張 峰 李 燕 李偉華

（濟(jì)南市人民醫(yī)院病理科，濟(jì)南 271100）

肝硬化（hepatic cirrhosis）是由各種慢性肝病發(fā)展到肝纖維化后逐漸演變的過程[1]。機(jī)體肝硬化之后導(dǎo)致各種嚴(yán)重的不良后果[2-3]。肝硬化的形成是一個循序漸進(jìn)的過程，最終肝變形變硬形成肝硬化[5-6]。肝功能受損或病情發(fā)展嚴(yán)重到肝硬化時，血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平均升高。當(dāng)肝受到刺激時，機(jī)體做出一系列反應(yīng)，過度應(yīng)答會出現(xiàn)全身變化，活化的巨噬細(xì)胞會釋放大量腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等細(xì)胞因子，κ基因結(jié)合核因子（nuclear factor-κ-gene binding，NFκB）水平也會隨之升高。還可誘導(dǎo)炎性因子IL-6的產(chǎn)生，參與肝內(nèi)炎性損傷過程[6]。中藥在治療各種疾病方面都起到良好的作用。黃芪味甘性溫是臨床常用中藥材之一，具有固表補(bǔ)氣、升陽舉陷、利尿消腫等作用[7-8]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有保護(hù)腹膜、肝臟、心腦血管等功效，對肺功能及利尿等方面有一定的改善效果[9]。因此本研究探討黃芪總黃酮對肝硬化大鼠肝組織病理、代謝指標(biāo)以及NF-κB的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗大鼠與試劑

35只SD大鼠，購買于南京君科生物工程公司，體質(zhì)量190～210 g，分7籠飼養(yǎng)，室溫24℃±1℃，濕度45%～50%，大鼠活動飲水自由。

黃芪總黃酮購于浩翔生物（寶雞）；四氯化碳購于億德瑞生物公司（大連）；美他多辛片購買于震元制藥公司（浙江）；TRIzol試劑盒購買于百泰克生物公司（無錫）；酶聯(lián)免疫試劑盒購買于艾博因生物科技（江西）；一抗、二抗購買于西格生物科技（上海）；全自動生化儀購買于賽譜分析儀器公司（滕州）。

1.3 動物分組與肝硬化動物模型建立

將35只健康大鼠隨機(jī)分為健康組、肝硬化組、低濃度黃芪總黃酮組（低濃度組）、高濃度黃芪總黃酮組（高濃度組）、美他多辛組，每組7只。除健康組外，給予其他組大鼠初次注射40%四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）花生油溶液（0.3 mL/100 g）皮下注射，以后注射CCl4劑量依體質(zhì)量變化調(diào)整，每周2次[10]，一共注射21 d。觀察大鼠肝腫脹度，取肝組織H-E染色。對比健康組及造模組指標(biāo)，確定造模是否成功。

1.4 干預(yù)方法

建模后，肝硬化組每天給予四氯化碳花生油等量的橄欖油，每周2次，以后橄欖油劑量依體質(zhì)量變化調(diào)整。肝硬化組用普通飼料及蒸餾水進(jìn)行飼養(yǎng)。低濃度組給予黃芪總黃酮0.5 mg/kg灌胃；高濃度組給予黃芪總黃酮2.0 mg/kg灌胃；美他多辛組給予美他多辛片溶液0.15 mL/10 g灌胃。上述藥物均1次/日，各組治療2周后停止給藥，健康組和肝硬化組給予同體積的生理鹽水。

1.5 ELISA法檢測大鼠肝功能AST、ALT、TBIL水平和血清 TNF-α、IL-6、IL-8、NF-κB、NF-κB p65水平

采大鼠腹腔靜脈血，離心機(jī)離心（離心轉(zhuǎn)數(shù)4 000 r/min，離心時間15 min）收集血清，應(yīng)用全自動生化儀檢測AST、ALT、TBIL 等水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

大鼠尾部取血2 mL，立即離心（3 500 r/min）取上清液，注入無菌試管中（肝素抗凝），室溫靜置1 h放入4℃冰箱，取血清采用ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-8、NF-κB、NF-κB p65水平。

1.6 H-E染色檢驗大鼠肝組織病理形態(tài)

用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，處死后分離大鼠肝，取各組大鼠肝組織常規(guī)脫水，浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，染色，脫蠟、水合，透明封片，光鏡下觀察大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化。

1.7 TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡情況

收集處理完的肝細(xì)胞，脫蠟后病理切片，嚴(yán)格按照細(xì)胞凋亡試劑盒操作，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI 2種染料染色混勻。再用篩網(wǎng)過濾，在室溫條件下避光孵育30 min，然后用PBS洗滌3次，每次5 min，再滴加DAPI避光孵育 5 min，PBS再次清洗4次，每次5 min，用吸水紙吸去切片上的液體，之后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.8 Realtime PCR 法檢測大鼠肝組織中NF-κB p65、TNF-α mRNA表達(dá)

采用TRIzol法提取總RNA，無核酸酶溶解。將提取的RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：42℃ 60 min，72℃作用5 min，4℃終點。每個細(xì)胞設(shè)置6個復(fù)孔，以β- actin為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95℃預(yù)作用3 min，95℃作用5 s，58℃退火，40個循環(huán)。采用2-△△CT法計算基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.9 免疫印跡檢測大鼠肝組織中NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)水平

各組大鼠肝組織加入少量胰蛋白酶消化后，加入蛋白裂解液快速混勻，離心后保留上清液，放置于75℃水浴10 min使蛋白變性后放入上樣孔中，每組取5 μg蛋白進(jìn)行電泳實驗。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜TBS浸泡10 min，反復(fù)PBS沖洗，每次5 min，加入一抗NF-κB、TNF-α抗體（1∶500 ）孵育過夜，后放入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，（1∶2 000）雜交沖洗。浸入ECL工作液，成像系統(tǒng)對印跡條帶的光密度進(jìn)行分析。β-actin 作為內(nèi)參，ECL化學(xué)發(fā)光試系統(tǒng)JY-Clear分析蛋白值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，各組大鼠AST、ALT、TBIL、炎性因子，各組大鼠TNF-α、NF-κB蛋白表達(dá)量等比較采用單因素方差分析，計量資料采用±s，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能AST、ALT、TBIL水平比較

與健康組相比，肝硬化組大鼠AST、ALT、TBIL水平明顯升高（P＜0.05）。與肝硬化組相比，低、高濃度組，美他多辛組各指標(biāo)均顯著下降（P＜0.05）。與美他多辛組相比，低、高濃度組降低明顯（P＞0.05），低、高濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

2.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL- 6、IL-8、NF-κB水平比較

與健康組相比，肝硬化組TNF-α、IL- 6、IL-8、NF-κB水平明顯升高（P＜0.05）。與肝硬化組相比，低、高濃度組，美他多辛組水平明顯降低（P＜0.05）。與美他多辛組相比，低、高濃度組降低明明顯（P＜0.05），低、高濃度組相比無差異（P＞0.05）（表2） 。

表2 各組大鼠血清ALT、AST、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-8水平比較（n=7， ±s）

表2 各組大鼠血清ALT、AST、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-8水平比較（n=7， ±s）

#P＜0.05 vs 健康組；*P＜0.05 vs肝硬化組；△P＜0.05 vs 高濃度組

組別ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）TNF-α（pg/mL）IL-6（ng/mL）IL-8（ng/mL）NF-κB（pg/mL）健康組 79.95±3.89 175.45±7.15 4.76±0.54 2.59±0.79 44.46±0.110.30±0.05 668.23±30.25肝硬化組346.45±5.94#1 158.20±20.26#203.36±8.24#17.56±3.45#130.32±8.89#2.56±1.59#1 302.12±130.16#低濃度組260.03±11.15*# 688.23±10.34*#169.95±5.29*# 9.03±2.56*# 83.45±6.25*#1.38±0.32*# 812.03±15.45*#高濃度組257.02±10.45*# 680.56±5.23*#160.25±2.29*# 8.79±1.32*# 80.78±7.89*#1.34±0.12*# 800.12±10.12*#美他多辛組290.23±20.21*#△ 715.23±15.21*#△178.45±10.42*#△11.23±4.46*#△ 90.23±10.26*#△1.76±1.02*#△ 836.56±70.23*#△P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)比較

健康組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，未見明顯的細(xì)胞變性壞死及其他明顯病理變化；肝硬化組大鼠肝匯管區(qū)、小葉間可見大量增生膠原纖維，肝組織出現(xiàn)明顯的條索樣改變，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂肪變性；低濃度組、高濃度組、美他多辛組大鼠較肝硬化組肝組織纖維增生明顯改善，肝小葉破壞得到改善（圖1）。

圖1 H-E染色觀察各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)比較，×200。A：健康組；B：肝硬化組；C：低濃度組；D：高濃度組；E：美他多辛組.

2.4 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡情況比較

與健康組大鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量（5±3）個比較，肝硬化組可見大量肝細(xì)胞凋亡（47±8）個。與肝硬化組相比，低濃度組、高濃度組和美他多辛組，肝細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯降低（P＜0.05）。與美他多辛組大鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量（28±8）個相比，低濃度組大鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量（13±5）個和高濃度組大鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量（14±3）個降低明顯（P＜0.05），高濃度組與低濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

2.5 各組大鼠肝組織NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較

與健康組相比，肝硬化組大鼠肝組織中NF-κB、TNF-α及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。與肝硬化組相比，低濃度組、高濃度組、美他多辛組大鼠肝組織中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）。與美他多辛組相比，低、高濃度組組NF-κB、TNF-α及NFκB p65蛋白表達(dá)水平降低明顯（P＜0.05），低、高濃度組相比無差異（P＞0.05），說明黃芪總黃酮有較好的抗炎效果（圖4、5）。

圖4 各組大鼠炎性因子表達(dá)水平

2.6 各組大鼠肝組織中炎癥因子NF-κB、NF-κB p65、TNF-αmRNA 表達(dá)水平比較

與健康組相比，肝硬化組肝組織中NF-κB、NF-κBp65及TNF-α mRNA 水平升高（P＜0.05）。與肝硬化組相比，低、高濃度組，美他多辛組肝組織中NF-κB、NF-κBp65、TNF-αmRNA表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）。與美他多辛組相比，低、高濃度組降低明顯（P＜0.05），低、高濃度組相比無顯著差異（P＞0.05）（表3）。

表3 各組大鼠 NF-κB、NF-κB p65和TNF-α mRNA表達(dá)水平（n=7， ±s）

表3 各組大鼠 NF-κB、NF-κB p65和TNF-α mRNA表達(dá)水平（n=7， ±s）

#P＜0.05 vs健康組；*P＜0.05 vs 肝硬化組；△P＜0.05 vs高濃度組

組別NF-κB mRNANF-κB p65 mRNATNF-α mRNA健康組1.00±0.001.00±0.001.00±0.00肝硬化組1.83±0.22#1.94±0.17#2.21±0.28#低濃度組1.41±0.18*#1.49±0.13*#1.62±0.23*#高濃度組1.36±0.13*#1.41±0.11*#1.56±0.19*#美他多辛組1.58±0.12*#△1.62±0.16*#△1.85±0.18*#△

圖5 各組大鼠TNF-α、NF-κB和NF-κB p65表達(dá)水平

3 討論

隨著生活水平的提高，人們的生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)都發(fā)生了很大的改變，我國的肝硬化發(fā)病率也逐年增高。臨床上導(dǎo)致肝硬化的原因很多，慢性肝病、長時間大量飲酒、濫用藥物或者各種病毒感染均可導(dǎo)致肝硬化[11]。目前治療肝硬化主要是給予抗病毒、保護(hù)肝臟、降酶等治療，但是會存在一定不良反應(yīng)[12-13]。隨著中醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，自古黃芪無論是單味藥應(yīng)用還是聯(lián)合應(yīng)用都有良好的藥用價值[14-17]。本研究探討黃芪總黃酮對肝硬化大鼠肝組織病理、代謝指標(biāo)及NF-κB的影響。

肝硬化的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，是多因素共同作用造成的，其中炎性反應(yīng)是造成肝硬化發(fā)生的因素之一。炎癥反應(yīng)發(fā)生后產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致各種免疫細(xì)胞調(diào)控組織進(jìn)行損傷修復(fù)，IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB等均參與其中[18]。TNF-α是一種主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要促炎因子，與肝細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活中性粒細(xì)胞，釋放大量氧自由基直接造成肝細(xì)胞的損傷。TNF-α既可以導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，也可誘導(dǎo)其凋亡[21]。TNF-α還可以激活細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，刺激IL-1和IL-8等的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的損傷或凋亡[20]。NF-κB是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB是一種調(diào)控炎癥反應(yīng)的多向因子，參與多種炎性反應(yīng)的過程。當(dāng)細(xì)胞靜息時，NF-κB處于非活性狀態(tài)，當(dāng)肝細(xì)胞受到刺激時即可激活NF-κB，使其發(fā)生轉(zhuǎn)錄。有研究表明CCl4誘導(dǎo)肝硬化過程中，CCl4可以改變腸黏膜的通透性，使內(nèi)毒素增多，誘導(dǎo)NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)位，從而釋放TNF-α、IL-8、IL-6等大量炎癥因子，從而造成肝細(xì)胞的損傷[21]。

有研究表明黃芪對肝纖維化、肝硬化有一定的治療作用[22]。黃芪中含有多糖、皂苷類、黃酮類等多種成分，其中黃芪總黃酮具有清除自由基、抗病毒、抑制血管通透性等作用。黃芪總黃酮還能降低肝組織羥脯氨酸含量、減輕假小葉的形成，抗肝纖維化的作用。有研究表明，黃芪總黃酮通過調(diào)控LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞p38MAPK信號通路以及相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制IL-6、TNF-α、NF-κB的生成，發(fā)揮抗炎免疫作用[23]。張國欣等[24]將肝缺血再灌注損傷大鼠分成3組，其中黃芪組與模型組相比，黃芪組大鼠肝組織的IL-8、TNF-α、NF-κB的水平指標(biāo)明顯下降，說明黃芪可以抑制肝硬化大鼠TNF-α、IL-8和NF-κB的表達(dá)。本研究顯示與健康組相比，肝硬化組TNF-α、IL- 6、IL-8和NF-κB水平明顯升高，干預(yù)后，高濃度組大鼠各指標(biāo)明顯下降，說明黃芪總黃酮具有抗炎的效果。本研究與上述研究一致。

肝是人體代謝器官，肝硬化發(fā)生后會導(dǎo)致體內(nèi)的各個指標(biāo)代謝紊亂，同時肝血液生化指標(biāo)也可以反映出肝損傷嚴(yán)重程度，其中主要反映肝細(xì)胞炎癥損害的重要酶類有AST、ALT。而TBIL異常時，肝細(xì)胞損害對膽紅素的攝取以及排泄功能降低。但肝受損害時，AST及ALT、TBIL指標(biāo)升高。有研究顯示肝硬化患者經(jīng)過治療后血糖、血脂、轉(zhuǎn)氨酶等各指標(biāo)均降低，肝硬化得到了一定程度的控制。中醫(yī)認(rèn)為黃芪具有升陽舉陷、益氣固表等功效，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明黃芪具有保護(hù)肝臟、增強(qiáng)免疫力及抗菌等功效。有學(xué)者認(rèn)為黃芪可能是通過調(diào)控p38MAPK 信號通路，降低血液生化中各個指標(biāo)，從而對肝起到了保護(hù)作用[25]。鮑家卉等[26]報道，低、中、高濃度黃芪提取物均可以降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶以及肝中甘油三酯的含量，減輕了小鼠肝纖維化程度，對小鼠肝起到一定的保護(hù)作用。段文彪等[27]研究表明，鱉甲煎丸能顯著改善肝硬化大鼠的肝損害，恢復(fù)肝功能。本研究經(jīng)過干預(yù)后，與肝硬化組相比，高、低濃度組肝硬化大鼠血清中的AST、ALT、TBIL的水平明顯下降。本研究與上述研究一致。

綜上所述，通過探討黃芪總黃酮對肝硬化大鼠肝組織病理、代謝指標(biāo)及NF-κB的影響，表明黃芪總黃酮可以降低肝硬化大鼠的代謝指標(biāo)，降低NF-κB的水平，從而達(dá)到治療肝硬化的目的。