自閉癥（ASD）是一種先天性疾病，其病因與大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙密切相關(guān)。ASD核心癥狀有興趣狹窄、重復(fù)刻板行為以及社會(huì)交往交流障礙。在中國(guó)6～12歲的兒童中，ASD患病率約為0.7%。

前額葉皮層（PFC）是信息處理、記憶控制、情感認(rèn)知和情緒調(diào)控的中心。PFC異常與ASD核心癥狀的發(fā)生密切相關(guān)。產(chǎn)前VPA 暴露的嚙齒動(dòng)物常被用于ASD模型的研究。

樹(shù)突棘是興奮性突觸的傳遞位點(diǎn)，能夠接收信息并形成突觸聯(lián)系，被認(rèn)為是突觸可塑性的基礎(chǔ)。研究報(bào)道，VPA誘導(dǎo)的ASD小鼠PFC樹(shù)突棘總密度降低，但不同類型樹(shù)突棘密度的變化及其具體的調(diào)控機(jī)制，目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在單一全身性癲癇發(fā)作的大鼠模型中，樹(shù)突棘的變化與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路過(guò)度激活相關(guān)。在VPA誘導(dǎo)的ASD模型小鼠中，PFC樹(shù)突棘發(fā)育障礙是否與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的變化相關(guān)，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。突觸后密度蛋白95（PSD95）和突觸素（Syn）與突觸可塑性相關(guān)，Syn缺失的小鼠會(huì)出現(xiàn)ASD樣表型。基于此，我們通過(guò)改良方式建立VPA誘導(dǎo)的ASD小鼠模型，探討PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及PSD95、Syn異常，是否導(dǎo)致小鼠PFC樹(shù)突棘及突觸發(fā)育障礙，并誘發(fā)小鼠出現(xiàn)ASD樣表型。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

丙戊酸鈉（VPA），DMSO（Sigma）；明膠（BioFroxx）；OCT組織包埋劑（Sakura Finetek）；高爾基染色試劑盒（Hitobiotec）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（康為）；脫脂奶粉（博士德）；山羊抗兔IgG（碧云天），PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore）；Wortmannin，p-PI3K，PI3K，AKT，p-mTOR，mTOR，PSD95 和Syn 抗體（CST）；p-Syn 抗體（Abcam）；p-Syn抗體（Bioss）；β-actin抗體，p-AKT（Affinity）。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，零零后高職新生總體狀況良好，總分正常的人數(shù)為1 509人，占比64%，總分中等以上的比例為96.4%。總分為極高和較高的人數(shù)為85人，占比為3.6%。差異性分析結(jié)果顯示人格特質(zhì)和社會(huì)支持得分在性別上差異顯著?？偡旨案鞣譁y(cè)驗(yàn)得分狀況見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

將小鼠過(guò)量麻醉處死，取完整腦組織。將小鼠腦組織浸泡在5倍體積的高爾基溶液1、2的混合液中，室溫避光放置。靜置12～24 h后，更換等量混合液，室溫避光放置。靜置14 d后，更換等量溶液3并且避光放入4 ℃冰箱。靜置12 h 后，再次更換等量溶液3，4 ℃避光放置。靜置48～72 h，用濾紙吸干多余溶液，將腦組織置于-80 ℃保存。冰凍切片機(jī)切片，厚度為100 μm，晾干后進(jìn)行高爾基染色處理。

1.3 動(dòng)物模型建立及分組

成年C57小鼠按雄鼠：雌鼠=1∶2的比例合籠過(guò)夜，次日8～9點(diǎn)，查看合籠雌鼠受精情況。若肉眼見(jiàn)陰栓，陰道涂片見(jiàn)精子，則該雌鼠視為受精成功，當(dāng)天記錄為孕0.5 d。將孕鼠隨機(jī)分為2組，于孕10 d、12 d分別注射0.9%的生理鹽水或VPA，其子代雄鼠分別作為CON組（10只），VPA組（10只），VPA+DMSO組（10只）和VPA+Wortmannin（10只）。其中CON組和VPA組不做處理；VPA+Wortmannin組小鼠腦立體定位注射0.1 mmol/L Wortmannin；VPA+DMSO組小鼠腦立體定位注射等量5%DMSO作溶劑對(duì)照。

1.4 腦立體定位注射

將5周齡VPA小鼠進(jìn)行腦立體定位注射。小鼠吸入式麻醉，腦立體定位儀固定，去除毛發(fā)，碘伏消毒皮膚，做中線切口，3%過(guò)氧化氫清潔顱骨，以Bregma為原點(diǎn)，根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜確定PFC坐標(biāo)（AP=-2.68，ML=±1.0，DV=-1.5），顱骨鉆暴露腦組織，微量注射器注射DMSO溶液或Wortmannin溶液，單側(cè)單次劑量為1 μL，藥物注射速度為0.1 μL/min。注射完成后，清潔消毒，縫合皮膚，術(shù)后保溫。

1.5 行為學(xué)測(cè)試

2.1.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 與CON組相比，VPA組小鼠自我捋毛時(shí)間增加（<0.001），跨中央格減少（<0.05）。與VPA組相比，Wortmannin組小鼠自我捋毛時(shí)間減少（<0.05），跨中央格增加（<0.05）。表明VPA組小鼠具有ASD樣重復(fù)刻板行為和焦慮行為，Wortmannin能改善ASD小鼠重復(fù)刻板行為和焦慮行為。4組小鼠跨總格數(shù)、直立和攀墻次數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.05），各組小鼠運(yùn)動(dòng)功能良好，對(duì)陌生環(huán)境的垂直探索能力無(wú)明顯差異（圖1）。

將麻醉后的小鼠依次灌注0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛，取腦組織，蔗糖梯度脫水。冰凍切片機(jī)切片，厚度為15 μm。PBS 漂洗3 次，5 min/次，0.3%Triton X-100破膜1 h，PBS漂洗3次，5 min/次，羊血清封閉37 ℃孵育1 h，分別加入一抗PSD95（1：500，CST），p-Syn（1∶300，Bioss），4 ℃孵育過(guò)夜。次日，PBS 漂洗3 次，5 min/次，分別避光加入熒光二抗驢抗兔555（1∶200），羊抗兔488（1∶300），37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次。加入DPAI，室溫孵育5 min，抗熒光衰減封片液封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.5.3 三箱社交實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)裝置為亞克力玻璃，長(zhǎng)120 cm，寬20 cm，高22 cm，裝置左右兩腔各放置一個(gè)空籠子：（1）適應(yīng)階段：放入受檢測(cè)小鼠自由運(yùn)動(dòng)10 min；（2）社交互動(dòng)測(cè)試階段：將左腔的空籠子里放入一只陌生小鼠1（Stanger 1）。重新放入受檢測(cè)小鼠，并記錄10 min內(nèi)受檢測(cè)小鼠停留在各個(gè)箱體的時(shí)長(zhǎng)，與Stanger 1的交流時(shí)長(zhǎng)，與空籠子（Object）的接觸時(shí)長(zhǎng)；（3）社交偏好測(cè)試階段，將右腔的空籠子放入另一只陌生小鼠2（Stanger 2）。重新放入受試小鼠，并記錄10 min內(nèi)受試小鼠的社交偏好情況。

4組小鼠樹(shù)突棘分類示意圖（圖4A）。與CON組相比，VPA組小鼠PFC樹(shù)突棘總密度（<0.01），成熟型蘑菇狀（<0.001）和粗短狀（<0.05）樹(shù)突棘密度均減少；不成熟型絲狀樹(shù)突棘密度增加（<0.01）。與VPA組相比，Wortmannin組小鼠PFC樹(shù)突棘總密度（<0.01），成熟型蘑菇狀（<0.001）樹(shù)突棘密度均增加；不成熟型絲狀樹(shù)突棘密度減少（<0.01，圖4B～E）。

1.6 高爾基染色

本次實(shí)驗(yàn)所用的C57BL/6J小鼠，均購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SYXG（渝）2018-0003。飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)濕度約為55%，溫度約為23 ℃，環(huán)境安靜，遵循晝夜節(jié)律，小鼠能夠自由飲食飲水。本研究涉及到的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，均通過(guò)了重慶市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的倫理審查。

1.7 Western blot檢測(cè)

將麻醉后小鼠灌注0.9%生理鹽水，取腦組織分離PFC。稱重，加入蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解液，研磨PFC組織，靜置、離心、收集上清液并進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。將蛋白樣品濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，熱變性，凍存于-20 ℃?zhèn)溆?。將配平的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行恒壓電泳，恒流電轉(zhuǎn)于PVDF 膜，使用5%的脫脂奶粉溶液封閉，加入對(duì)應(yīng)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST漂洗3次，10 min/次，加入二抗，37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次，10 min/次，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光以及曝光。

1.8 免疫熒光染色

1.5.2 青年玩耍實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)裝置為亞克力玻璃，長(zhǎng)60 cm，寬60 cm，高40 cm，裝置內(nèi)有1 cm 厚墊料：（1）適應(yīng)階段：放入受檢測(cè)小鼠自由運(yùn)動(dòng)10 min；（2）測(cè)試階段：重新放入該小鼠和一只陌生互動(dòng)小鼠（以下行為學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的陌生鼠，均為與受檢測(cè)小鼠同齡同性別異籠飼養(yǎng)的C57小鼠）。記錄受檢測(cè)小鼠10 min內(nèi)的挖掘時(shí)長(zhǎng)，與陌生小鼠的互動(dòng)時(shí)長(zhǎng)。

采用直升導(dǎo)管法在泥漿中澆筑混凝土防滲墻，并配備3臺(tái)專用的自制懸臂式導(dǎo)管提升架，導(dǎo)管布置和整個(gè)混凝土澆筑施工過(guò)程必須嚴(yán)格按照設(shè)計(jì)要求和相關(guān)規(guī)范規(guī)定一次性完成。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.1.2 青年玩耍實(shí)驗(yàn) 與CON組相比，VPA組小鼠社交時(shí)間減少（<0.001）。與VPA組相比，Wortmannin組小鼠社交時(shí)間增加（<0.05，圖2B）。表明VPA組小鼠社交互動(dòng)能力下降，Wortmannin能改善ASD小鼠社交缺陷。四組小鼠挖掘時(shí)間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.05，圖2C），表明四組小鼠對(duì)陌生環(huán)境的探索能力無(wú)明顯差異。

2 結(jié)果

2.1 ASD樣行為學(xué)檢測(cè)

1.5.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)裝置為亞克力玻璃，長(zhǎng)60 cm，寬60 cm，高40 cm。裝置底部按比例劃分為16個(gè)等大的方格，中間4個(gè)方格視為中央格，周圍12個(gè)方格視為周圍格：（1）適應(yīng)階段：放入受檢測(cè)小鼠自由運(yùn)動(dòng)10 min；（2）測(cè)試階段：重新放入該小鼠，記錄該小鼠在10 min內(nèi)的捋毛時(shí)長(zhǎng)、跨中央格次數(shù)、跨總格次數(shù)、攀墻次數(shù)、站立次數(shù)。

此外，魏金枝還參與了理發(fā)業(yè)工人的罷工運(yùn)動(dòng)。1921年5月，杭州280多家理發(fā)店的1000隊(duì)名理發(fā)工人，為反對(duì)資本家的剝削和壓迫，舉行了聯(lián)合罷工，時(shí)間一星期，魏金枝和浙江一師的其他師生一起，應(yīng)工人們的要求，協(xié)助起草請(qǐng)?jiān)笗?shū)，并參加向省政府請(qǐng)?jiān)傅幕顒?dòng)。最后罷工取得了勝利，資本家被迫增加工資，改善工人待遇。毋庸置疑，在“五四”運(yùn)動(dòng)期間，魏金枝是以滿腔的熱情投入到了工人運(yùn)動(dòng)中，為浙江工人運(yùn)動(dòng)做出了自己的貢獻(xiàn)。

使用GraphPad Prim 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理繪圖，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.3 三箱社交實(shí)驗(yàn)社交測(cè)試 與CON組相比，VPA組小鼠在A箱停留時(shí)間減少（0.01），在B箱停留時(shí)間增加（0.05），與陌生鼠1交流時(shí)間減少（0.01），與物體接觸時(shí)間增加（0.01），VPA組小鼠社交互動(dòng)能力下降。與VPA組相比，Wortmannin組小鼠在B箱停留時(shí)間減少（0.05），與物體接觸時(shí)間減少（0.05，圖3C），表明Wortmannin能改善ASD小鼠社交互動(dòng)缺陷。三箱社交實(shí)驗(yàn)社交偏好測(cè)試階段中，與CON組相比，VPA組小鼠與陌生鼠1交流時(shí)間增加（0.05）。與VPA組相比，Wortmannin組小鼠與陌生鼠1交流時(shí)間減少（0.05，圖3D）。VPA組小鼠喜歡與熟悉事物接觸，不喜歡與新鮮事物接觸，即社交偏好能力障礙，Wortmannin能改善ASD小鼠社交偏好障礙。

2.2 小鼠PFC樹(shù)突棘發(fā)育情況

以碳酸鹽為主的礦床主要包含鈣質(zhì)碳酸鹽型礦床和鎂質(zhì)碳酸鹽型礦床，一般礦物成分為方解石、石灰石和白云石等，同時(shí)還含有黏土礦物。這類礦床的地質(zhì)成因一般為熱液碳酸鹽型、膠體沉積型和生物化學(xué)沉積碳酸鹽型的礦床。在我國(guó)廣西、湖南和廣東三省碳酸鹽巖地區(qū)，金屬硫化物礦山經(jīng)選別排出的尾礦分為四類：(1)方解石型尾礦, 如車河和黃沙坪選礦廠排出的尾礦 ;(2)白云石型尾礦, 如泗頂和古丹選礦廠排出的尾礦;(3)白云石-方解石混合型尾礦,如凡口選礦廠排出的尾礦;(4)鐵白云石型尾礦, 如老廠選礦廠排出的尾礦[12]。

第四，在林政資源管理過(guò)程中要構(gòu)建一支高素質(zhì)、強(qiáng)能力的復(fù)合型隊(duì)伍，相關(guān)部門(mén)要充分發(fā)揮自身的管理作用，對(duì)現(xiàn)有的林政資源管理人員加以培訓(xùn)教育，如講座、進(jìn)修、考核等，確保相關(guān)人員在專業(yè)化角度提高自身的造林、護(hù)林、用林的水平，實(shí)現(xiàn)真正意義上的生態(tài)建設(shè)。

2.3 小鼠PFC中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與CON組相比，VPA組小鼠PFC中p-PI3K（<0.001），p-AKT（<0.05）和p-mTOR表達(dá)均升高（<0.001）。與VPA組相比，Wortmannin組小鼠p-PI3K（<0.05），p-AKT（<0.01）和p-mTOR表達(dá)均降低（<0.01，圖5B～D）。

本文針對(duì)我國(guó)農(nóng)村電網(wǎng)實(shí)際情況，提出加大農(nóng)村電網(wǎng)實(shí)際檢查力度的策略。該種策略主要從以下兩方面進(jìn)行分析。第一方面，提升農(nóng)村電網(wǎng)的改造力度，對(duì)線損情況進(jìn)行全面化的檢查，進(jìn)而健全農(nóng)村電網(wǎng)的規(guī)劃。由于現(xiàn)階段的農(nóng)村電網(wǎng)依舊處于線損情況較為嚴(yán)重，且農(nóng)村電網(wǎng)處于有待建設(shè)以及有待規(guī)劃的情況中。故而應(yīng)對(duì)農(nóng)村電網(wǎng)的線損情況進(jìn)行全面化的檢查，并對(duì)農(nóng)村電網(wǎng)進(jìn)行規(guī)劃，加強(qiáng)改造力度[5]。第二方面，加強(qiáng)偏遠(yuǎn)地區(qū)的電網(wǎng)線損檢測(cè)以及線路規(guī)劃。由于我國(guó)某一部分的偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)電網(wǎng)規(guī)劃尚未完善，存在供電半徑長(zhǎng)以及電網(wǎng)負(fù)荷情況較大的問(wèn)題。故而應(yīng)實(shí)施加強(qiáng)偏遠(yuǎn)地區(qū)的電網(wǎng)線損檢測(cè)以及線路規(guī)劃的策略，進(jìn)而改善農(nóng)村電網(wǎng)線損處于較為嚴(yán)重的情況。

2.4 小鼠PFC中突觸相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與CON 組相比，VPA 組小鼠PFC 中PSD95（<0.01）和p-Syn表達(dá)均降低（<0.001）。與VPA組相比，Wortmannin 組小鼠PFC 中PSD95（<0.05）和p-Syn I表達(dá)均升高（<0.01，圖6B、C）。與CON組相比，VPA組小鼠PSD95與p-Syn熒光強(qiáng)度減弱，與VPA組相比，Wortmannin 組小鼠PSD95 與p-Syn 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（圖6D、E）。

3 討論

ASD具有高度的異質(zhì)性，由于致病原因的多樣性，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前關(guān)注較多的一點(diǎn)為：神經(jīng)元樹(shù)突棘和突觸發(fā)育異常。兒童2～3歲時(shí)，大腦樹(shù)突棘數(shù)目達(dá)到高峰。在大腦發(fā)育早期，樹(shù)突棘生成和修剪異?？赡軐?dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而引起ASD的發(fā)生。已有文獻(xiàn)報(bào)道，ASD患兒大腦樹(shù)突棘存在過(guò)度的形成和/或不完全修剪。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，VPA誘導(dǎo)的ASD小鼠PFC總樹(shù)突棘、成熟型蘑菇狀和粗短狀樹(shù)突棘密度降低，未成熟型絲狀樹(shù)突棘密度增加。那么在該模型中，樹(shù)突棘發(fā)育異常的具體機(jī)制又是什么呢？PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)突觸的強(qiáng)度、活性和成熟度以及軸突再生。鋁通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路會(huì)誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)樹(shù)突棘密度減少，引起突觸可塑性損傷，造成大鼠腦功能損傷。在癲癇模型中，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致未成熟型樹(shù)突棘密度顯著增加，誘發(fā)認(rèn)知障礙及記憶障礙。在VPA誘導(dǎo)的ASD模型小鼠中，PFC樹(shù)突棘密度的異常變化是否與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)？基于此，我們發(fā)現(xiàn)VPA誘導(dǎo)的ASD模型小鼠PFC中，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白過(guò)度激活可能導(dǎo)致總的、成熟型樹(shù)突棘密度顯著降低，未成熟樹(shù)突棘密度增加。運(yùn)用PI3K抑制劑Wortmannin后，能夠抑制該信號(hào)通路，改善樹(shù)突棘發(fā)育，改善小鼠ASD樣表型。

PSD95是突觸后密度的組成成分，與突觸可塑性密切相關(guān)。PSD95的異常被認(rèn)為是ASD等精神疾病神經(jīng)發(fā)育障礙的原因之一。Syn是神經(jīng)元磷酸化蛋白家族，由三個(gè)不同的基因編碼，即SYN I、SYN II 和SYN III。Syn一方面能夠調(diào)節(jié)囊泡的內(nèi)吞和胞吐，參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放；另一方面能夠調(diào)節(jié)突觸可塑性，包括突觸的發(fā)生、穩(wěn)定和傳遞。目前，在ASD的家系中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Syn基因的突變，并且該基因異?？赡軐?dǎo)致突觸穩(wěn)態(tài)失調(diào)。有研究報(bào)道，Syn的缺失或功能性突變可能引起神經(jīng)元發(fā)育受損，并導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)ASD樣表型。我們?cè)赩PA誘導(dǎo)的ASD模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，PSD95 和p-Syn 蛋白表達(dá)水平顯著降低，運(yùn)用Wortmannin后，PSD95和p-Syn蛋白表達(dá)水平升高。

因此，我們認(rèn)為，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的過(guò)度激活和突觸相關(guān)蛋白PSD95、p-Syn 表達(dá)降低可能導(dǎo)致VPA誘導(dǎo)的ASD小鼠PFC樹(shù)突棘損傷和突觸發(fā)育障礙，最終引起ASD樣表型的出現(xiàn)。