，整體表現(xiàn)為非競爭性抑制。由圖2可知，當(dāng)?shù)矸鄣臐舛戎饾u上升時，酶促反應(yīng)的速率之間的差距減少，表明底物濃度的提高可以適當(dāng)緩解茶多酚對α-淀粉酶的抑制作用，這與茶多酚的競爭性抑制特性強于反競爭性抑制特性的特征有關(guān)[18]。

2.3 茶多酚及主要成分EGCG對α-淀粉酶的熒光猝滅效應(yīng)

在一定的激發(fā)波長下，蛋白質(zhì)中的色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸可以發(fā)射熒光，從而使得蛋白質(zhì)具有熒光特性，蛋白質(zhì)的熒光特性與這些氨基酸殘基所處的微環(huán)境密切相關(guān)[19]。α-淀粉酶由496個氨基酸殘基組成，包括17個色氨酸，因此α-淀粉酶熒光特性的變化可以直接反映酶空間結(jié)構(gòu)的變化[20]。

由圖3可見，隨著茶多酚濃度的增大，α-淀粉酶的熒光發(fā)射峰顯著下降，且最大發(fā)射波長（λmax）發(fā)生了輕微的紅移，當(dāng)茶多酚添加濃度達到1.2 mg/mL時，最大發(fā)射波長由340 nm紅移至342 nm。由圖4可見，茶多酚主要成分EGCG對α-淀粉酶熒光特性的影響與茶多酚類似，這與徐冬蘭等人探究咖啡酰奎尼酸類物質(zhì)對α-淀粉酶的熒光特性影響相似[15]。Gong等[4]在利用熒光色譜法研究蘋果多酚對于α-葡糖苷酶構(gòu)象影響時，也出現(xiàn)了最大發(fā)射波長紅移的現(xiàn)象。熒光色譜中最大發(fā)射波長的紅移意味著蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)發(fā)生舒展以及酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性下降，推測可能是由于茶多酚通過疏水相互作用與較強芳香性及疏水性的氨基酸結(jié)合，從而使得蛋白質(zhì)更多肽鏈暴露于溶劑環(huán)境之下[4,21]。

圖3 茶多酚對α-淀粉酶熒光特性的影響Fig.3 Effect of tea polyphenols on the fluorescence characteristics of α-amylase

圖4 EGCG對α-淀粉酶熒光特性的影響Fig.4 Effect of tea polyphenols on the fluorescence characteristics of α-amylase

2.4 茶多酚主要成分EGCG對α-淀粉酶的猝滅類型分析結(jié)果

熒光猝滅類型分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅，其中動態(tài)猝滅遵守Stern-Volmer方程[14]：

式中：F0為未加淬滅劑時的熒光強度；F為加入淬滅劑后的熒光強度；Kq為熒光猝滅速率常數(shù)，L/（mol·s）；τ0為熒光分子的初始平均壽命，生物大分子一般為10-8s；c為猝滅劑濃度，mol/L。

由于茶多酚為混合物，因此采用其主要成分EGCG分析二者間的猝滅類型。如圖5所示，在不同溫度（20、30、37 ℃）下，當(dāng)EGCG的添加濃度低于80 μmol/L時，其濃度與F0/F呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其猝滅速率常數(shù)分別為6.78×1013、6.85×1013、7.93×1013L/（mol·s），遠遠高于動態(tài)猝滅中各種熒光猝滅劑對生物大分子（主要是蛋白質(zhì)）的最大碰撞猝滅常數(shù)2×1010L/（mol·s）[22]，這說明該濃度梯度內(nèi)，EGCG對α-淀粉酶的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅。當(dāng)EGCG的添加濃度大于80 μmol/L時，其濃度與F0/F呈非線性關(guān)系，且曲線朝向y軸，這可能是由于較高濃度EGCG的添加，增大了其與發(fā)光氨基酸殘基之間的碰撞概率，猝滅類型由原來單一的靜態(tài)猝滅轉(zhuǎn)變?yōu)榱藙討B(tài)-靜態(tài)猝滅混合的形式[23]。

圖5 EGCG對α-淀粉酶的熒光猝滅作用Fig.5 Fluorescence quenching effect of EGCG on α-amylase

2.5 茶多酚主成分EGCG與α-淀粉酶間的結(jié)合常數(shù)

當(dāng)EGCG添加濃度低于80 μmol/L時，其對α-淀粉酶的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅，符合以下方程[14]：

式中：F0為未加淬滅劑時的熒光強度；F為加入淬滅劑后的熒光強度；Ka為表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點數(shù)；c為猝滅劑濃度，mol/L。

以lgc為橫坐標（x），以lg（F0-F）/F為縱坐標（y）作圖，擬合和計算不同溫度下結(jié)合常數(shù)（Ka）與結(jié)合位點數(shù)（n）。

由表1可知，20 ℃下EGCG與α-淀粉酶的結(jié)合常數(shù)達到了107數(shù)量級，隨著溫度的升高，二者的結(jié)合常數(shù)逐漸下降，結(jié)合位點數(shù)降低，表明溫度的升高影響了EGCG與α-淀粉酶之間的結(jié)合能力。這可能是由于EGCG主要通過氫鍵與酶發(fā)生結(jié)合，而溫度的升高降低了氫鍵的穩(wěn)定性，進而抑制了二者的結(jié)合。

表1 不同溫度下EGCG與α-淀粉酶的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)Table 1 Binding constant and site of EGCG with α-amylase under different temperatures

2.6 茶多酚對α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的影響

本實驗利用圓二色譜法來測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化[24]。由圖6可知，茶多酚的加入顯著改變了α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)。其中，α-螺旋在208及220 nm下具有兩個特征負峰[25]，茶多酚的加入使得兩處負峰的面積明顯增大，表明茶多酚的添加提高了α-淀粉酶中α-螺旋的含量。由表2可見，茶多酚的添加使得α-螺旋含量由31.0%增大至80.2%，而其中β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲的占比顯著下降。結(jié)果表明，茶多酚的添加使得α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)由層狀結(jié)構(gòu)向螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，進而影響了酶的活性。同時，圓二色譜所反映的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化也與熒光實驗結(jié)果相互驗證。研究表明，α-螺旋結(jié)構(gòu)的大量增加意味著α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)變得更加松散[26]，蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)展開。這與上述熒光色譜中最大發(fā)射波長紅移所表示的蛋白結(jié)構(gòu)變化一致[21]，都表明了茶多酚是通過改變α-淀粉酶的空間結(jié)構(gòu)實現(xiàn)其抑制作用。

圖6 茶多酚對α-淀粉酶圓二色譜的影響Fig.6 Effect of tea polyphenol on the α-amylase’s circular dichroism spectroscopy

表2 茶多酚對α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of tea polyphenol on the α-amylase’s secondary structure

2.7 分子對接

選取“-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY”打分值最高的構(gòu)象進行分析，分子對接結(jié)果如圖7所示。

圖7 EGCG與α-淀粉酶的分子對接Fig.7 Molecular docking for the interaction between α-amylase and EGCG

由圖7可知，EGCG主要通過氫鍵、疏水相互作用等分子作用力與α-淀粉酶的His299、Asp197、His305、Gly306、Trp59、Glu233以及Asp300等氨基酸殘基結(jié)合。相關(guān)文獻表明，Glu233、Asp197以及Asp300為α-淀粉酶的關(guān)鍵催化位點，對于其催化活性具有重要影響[27]。由此可以推測，EGCG能夠與α-淀粉酶的催化位點結(jié)合，競爭性地搶奪淀粉與α-淀粉酶之間的結(jié)合區(qū)域，從而降低α-淀粉酶的催化效率。抑制動力學(xué)實驗表明，茶多酚屬于非競爭性抑制，既具有競爭性特性又具有反競爭性特性，EGCG在其競爭性特性中具有重要作用，而其反競爭性抑制特性與其它成分相關(guān)[18]。

由表3可見，EGCG主要通過氫鍵與α-淀粉酶殘基結(jié)合，與其他多酚類物質(zhì)（如黃酮類、酚酸類）相似，苯環(huán)上羥基結(jié)構(gòu)起到了重要的作用[15,28]，羥基參與形成的氫鍵在圖7（c）中顯示了5種可能的方式。與其他多酚不同，EGCG苯環(huán)上的沒食子酰基也參與了氫鍵的形成。研究表明，隨著沒食子?；脑黾樱瓒喾訉Ζ?淀粉酶的抑制能力顯著提升[29]。EGCG通過疏水相互作用與TRP59殘基周圍的疏水腔結(jié)合，進而影響其微環(huán)境的極性[30]，這可能是由于EGCG分子苯環(huán)上的電子與色氨酸內(nèi)的C=C雙鍵上的電子形成共軛體系。同時，有研究表明沒食子?；腃=O雙鍵也參與了共軛[28]，使得EGCG影響了TRP59的熒光特性，從而導(dǎo)致了熒光色譜實驗中所出現(xiàn)的熒光猝滅現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，EGCG可以通過氫鍵和疏水相互作用與α-淀粉酶形成復(fù)合物，從而改變酶的空間結(jié)構(gòu)，進而降低其對淀粉的催化能力。

表3 EGCG與α-淀粉酶之間的分子作用力類型Table 3 Methods of molecular force between α-amylase and EGCG

3 結(jié)論

茶多酚主成分EGCG以氫鍵和疏水相互作用與Glu233、Asp197以及Asp300等α-淀粉酶催化活性位點結(jié)合，競爭性抑制酶的催化活性；茶多酚分子與TRP59等氨基酸的結(jié)合，使得蛋白質(zhì)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)，隨著濃度的上升，猝滅類型會逐步由靜態(tài)猝滅向動態(tài)與靜態(tài)混合猝滅轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為蛋白結(jié)構(gòu)舒展，疏水腔暴露于外界環(huán)境。α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)隨茶多酚的添加發(fā)生明顯變化，層狀結(jié)構(gòu)向螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，酶的天然結(jié)構(gòu)遭到破壞。實驗結(jié)果表明茶多酚可通過氫鍵和疏水相互作用與α-淀粉酶形成復(fù)合物，從而發(fā)揮對α-淀粉酶催化活性的抑制作用。研究為茶多酚在糖尿病患者可食性食品中的應(yīng)用提供了理論和實踐基礎(chǔ)。