子宮內膜異位癥（EMS）簡稱內異癥，是一種功能性子宮內膜上皮組織以及腺體組織出現(xiàn)在宮腔以外部位的疾病。內異癥在育齡女性中的發(fā)病率約為10%，其中有30%～50%的內異癥患者會出現(xiàn)疼痛（痛經、慢性盆腔痛等）與不孕的癥狀，給患者帶來巨大的生理與心理壓力，是危害育齡女性身心健康的重要疾病。由于內異癥的發(fā)生機制十分復雜，至今尚未徹底闡明，導致臨床針對內異癥的治療手段有限。因此，進一步深入研究影響內異癥發(fā)生與進展的分子及其作用機制具有重要的意義。

既往研究表明，內異癥患者異位病灶內膜組織來源細胞與正常在位內膜組織來源細胞之間存在顯著差異。子宮內膜基質細胞作為內膜組織最主要的細胞組成之一，其功能的異常與內異癥的發(fā)生密切相關。有研究顯示，異位病灶來源子宮內膜基質細胞的增殖、遷移與侵襲能力與正常子宮內膜的基質細胞相比顯著增強。既往研究顯示，異位病灶中內膜基質細胞功能的改變受到病灶微環(huán)境的調控，異位內膜中異常表達的生長因子EGF以及長鏈非編碼RNA均參與內異癥內膜基質細胞侵襲能力的調控。然而，異位病灶微環(huán)境中調控內異癥內膜基質細胞功能改變的分子網絡十分復雜，亟待進一步研究。

我又請學生看文章的第9自然段：“整整十三年零五個月過去了……滿園的創(chuàng)傷使我的心仿佛又給放在油鍋里熬煎?！比缓髥枌W生這一段中“滿園的創(chuàng)傷”表現(xiàn)在哪里，從而引導學生體會原來是非常美好的一個院子，現(xiàn)在變成了“無縫的墻”，這里的墻不僅指的是實體的墻，還指人與人之間關系的隔膜。“文革”不只是對經濟的破壞，也是對人精神的戕害，這種災難不僅是經濟的衰敗，是社會的衰敗，更是人心的衰敗。所以，這“滿園的創(chuàng)傷”不僅是說這個小環(huán)境的改變，更是為了表明大環(huán)境的改變，這也正是巴金寫這篇文章及《隨想錄》的真正背景。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)CCN蛋白家族在眾多生理過程與病理過程中均發(fā)揮關鍵作用。CCN5是CCN蛋白家族的重要組成之一，其在細胞增殖、腫瘤的侵襲與轉移過程中發(fā)揮關鍵作用。既往有研究表明CCN5參與子宮肌瘤進展的調控，提示CCN5在女性生殖系統(tǒng)疾病中可能發(fā)揮重要作用。鑒于內異癥內膜基質細胞在增殖、遷移及侵襲上表現(xiàn)出類似腫瘤細胞的特性，是否CCN5在其中發(fā)揮調控作用未見相關報道。因此，本文將通過比較卵巢內異癥組織與正常在位內膜中CCN5的表達水平，研究過表達或敲低CCN5對子宮內膜基質細胞增殖、遷移、侵襲及上皮-間充質轉化的影響，初步揭示CCN5對子宮內膜基質細胞功能的調控作用及其機制，以期為今后臨床干預內異癥異位病灶侵襲提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 20例卵巢子宮內膜異位癥標本取自2020年1月～2020年4月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產科住院并行腹腔鏡手術患者（年齡23～37 歲，平均年齡=30.70±3.72歲），患者月經周期規(guī)律，標本均經過術后病理證實為子宮內膜異位癥組織。15例正常對照在位內膜組織取自南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產科生殖中心因男方因素行IVF-ET助孕治療的女性（年齡22～34歲，平均年齡=28.20±3.02歲），排除子宮內膜異位癥的診斷，月經周期規(guī)律。卵巢子宮內膜異位癥患者排除術前3月應用促性激素釋放激素激動劑（GnRHa）或其它激素類藥物。排除患有多囊卵巢綜合征以及其他原因導致的慢性無排卵患者；排除患有輸卵管積水的患者；排除患有慢性疾病（如糖尿病、其他內分泌疾病、心血管疾病、血脂異常）患者；排除患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及其他風濕疾病的患者；排除HIV以及其他活動性感染的患者。本研究經南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院倫理委員會批準，符合倫理學標準（NFEC-2017-055）；所有受試對象均由專業(yè)人員詳細告知研究內容并自愿參加，同時簽署知情同意書。

1.1.2 細胞株 腺病毒人子宮內膜基質細胞由廈門大學王海濱教授饋贈。腺病毒（吉瑪生物），genOFF h-CCN5、對照siRNA片段（廣州銳博生物公司）。

RT-qPCR 方法檢測CCN5 在20 例實驗組卵巢子宮內膜異位組織與15 例正常對照組在位內膜中的mRNA表達水平。RT-qPCR實驗結果顯示，實驗組中的表達水平較對照組顯著降低（圖1A，<0.01）；進一步采用Western blot 檢測CCN5 在卵巢子宮內膜異位組織及對照組在體內膜中的蛋白水平，研究結果同樣顯示，CCN5在實驗組中的表達水平顯著降低（圖1B，<0.01）。

1.2 方法

采用腺病毒轉染構建CCN5 過表達的HESCs 細胞，RT-qPCR 與Western blot 方法檢測腺病毒轉染HESCs中CCN5基因和蛋白的表達水平。實驗結果顯示：腺病毒轉染后的HESCs中CCN5基因的表達水平顯著升高（圖2A，<0.01）；Western blot實驗進一步證實腺病毒轉染后HESCs中CCN5蛋白表達水平也顯著升高（圖2B，<0.01）。證實腺病毒在HESCs中轉染成功并過表達CCN5基因。CCK8實驗檢測過表達CCN5基因對HESCs增殖的影響，結果顯示：過表達CCN5可以抑制HESCs增殖能力（圖2C，<0.01）。劃痕實驗觀察過表達CCN5 基因對HESCs 遷移的影響，結果表明：HESCs 中過表達CCN5 后，其細胞遷移能力受到明顯抑制，在24 h 時間點處差異存在統(tǒng)計學意義（圖2D，<0.01）。Transwell小室侵襲實驗觀察過表達CCN5基因對HESCs侵襲的影響，結果顯示HESCs中過表達CCN5后，HESCs的細胞侵襲能力顯著降低（圖2E，<0.01）。Western blot 方法檢測CCN5 過表達的HESCs與對照組EMT 相關標記物的表達水平，結果顯示：CCN5過表達后HESCs中上皮細胞標記物E-cadherin表達顯著升高，間充質細胞標記物N-cadherin、Snail 以及Vimentin的表達降低（圖3D，<0.01）。

在研究CCN5過表達對HESCs體外生物學影響的實驗中，載有CCN5編碼基因的慢病毒感染細胞為實驗組，縮寫為CCN5組，對照組為空載體慢病毒感染細胞，縮寫Vecor組；在探究沉默CCN5的實驗中，轉染針對CCN5的siRNA片段組為實驗組，縮寫為si-CCN5組，轉染無意序列的siRNA片段為對照組，縮寫si-Control組。每次進行統(tǒng)計分析的實驗都設3復孔，且重復3次；所得數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本檢驗，多組間計量資料比較采用單因素方差分析。<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

EMT過程與內異癥異位細胞遷移、侵襲過程密切相關，我們采用Western blot實驗檢測過表達CCN5對HESCs細胞EMT經典標記物表達水平的影響。過表達CCN5 的HESCs 中，EMT 過程中上皮細胞標記物Ecadherin的表達水平顯著升高，而N-cadheirn、Snail-1以及Vimentin的表達水平顯著降低，結果差異具有統(tǒng)計學意義（<0.01，圖3A、B）。

1.2.6 Western blot實驗 細胞總蛋白提取采用全蛋白提取試劑盒，按照試劑盒的說明書提取細胞蛋白；蛋白定量采用BCA蛋白定量試劑盒，按試劑盒說明書操作。

由于水庫碾壓混凝土澆筑量較大，因此以自卸汽車入倉方式為佳。在本項目中，所有的碾壓混凝土均通過自卸汽車的方式完成入倉。在入倉前，為保持澆筑面清潔，避免雜質干擾，應對汽車表面進行充分的清潔，配備長達100m的脫水路段，此外還應建有路面排水溝，防止污水流入倉內。

1.2.4 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 預先鋪好基質膠，取Ad-CCN5，vector，si-CCN5，si-Control組細胞，用無血清培養(yǎng)基分別重懸5×10個不同處理組細胞接種在小室上層；下室中加入700 μL全培，放置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每處理組分別設置3個復孔。培養(yǎng)36 h后取出小室，吸取小室培養(yǎng)基，用棉簽輕柔擦拭小室內面，然后結晶紫染色15 min，輕柔洗滌后再顯微鏡下進行計數(shù)。

圖5是動態(tài)實驗前后泡沫鋁試件的對比圖，可見泡沫鋁在直接沖擊下，沖擊端的直徑會略微有所膨脹，但是由于實驗中試件尺寸略小于輸入桿的直徑，故而動能均以軸向變形消耗為主，橫向效應可以忽略不計。沖擊端呈現(xiàn)壓潰的情形，而沖擊波未到達的區(qū)域并未發(fā)生明顯變形。需要說明的是試件撞擊之前的直徑略小于輸出桿的直徑，撞擊過程中的微小膨脹依然是在輸入桿的容許范圍內，故而認為輸入桿測量的應力數(shù)據(jù)是真實可靠的。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取不同處理后的HESCs細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，使用全培重懸細胞，接種5×10細胞在6孔板中，置于37 ℃、5%CO的培養(yǎng)箱中進行孵育培養(yǎng)。細胞會合成90%左右時，換液并采用絲裂霉素處理1 h。用已消毒的10 μL微量移液頭在6孔板上垂直劃過，PBS洗滌3次，加入無血清培養(yǎng)基，0 h、24 h時間點分別在倒置顯微鏡下觀察細胞情況并拍照。

1.2.3 細胞增殖能力檢測 利用CCK-8實驗檢測CCN5對HESCs 增值能力的影響。將經過不同處理后的HESCs消化、計數(shù)，鋪板于96孔板，每孔接種約1×10細胞。然后放置于37 ℃、5%CO濃度培養(yǎng)箱6 h；接下來在0 h時間點孔加入10 μL CCK-8溶液，放置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1.5 h，用酶標儀測定；接下來在24 h、48 h培養(yǎng)時間點重復上述操作，用酶標儀測定相關時間點孔的。

3．在具體問題上，與日本一樣，中國對明治文學大家夏目漱石、森鷗外的關注度都很高。不同的是，中國對日本政治小說(截至2018年8月，搜索日本JAIRO可得33件，CINII160件，中國知網573件)和《不如歸》(日本JAIRO可得12件，CINII66件，中國知網51件)的研究在數(shù)量上超過日本，尤其是政治小說。這隱約可見中國文以載道的傳統(tǒng)文學觀的影響，而對《不如歸》的關注，很大原因在于該小說的甲午戰(zhàn)爭背景。

1.2.7 RT-qPCR實驗 按照RNA提取試劑盒的說明書提取HESCs細胞的總RNA，并對提取出的RNA進行濃度測定，標記好存放于-80 ℃保存。依據(jù)Takara逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，采用SYBR Green法作為實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）的擴增和定量的方式，按Takara的產品說明書執(zhí)行操作。以GAPDH作為內參，采用2計算目的基因的相對表達量。

1.3 實驗分組與統(tǒng)計學方法

1.2.2 腺病毒與小干擾RNA轉染 取處于對數(shù)生長期的HESCs鋪板培養(yǎng)（24孔板，5×10/孔）檢測病毒滴度。確定好腺病毒滴度后，培養(yǎng)HESCs至40%左右密度，添加Polybrene穿孔素（4 μL/500 μL培養(yǎng)基），根據(jù)測得的腺病毒滴度處理HESCs，處理6～8 h后更換為無血清無雙抗無酚紅DMEM培養(yǎng)基。針對CCN5的小分子干擾RNA（siRNA）以及對照siRNA 均采用Lipofectamine 3000脂質體轉染系統(tǒng)，操作均按照試劑說明書操作。

實驗按照一位數(shù)加一位數(shù)、一位數(shù)加兩位數(shù)、一位數(shù)加三位數(shù)……依次進行．主試以每隔0.8~1秒讀一個數(shù)字的速度進行口述，被試在一組中回答正確題目達到3，則該組測試完成，進入下一組測試；若在一組測試中答對正確題數(shù)未能達到3，則認為未能完成該組測試，測試結束．將被試在所完成的最后一組測試中，測試題加數(shù)和被加數(shù)的位數(shù)之和，作為被試不進位加法的口算廣度．而對每組中3次正確測試的時間（以秒為單位）進行計算，將均值和標準差，作為被試在每組的口算速度．每套口算測試題測試結束后，測試對象有3分鐘的休息時間，再進行下一套測試．

2 結果

2.1 CCN5在卵巢子宮內膜異位癥組織中的表達情況

1.1.3 主要實驗試劑 無酚紅DMEM 高糖培養(yǎng)基（DMEM/F12，Thermo），碳吸附胎牛血清（CS-FBS，PAN），丙酮酸鈉（Sigma），胰島素-轉鐵蛋白-硒（Gibco），嘌呤霉素（Sigma），碳酸氫鈉、葡萄糖（索萊寶）；Lipofectamine 2000（Invitrogen），Western blot相關實驗試劑以及細胞裂解液（Thermo），RNA 提取試劑盒（Takara），RT-PCR 試劑盒和SYBR GreenⅠ（TaKaRa）；鼠抗人CCN5、E-cadherin、N-cadherin、Snail-1、Vimentin 和β-actin 抗體（CST）；PVDF 膜和化學發(fā)光HRP 底物（Millipore）；胰蛋白酶和羊抗鼠二抗（Proteintech）；引物由廣州銳博生物公司設計及購買。

2.2 過表達CCN5對HESCs的增殖、遷移和侵襲能力的影響

1.2.1 細胞培養(yǎng)HESC細胞的培養(yǎng)體系是 10%碳吸附胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素、3.1 g/L葡萄糖+1 mmol/L丙酮酸鈉+1.5 g/L碳酸氫鈉+1%胰島素-轉鐵蛋白-硒+500 ng/mL嘌呤霉素，在37 ℃、5%CO的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至70%左右時，采用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代及繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 過表達CCN5對HESCs中EMT標記物表達的影響

近年來，在國家教育部門發(fā)布的中明確要求，對職業(yè)教育領域探索混合所有制提出了明確的要求。在校企共建產業(yè)學院時，在產權配置結構上，應盡量吸納不同股東進行多方面入股：隨著混合所有制實踐在職業(yè)教育領域的不斷推進，相關制度不斷完善，逐步承認混合所有制二級產業(yè)學院法人地位，必將會使得校企共建產業(yè)學院模式向外推廣，得到重視，極大程度改善政府辦學經費投入不足的問題。

2.4 敲低HESCs中CCN5對HESCs的增殖、遷移和侵襲能力的影響

為了進一步確定CCN5對HESCs細胞功能的調控作用，利用si-RNA 技術敲低HESCs中CCN5的表達，并用RT-qPCR技術檢測si-CCN5的效率。結果顯示：轉染si-CCN5的HESCs中CCN5基因的表達水平較對照組顯著降低（圖4A，<0.01）。采用Western blot方法檢測轉染si-CCN5后HESCs細胞中CCN5蛋白的表達水平，結果顯示CCN5蛋白的表達水平較對照組顯著降低，證明轉染si-CCN5成功且發(fā)揮敲低HESCs中CCN5蛋白表達的作用（圖4B，<0.01）。我們采用CCK-8實驗檢測si-CCN5敲低HESCs中CCN5表達后的細胞增殖能力，并與si-Control組HESC細胞的細胞增殖能力進行比較，實驗結果顯示：敲低CCN5后HESCs的細胞增殖能力較si-Control組顯著增強，差異具有統(tǒng)計學意義（圖4C，<0.01）。劃痕實驗觀察敲低CCN5后對HESCs細胞遷移能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)在24 h時間點si-CCN5組HESCs細胞遷移能力較si-Control組顯著增強，差異具有統(tǒng)計學意義（圖4D，<0.01）。我們采用Transwell小室實驗檢測敲低CCN5后HESCs細胞的侵襲能力，結果顯示HESCs細胞侵襲的能力較si-Control組顯著增強（圖4E，<0.01）。

2.5 敲低CCN5對HESCs中EMT標記物表達的影響

采用Western blot 方法檢測敲低CCN5 后HESCs細胞中EMT經典標記物E-cadherin、N-cadherin、Snail-1及Vimentin 的表達情況，實驗結果顯示：與si-Control組相比較，si-CCN5 組中HESCs 上皮細胞標記物Ecadherin表達顯著降低，間充質細胞標記物N-cadherin、Snail-1及Vimentin的表達顯著升高（圖5A、B，<0.01）。

3 討論

子宮內膜異位癥是一種具有惡性行為的良性婦科疾病，藥物和手術治療后易復發(fā)，嚴重影響育齡期婦女的生殖健康，常導致女性不孕癥的發(fā)生。子宮內膜異位癥異位病灶子宮內膜基質細胞遷移、侵襲能力增強，與子宮內膜異位癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，然而調控異位子宮內膜基質細胞遷移和侵襲能力的機制仍未完全闡明。本次研究發(fā)現(xiàn)卵巢子宮內膜異位病灶中CCN5的表達顯著降低，過表達人子宮內膜基質細胞中的CCN5可以顯著抑制人子宮內膜基質細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并且抑制人子宮內膜基質細胞的EMT轉化；相反，敲低人子宮內膜基質細胞中的CCN5表達后，子宮內膜基質細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著提高，促進子宮內膜基質細胞的EMT轉化。以上結果提示，CCN5可能通過影響細胞EMT，影響人子宮內膜基質細胞的遷移、侵襲能力，在子宮內膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

CCN5是CCN家族蛋白中的一員，其作為腫瘤抑制基因一直倍受關注。過表達乳腺癌細胞中的CCN5后可以顯著抑制乳腺癌細胞的增殖與侵襲能力；CCN5在抑制口腔癌細胞增殖與侵襲過程中發(fā)揮重要作用，它不僅參與腫瘤的增殖、侵襲和轉移過程，并在纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮關鍵作用。CCN5在人體子宮組織中也有表達并參與子宮平滑肌細胞增殖的調控，過表達CCN5后可以抑制子宮肌瘤的進展。鑒于子宮內膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展與異位內膜具有腫瘤細胞的特性密切相關，且已證實CCN5可調控腫瘤組織細胞的生物學特性，那么CCN5是否在異位子宮內膜中組織中表達且其對子宮內膜基質細胞的增殖、遷移與侵襲能力等特性有何影響，相關研究報道至今未見。為此，本研究收集并檢測卵巢子宮內膜異位癥組織與正常在位子宮內膜組織中CCN5的表達情況，結果證實CCN5在卵巢子宮內膜異位癥組織中的表達水平顯著低于正常在位子宮內膜組織，提示CCN5可能參與卵巢子宮內膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展。

CCN5在腫瘤細胞的生物學功能調控中發(fā)揮重要作用，是否也同樣參與子宮內膜基質細胞功能的調控？本研究通過腺病毒轉染HESCs 過表達CCN5 后，HESCs細胞活性和增殖能力被顯著抑制；其細胞遷移與侵襲能力也受到明顯抑制。反之，si-RNA 敲低HESCs中CCN5表達后，其增殖能力明顯增強，細胞遷移與侵襲能力也顯著上調。上述實驗結果表明，CCN5在HESCs的增殖、遷移和侵襲功能調控過程中發(fā)揮重要作用，提示CCN5可能作為一個潛在干預靶點在抑制內異癥異位病灶的侵襲與進展中具有一定的價值，值得進一步研究。

EMT是指上皮細胞原有的上皮極性和細胞間連接逐漸消失，同時細胞的遷移和侵襲能力顯著增強。體外研究發(fā)現(xiàn)，子宮內膜基質細胞EMT增強后，可以顯著提高基質細胞遷移與侵襲的能力。進一步研究顯示子宮內膜異位癥病灶中內膜上皮細胞與基質細胞均發(fā)生明顯的EMT轉化，導致異位內膜細胞遷移與侵襲能力顯著增強，促進內異癥的發(fā)生與發(fā)展，由此可見EMT在子宮內膜異位癥發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，是介導異位組織HESCs細胞遷移、侵襲能力顯著增強的重要機制。參與調控內異癥內膜基質細胞發(fā)生EMT的機制十分復雜，既往研究發(fā)現(xiàn)EMS患者異位病灶升高的hsa_circ_0008433通過促進基質細胞的EMT進而增強異位組織的侵襲能力；LncRNA-CDKN2B-AS1在EMS患者異位病灶中的表達升高，且過表達HESCs中CDKN2B-AS1 可以顯著促進HESCs 發(fā)生EMT轉化。然而是否在EMS 異位病灶中表達顯著降低的CCN5也參與內膜基質細胞EMT轉化的調控尚未見相關報道。本研究發(fā)現(xiàn)在過表達CCN5后，HESCs中與間質細胞相關的標記物N-cadherin，Snail-1 和Vimentin的表達水平顯著低于對照組，與上皮細胞相關的標記物E-cadherin的表達水平明顯升高，提示過表達CCN5可以顯著抑制HESCs 的EMT；相反，當敲低CCN5 表達后，HESCs 中與間質細胞相關的標記物N-cadherin，Snail-1和Vimentin的表達水平顯著升高，與上皮細胞相關的標記物E-cadherin 的表達水平明顯降低，表明CCN5 表達水平的降低可以顯著促進HESCs 發(fā)生EMT。以上實驗結果說明CCN5的表達可影響子宮內膜基質細胞EMT相關標記分子的表達，進而參與子宮內膜基質細胞EMT的調控，介導子宮內膜基質細胞遷移與侵襲能力的調控。

大源園林生態(tài)園是諸城市工商資本參與林業(yè)發(fā)展的一個縮影。今年，諸城市發(fā)揮財政資金引導作用，撬動工商資本參與林業(yè)發(fā)展，推動農村產業(yè)振興、生態(tài)振興。今年財政已投入6100萬元，吸引50多家工商企業(yè)投資林業(yè)項目，帶動社會資本5.7億元。華欣鑄造、金盛園地產、大源園林、萬興集團、東方園藝等企業(yè)建設特色經濟林園區(qū)，新種植榛子、矮化蘋果、大櫻桃、優(yōu)質板栗、核桃等1.5萬畝，帶動2萬農戶發(fā)展經濟林。

綜上，本研究結果表明卵巢子宮內膜異位癥組織中CCN5的表達水平顯著降低，并發(fā)現(xiàn)CCN5可以調控子宮內膜基質細胞的增殖及抑制其遷移侵襲的能力，并影響內膜基質細胞的EMT轉化，提示CCN5異常降低可能是參與子宮內膜異位癥發(fā)生與發(fā)展的重要機制之一，CCN5可能有望成為干預子宮內膜異位癥異位病灶侵襲與進展的潛在靶標，值得進一步深入研究。