環(huán)指和色氨酸-天冬氨酸重復序列結構域2（RFWD2），屬于COP-DET-FUS 家族成員，是一類E3泛素連接酶。在哺乳動物細胞中，內源性RFWD2主要以復合物形式存在于細胞核質和核膜中，少數(shù)存在于細胞質中，通過其卷曲螺旋區(qū)域形成二聚體發(fā)揮作用。RFWD2在多種腫瘤中異常高表達，可調節(jié)細胞增殖、分化及凋亡，以及DNA損傷修復。

RFWD2是哺乳動物中各種底物的關鍵負調節(jié)因子，包括p53、激活蛋白-1（AP-1）和c-Jun、p27（Kip1）、ETS轉錄因子的Pea3亞家族、轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白α、轉移相關蛋白（MTA1）、乙酰輔酶A 羧化酶、叉頭框蛋白O1（FoxO1）和轉錄共激活因子2。神經干細胞中缺失RFWD2的小鼠在發(fā)育中的腦和脊髓中顯示ETV1、ETV4、ETV5和c-Jun表達異常升高，促進了神經組細胞向膠質細胞分化。AP-1轉錄因子c-Jun廣泛表達于發(fā)育中的大腦，對神經發(fā)生至關重要。RFWD2可通過調控底物蛋白FoxO1表達，調節(jié)神經元形態(tài)、突觸發(fā)生和海馬的神經發(fā)生，且與焦慮和重度抑郁癥的發(fā)展相關。小鼠純合子RFWD2缺失（RFWD2）可導致E9.5～E12.5之間的胚胎致死，且大腦皮層、海馬和小腦明顯發(fā)育異常。因此，RFWD2參與的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對于調控哺乳動物腦的正常發(fā)育、神經元軸突生長與突觸發(fā)育都是至關重要的。

進水渠長45.0m，底寬18.7m，矩形斷面。進水口前2.5m為廠前水平段，高程為106.41m；總長45m采用坡度為1∶3的反坡段連接至121.4m高程。

樹突棘密度、形狀和大小異常與神經精神疾病密切相關，而維持突觸的功能和完整性取決于及時將無用或多余的蛋白質降解，蛋白質降解的失調將導致神經精神疾病的發(fā)生。我們推斷RFWD2可能是突觸蛋白內穩(wěn)態(tài)的一個關鍵調控因子，在控制調控神經元樹突發(fā)育、樹突棘形成與突觸蛋白穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用，但其具體作用機制仍不清楚。本研究通過分析RFWD2在小鼠大腦皮層神經元中的定位及分布，探討其表達水平對神經元樹突發(fā)育及樹突棘形成的功能效應及作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康Balb/c雌雄實驗小鼠均購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，清潔級動物房中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在26 ℃，取自胎齡16 d小鼠大腦皮層進行體外神經元培養(yǎng)。實驗動物的使用和實驗程序均經蚌埠醫(yī)學院實驗動物管理和倫理委員會（IACUC）批準（編號：

[35]寧德市政協(xié)文史資料：《閩東文史資料——閩東名人故居》第六輯，溫州：溫州大草原印業(yè)有限公司，2008年，第189頁。

1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基、Neurobasal 培養(yǎng)基（Gibco），鼠抗RFWD2、兔抗Synaptophysin（SYN）、雞抗Map2、兔抗ETV5、Myc tag抗體（Abcam），兔抗PSD95（CST），驢抗兔Cy3（Jackson Lab），兔抗ETV1、ETV4、c-Jun抗體（Bioss），驢抗鼠Alexa Fluor 488、驢抗雞Alexa Fluor 633、ToPro3、抗熒光淬滅封片劑（Invitrogen）。

1.3 RFWD2在小鼠全腦的表達譜

RFWD2-shRNA能夠顯著降低內源性RFWD2表達，并顯著提高神經元突觸蛋白的形成與數(shù)量（圖4A、B），SYN斑點數(shù)量由17.2±2.4/10 μm增至19.6±2.6/10 μm（<0.05）；而PSD95 斑點數(shù)量由8.5±1.3/10 μm 增至11.5±1.1/10 μm（<0.05，圖4C）。

馬克思在批判繼承前人的基礎上，開創(chuàng)了以經濟特性把握市民社會的傳統(tǒng)。 馬克思眼中的市民社會是在生產力發(fā)展到一定階段，以社會組織為形式，以商業(yè)生活和工業(yè)生活為內容，體現(xiàn)人們的物質交往關系并獨立于政治國家。 他汲取了黑格爾國家和市民社會關系中的合理成分后得出：市民社會決定國家，只有對市民社會進行深入的觀察和剖析，才能解決整個社會問題。 馬克思說“法的關系正像國家的形式一樣……相反，他們根源于物質生活關系，這些物質生活關系的總和，稱之為‘市民社會’，而對市民社會的解剖應該到政治經濟學中去尋找”[3]66。 因而，馬克思開始在政治經濟學中深入地研究市民社會。

1.4 RFWD2在不同發(fā)育時期小鼠大腦表達變化

提取小鼠胚胎14 d（Embryo14，E14），出生后（Postnatal，P0、P14、P21、P30、P60、P105）不同發(fā)育時期大腦皮層總蛋白，經Bcinchoninic acid（BCA）蛋白定量試劑盒定量后，每孔40 mg蛋白上樣SDS-PAGE電泳，電轉膜至PVDF 膜（0.45 μm），通過Western blot 檢測RFWD2與突觸囊泡蛋白（SYN）的相關性表達。

1.5 RFWD2在大腦皮層神經元中的表達與定位

農田排水溝渠是由植物、土壤/底泥、微生物所組成的半自然生態(tài)系統(tǒng)，可以通過植物截留、吸收、生物降解等一系列作用，降低排放到水體中的污染物含量。生態(tài)型排水溝渠，既可保持原有的排水功能，又可增強對農田排水所攜帶的氮磷去除效果。本研究基于多孔透水的溝道護砌材料、墊層材料、溝道植被生態(tài)系統(tǒng)、控制排水等方面，在試驗示范區(qū)構建完整的農田徑流生態(tài)滲濾溝道系統(tǒng)。

1.6 RFWD2在大腦皮層神經元樹突發(fā)育與樹突棘形成中的功能效應

取E16 胎鼠大腦皮層，制備神經元細胞懸液2×10/mL，使用Lonza 2B細胞核電轉染系統(tǒng)對過表達與抑制表達質粒進行電轉染，電轉染程序為Rat Hippo（neuron）O-003。過表達載體為pCMV-RFWD2-Myc（美國Luis A.Martinez 博士惠贈）和載體FUGW-GFP（4∶1比例）的混合物，抑制表達載體為RFWD2表達綠色熒光蛋白（GFP）特異性shRNA，pGPU6/GFP/Neo-RFWD2-shRNA（前期驗證有效），轉染的神經元通過GFP鑒定，體外培養(yǎng)至14～21 d，使用共聚焦顯微鏡檢測GFP陽性樹突分支，樹突棘密度、形狀和大小，Image J軟件進行Sholl分析。

1.7 RFWD2影響大腦皮層神經元功能的分子機制

分別提取RFWD2過表達、抑制表達與對照組大腦皮層神經元總蛋白，通過Western blot 檢測確定RFWD2下游各種底物的關鍵負調節(jié)因子（Pea3家族的ETV1、ETV4與ETV5，c-Jun）相關性。

1.8 統(tǒng)計學分析

表2示，正常食管黏膜組織有6例細胞膜表達，2例細胞質表達，8例混合表達，其余為無表達，而食管腺癌組織樣本中CEACAM1細胞膜表達33例(27.3%)，細胞質表達58例(46.8%)，其余31例為混合表達。兩組比較差異有統(tǒng)計學意義，χ2=7.567，P=0.022。

采用SPSS16.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，所得的實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析檢驗，以<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RFWD2在小鼠全腦表達譜

小鼠全腦冠狀面冷凍切片三色免疫熒光檢測表明，RFWD2 在大腦皮層與海馬區(qū)均高表達（圖1A，白箭頭），而且與突觸囊泡蛋白（SYN）具有明顯的共定位。在大腦皮層新皮質神經細胞第5 層（節(jié)細胞層），RFWD2高表達于大中型錐體細胞，樹突頂端伸到第一層（分子層）（圖1B，白箭頭）。利用Western blot檢測小鼠大腦皮層不同發(fā)育時期RFWD2與SYN蛋白的表達水平及其相關性，結果顯示RFWD2在小鼠大腦皮層中具有兩個亞型（isoform），出生后隨著個體發(fā)育高相對分子質量亞型表達量顯著降低，而低相對分子質量亞型自個體出生后開始表達，隨著個體的發(fā)育14 d后，表達量不斷增加，而且與突觸形成發(fā)育具有明顯的正相關性（圖1C）。

2.2 RFWD2在小鼠大腦皮層神經元中的表達與定位

取E16胎鼠體外培養(yǎng)大腦皮層神經元（圖2A），細胞生長狀態(tài)良好。體外培養(yǎng)至21 d（Div21），經三色免疫熒光檢測表明，RFWD2 免疫熒光在神經元胞體和樹突（圖2B、C）中均呈點狀分布。綠色熒光RFWD2斑點可與突觸后膜標記PSD95紅色斑點共定位，形成黃色斑點（圖2B，紫色箭頭），但亦有一些RFWD2 斑點與PSD95斑點緊靠在一起（圖2B，白色箭頭）。而且，綠色熒光RFWD2斑點與突觸前膜標記SYN紅色斑點共定位，形成黃色斑點（圖2C，紫色箭頭），亦有一些RFWD2斑點與SYN 斑點緊靠在一起（圖2B，白色箭頭）。RFWD2與SYN、PSD95突觸蛋白細胞內共定位表明，RFWD2在小鼠大腦皮層神經元的突觸前膜及突觸后膜均有表達。

取孕16 d小鼠胚胎大腦皮層神經元，以0.12×10/孔接種至Poly-D-lysine 包被的Coverslips 上。使用Neurobasal培養(yǎng)基（添加1% B27+A，0.25% Lglutamine，1%雙抗），體外培養(yǎng)至14～21 d，4%多聚甲醛固定后，用2%BSA、10%驢或羊血清和0.2%Triton X-100 封閉1 h 后，使用雞抗Map2、鼠抗RFWD2、兔PSD95或兔SYN進行突觸標記的免疫熒光染色，分析確定RFWD2 在體外培養(yǎng)小鼠大腦皮層神經元的共定位。

2.3 RFWD2過表達對大腦皮層神經元突觸蛋白表達的影響

用pCMV-RFWD2-Myc 過表達載體和FUGWGFP（4∶1比例）的混合物進行電轉染小鼠大腦皮層神經元，確保超過90%表達GFP的神經元含有RFWD2-Myc。RFWD2過表達可顯著降低神經元突觸蛋白的形成與數(shù)量（圖3A、B），SYN斑點數(shù)量由17.2±2.4/10 μm降低至4.5±1.2/10 μm（<0.01）；而PSD95斑點數(shù)量由8.5±1.3/10 μm降低至2.1±0.3/10 μm（<0.01，圖4C）。

2.4 RFWD2抑制表達在大腦皮層神經元突觸蛋白表達的影響

使用4%多聚甲醛灌注取成年小鼠全腦，25%蔗糖脫水處理后，采用冷凍切片機（CM1950，Leica，德國）將灌注的大腦切成12μm厚的冠狀面切片，并收集在涂有明膠的載玻片上。經2%BSA、10%驢或羊血清和0.2%Triton X-100封閉1 h后，使用鼠抗RFWD2和兔抗SYN雙重染色，在避光、室溫條件下與二抗Alexa Fluor 488（1∶500）或Cy3（1∶800）孵育1 h后，共聚焦顯微鏡掃描，CaseViewer 軟件分析RFWD2 在小鼠全腦的表達譜。

2020-057）。

60年前的蘭州市西固區(qū)，是一片荒涼之地，“地上不長草，風吹石頭跑”。老一輩“兩蘭人”硬是依靠人拉肩扛在灘涂地上建起了煉化生產企業(yè)，生產出了新中國第一批汽煤柴油和丁苯橡膠。新一代蘭州石化人牢記使命，砥礪前進，續(xù)寫了新的輝煌，實現(xiàn)了煉油化工從無到有、從小到大、由弱到強的巨變。

2.5 RFWD2在小鼠樹突棘形成中的功能效應

對照組樹突棘頭靠近樹突干，多為短粗型或蘑菇型，具有成熟樹突棘的典型特征。RFWD2-shRNA 組樹突棘密度顯著降低，而RFWD2過表達組樹突棘密度顯著增加，尤其絲狀偽足樣細長樹突棘顯著增加；與對照組相比，RFWD2抑制表達降低了樹突棘的數(shù)量，樹突棘密度由6.2±0.5/10 μm 降低至4.3±0.2/10 μm（<0.05）；和RFWD2過表達相比，RFWD2抑制表達降低了樹突棘的數(shù)量，樹突棘密度由6.9±1.1/10 μm降低至4.3±0.2/10 μm（<0.01，圖5A）。而且，RFWD2過表達可顯著增加神經樹突棘的數(shù)量，而RFWD2-shRNA降低內源性RFWD2 表達，明顯降低神經樹突棘的數(shù)量（圖5A）。對培養(yǎng)14～21 d的大腦皮層神經元用Image J進行Sholl分析發(fā)現(xiàn)，RFWD2過表達可顯著增加神經樹突的長度、分支數(shù)量及復雜性，而RFWD2抑制表達可顯著降低神經細胞樹突長度、分支數(shù)量及復雜性（圖5B）。

2.6 RFWD2影響大腦皮層神經元功能的分子機制

Western blot檢測RFWD2與下游各種底物之間的相關性，RFWD2過表達可顯著降低Pea3家族的ETV1、ETV4、ETV5與c-Jun的表達，并降低神經元突觸蛋白SYN 與PSD95的表達，而RFWD2抑制表達可顯著提升Pea3家族的ETV1、ETV4、ETV5與c-Jun的表達，并提升神經元突觸蛋白SYN與PSD95的表達（圖6A、B）。

3 討論

樹突棘是樹突分支上的棘狀突起，是神經元間形成突觸的主要部位，位于突觸后區(qū)域，其數(shù)量及形態(tài)結構的變化會導致突觸可塑性的改變，與神經系統(tǒng)發(fā)育及學習記憶功能密切相關。樹突棘數(shù)量減少及形態(tài)結構畸變是許多神經退行性疾病發(fā)病的基礎。蛋白質降解在神經系統(tǒng)發(fā)育和神經變性中具有許多關鍵功能，尤其在發(fā)育期間突觸連接的細化和突觸可塑性的記憶方面。E3泛素連接酶RFWD2作為腦神經元突觸蛋白內穩(wěn)態(tài)的一個關鍵調控因子，可調控神經元樹突棘的形成和突觸功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，RFWD2在小鼠大腦皮層與海馬區(qū)均高表達，尤其高表達于大中型錐體細胞，個體出生14 d后，表達量不斷增加，與突觸形成具有明顯的正相關性。RFWD2 與SYN、PSD95 等突觸蛋白細胞內共定位表明，既存在疊加亦有區(qū)別，因此RFWD2在小鼠大腦皮層神經元的突觸前膜及突觸后膜均有表達。RFWD2的高表達可顯著降低神經元突觸蛋白（SYN、PSD95）的形成與數(shù)量，而RFWD2的抑制表達可顯著提高神經元突觸蛋白的數(shù)量，因此，泛素化連接酶RFWD2可能通過泛素化降解，調控神經元突觸蛋白表達，從而影響神經元功能。

研究發(fā)現(xiàn)RFWD2的失活能夠導致小鼠肺分支發(fā)育缺陷。RFWD2完全缺失的小鼠在胚胎發(fā)生過程中死亡，并伴有嚴重的心血管缺陷。在神經退行性疾病阿爾茲海默癥中，RFWD2缺失會激活小膠質細胞增殖并介導神經炎癥，但其分子機制目前尚不清楚。而本研究發(fā)現(xiàn)RFWD2過表達可增加神經樹突的長度、分支數(shù)量及復雜性，而RFWD2抑制表達可明顯降低神經樹突的長度、分支數(shù)量與突觸功能，同時大量神經元死亡。另外，對照組樹突棘頭靠近樹突干，多為短粗型或蘑菇型，具有成熟樹突棘的典型特征，RFWD2-shRNA組樹突棘形態(tài)異常，樹突棘密度顯著減少，而RFWD2過表達組樹突棘密度顯著增加，但絲狀偽足樣細長樹突棘明顯增加。因此，RFWD2差異表達，引起神經元樹突棘形態(tài)和密度發(fā)生顯著變化，導致樹突棘與突觸連接的穩(wěn)定性發(fā)生變化，從而影響大腦皮層和海馬等腦區(qū)突觸可塑性的基礎。

RFWD2敲除小鼠能夠顯著提高ETV1、ETV5與c-Jun 的表達，而過表達的ETV1、ETV5 與c-Jun 又導致RFWD2敲除小鼠死亡。翻譯后c-Jun的調節(jié)對神經發(fā)生至關重要，因為從神經干細胞中c-Jun的提高會降低細胞存活率。在此基礎上，本研究表明RFWD2抑制表達可顯著提升Pea3家族的ETV1、ETV4、ETV5與c-Jun的表達，并提升神經元突觸蛋白SYN的表達，但會導致神經元樹突長度、分支數(shù)量與復雜性降低，樹突棘密度降低，阻斷神經元許多功能通路之間的連接，導致突觸功能障礙，從而導致神經元死亡。

因此，本研究表明RFWD2能夠通過調節(jié)Pea3家族的ETV1、ETV4、ETV5與c-Jun的泛素化修飾，調控小鼠大腦皮層神經元樹突發(fā)育、樹突棘形成與突觸功能效應，為深入研究神經精神疾病的發(fā)生、發(fā)展機理及治療提供一個高效的作用靶點。