動脈粥樣硬化（AS）具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響我國國民健康，其主要的特征是動脈的慢性退化及動脈壁的逐漸變化。動脈粥樣硬化的形成過程非常復(fù)雜，雖然目前與動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制相關(guān)的學(xué)說包括脂質(zhì)浸潤學(xué)說、炎癥學(xué)說、氧化應(yīng)激反應(yīng)學(xué)說、感染學(xué)說、遺傳-環(huán)境因素相互作用學(xué)說等，但仍未能完全闡明動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理。

無論是放養(yǎng)或舍養(yǎng)，有抗養(yǎng)殖與無抗養(yǎng)殖氨基酸總量雞肉中3.91%和4.08%，肝臟中32.62%和29.9%，有抗養(yǎng)殖略高；必需氨基酸雞肉中0.99%和0.933 3%，兩組差別不顯著，肝臟中13.01%和14.81%，有抗養(yǎng)殖略低；非必需氨基酸肉中3.083 6%和2.968 6%，兩組差別不顯著，肝臟中16.952%和17.794%，有抗養(yǎng)殖略低，但不大；呈鮮味氨基酸中雞肉中0.601%和0.638%，兩組差別不顯著，肝臟中6.44%和5.98%，有抗養(yǎng)殖稍高。

近年來，動脈粥樣硬化的研究已由宏觀轉(zhuǎn)向微觀，深入到效應(yīng)細(xì)胞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子等領(lǐng)域。miRNA參與調(diào)節(jié)代謝等多種重要的生物學(xué)過程，在動脈粥樣硬化的治療中有潛在的應(yīng)用價值。MicroRNA-132（miR-132）位于人類基因組中第17號染色體的p13.3基因間區(qū)，其的表達(dá)水平受環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合子的調(diào)控。成熟miR-132 是由長度為66 bp的前體序列加工而成，其序列長度為22 bp。在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中，miR-132參與內(nèi)皮細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝，并可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成等相關(guān)的促炎癥過程，但具體機(jī)制尚不清楚。

鐵死亡是一種新型的細(xì)胞死亡方式，已成為調(diào)控炎癥相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制，其主要特征為：在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為線粒體萎縮、膜密度增加、嵴減少或消失等；在生物學(xué)上表現(xiàn)為鐵依賴性的活性氧和脂質(zhì)過氧化物的蓄積、谷胱甘肽的耗竭以及谷胱甘肽過氧化酶（GPX4）的失活等。鐵死亡在內(nèi)皮細(xì)胞損傷、動脈粥樣硬化演進(jìn)過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，但其具體機(jī)制仍不明確。

因此，本研究主要探索miR-132對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）生物學(xué)功能及鐵死亡進(jìn)程的影響，為進(jìn)一步闡明miR-132在動脈粥樣硬化的演進(jìn)過程所起作用進(jìn)奠定基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 組織標(biāo)本

收集在本單位醫(yī)院行外周血管造瘺手術(shù)的動脈粥樣硬化患者的斑塊樣本及周圍正常血管樣本各30例，分組為實(shí)驗(yàn)組（=30）與對照組（=30）。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者為首次接受血管造瘺手術(shù)；術(shù)前未接受任何特殊治療；術(shù)后病理證實(shí)為動脈粥樣硬化。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往患有免疫；腫瘤以及其他感染性疾病。本研究獲得了南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院研究倫理委員會的批準(zhǔn)，研究人員均自愿簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

RNA 提取液（TRIzol，Invitgen），PrimeScript RT Master Mix試劑盒（Takara），活性氧試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、線粒體活性氧試劑盒、線粒體膜通道轉(zhuǎn)化電位試劑盒（上海凱基公司），NADH氧化還原呼吸鏈復(fù)合物檢測試劑盒（艾美捷科技公司），線粒體探針、Image-iT?Lipid Peroxidation檢測試劑盒、GPX4抗體、NOX4抗體、GAPDH抗體、鼠/兔二抗（Abcam）、流式細(xì)胞儀（BD）、激光共聚焦儀器（Olympus）。

1.3 方法

4.支持開發(fā)核心技術(shù)，保障網(wǎng)絡(luò)安全。習(xí)近平總書記指出： “網(wǎng)絡(luò)安全的本質(zhì)在對抗，對抗的本質(zhì)在攻防兩端能力較量?！钡胤秸y(tǒng)籌推動網(wǎng)絡(luò)核心技術(shù)創(chuàng)新，支持本地企業(yè)、高校、科研機(jī)構(gòu)等突破核心技術(shù)，加強(qiáng)對工業(yè)互聯(lián)網(wǎng)、人工智能、大數(shù)據(jù)等新技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域安全技術(shù)研究，構(gòu)建多領(lǐng)域、多層次的網(wǎng)絡(luò)核心技術(shù)體系。要積極培育壯大網(wǎng)絡(luò)安全產(chǎn)品服務(wù)市場，引導(dǎo)通信、能源、金融、交通等重要行業(yè)、重要領(lǐng)域加大關(guān)鍵信息基礎(chǔ)設(shè)施網(wǎng)絡(luò)安全投入，并不斷優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)業(yè)生態(tài)，營造有利于網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展的地方環(huán)境，努力將核心技術(shù)牢牢掌握在自己手里，加快推進(jìn)國產(chǎn)自主可控替代，構(gòu)建安全可控的信息技術(shù)體系。

細(xì)胞線粒體的氧化還原呼吸鏈（復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型）活性檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，上調(diào)miR-132的HUVECs 細(xì)胞內(nèi)氧化還原呼吸鏈中復(fù)合體Ⅰ（<0.001，圖4A）、復(fù)合體Ⅲ（<0.001，圖4C）、復(fù)合體Ⅳ（<0.001，圖4D）、復(fù)合體Ⅴ型活性顯著下降（<0.001，圖4E），而氧化還原呼吸鏈中復(fù)合體Ⅱ活性則無明顯變化（>0.05，圖4B）。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測實(shí)驗(yàn) 收集成功轉(zhuǎn)染的HUVECs，去除原來的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入一定量的已經(jīng)稀釋好的DCFH-DA探針溶液。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min 后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次。最后，收集處理后的細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)的熒光輕度；與此同時，將處理后的細(xì)胞與線粒體紅色熒光探針進(jìn)行共同孵育后，用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定、以及DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

取穩(wěn)定生長的對數(shù)生長期的HUVECs細(xì)胞消化后接種于6孔板，密度為5×10/孔。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無雙抗培養(yǎng)基，用miRNA negative control（Control）及目 標(biāo)miRNA mimics（miR-132）分別 與Lipofectamine3000 混合后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.3.5 脂質(zhì)過氧化染色法 收集成功轉(zhuǎn)染的HUVECs，通過Image-iT?Lipid Peroxidation檢測試劑盒處理細(xì)胞，用激光共聚焦法評估細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化狀態(tài)。

現(xiàn)階段專員辦預(yù)算績效監(jiān)管的主攻方向在哪里？劉昆部長就強(qiáng)化預(yù)算績效管理提出“五個全”的指導(dǎo)思想，即資金上全覆蓋、預(yù)算上全方位、管理上全過程、項目上全周期、社會全監(jiān)督。這為專員辦強(qiáng)化部門預(yù)算績效監(jiān)管指明了方向。

1.3.4 線粒體功能測定實(shí)驗(yàn) 收集成功轉(zhuǎn)染的HUVECs細(xì)胞，加入JC-1染色工作液；在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，最后在流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位（MMP）狀態(tài)。同時，將成功轉(zhuǎn)染的HUVECs 細(xì)胞用線粒體活性氧（mtROS）檢測試劑盒及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）檢測試劑盒進(jìn)行處理，分別用流式細(xì)胞學(xué)及激光共聚焦法對細(xì)胞內(nèi)mtROS及mPTP進(jìn)行分析。最后，將成功轉(zhuǎn)染的HUVECs，用線粒體復(fù)合體檢測試劑盒對線粒體氧化還原呼吸鏈上的5個復(fù)合體的功能進(jìn)行檢測。

1.3.6 蛋白印跡法 收集成轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染的HUVECs，加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。30 μg變性總蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，封閉1 h，用GPX4（1∶1000）、NOX4（1∶1000）、GAPDH（1∶1000）一抗在4 ℃孵育過夜，洗膜3 次，相應(yīng)二抗（1∶3000）常溫孵育1 h，洗膜3 次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯像并保存圖像。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS 20.0處理。計數(shù)資料比較則采用卡方檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，并用Log-rank檢驗(yàn)比較組間差異，以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

在VOCs治理方面，目前工業(yè)上常用的吸附設(shè)備有固定床、移動床、流化床和轉(zhuǎn)輪式吸附裝置。其中固定床最常用，其結(jié)構(gòu)較為簡單，需要的吸附劑損失較少，但操作較麻煩，并且需要間歇操作；移動床可以連續(xù)吸附，分離能力較強(qiáng)，但易磨損，并且設(shè)備較大；流化床最近應(yīng)用也較多，其傳熱面積較大、傳熱效果好，但結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，吸附劑磨損嚴(yán)重。目前國外發(fā)達(dá)國家普遍應(yīng)用轉(zhuǎn)輪式吸附裝置，其設(shè)備體積小、操作方便，可以連續(xù)操作，解吸出來的氣體則濃度高而流量低，一般增濃比可達(dá)10～15倍；但該裝置不能處理含塵廢氣，容易堵塞旋轉(zhuǎn)輪。

2 結(jié)果

2.1 miR-132在動脈粥樣硬化組織中的表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示：相對于正常組，動脈粥樣硬化組織中miR-132的表達(dá)水平較正常組織顯著上調(diào)（<0.001，圖1A）。

1.3.1 RT-qPCR檢測 首先，從收集到的組織中提取總RNA，然后用PrimeScript RT Master Mix試劑盒將其轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板對目的基因進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件設(shè)置為：預(yù)變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s、退火65 ℃30 s及延伸95 ℃5 s，共40個循環(huán)。最后，采用2法表示目的基因的相對表達(dá)水平，以U6作為內(nèi)參。

細(xì)胞內(nèi)miR-132的含量檢測結(jié)果顯示：相比于空白對照組，陰性對照組細(xì)胞miR-132無明顯變化，而實(shí)驗(yàn)組（miR-132）細(xì)胞內(nèi)的miR-132表達(dá)水平相對于空白對照組跟陰性對照組均顯著上調(diào)（<0.001，圖1B）。

2.2 miR-132可促進(jìn)HUVECs的ROS的產(chǎn)生

流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析顯示：相比于陰性對照組，上調(diào)miR-132 的表達(dá)能顯著增加HUVECs 細(xì)胞內(nèi)的ROS水平（<0.001，圖2A）。通過倒置熒光顯微鏡觀察mtROS含量與分布，結(jié)果顯示：與對照組相比，miR-132上調(diào)的HUVECs細(xì)胞內(nèi)內(nèi)綠色熒光（ROS）顯著上升，且綠色與紅色（線粒體）重疊部位（黃色）顯著增多（<0.001，圖2B）。

2.3 miR-132可損傷HUVECs的線粒體

流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示：與對照組相比，上調(diào)miR-132后能誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞的線粒體膜電位顯著下降（<0.001，圖3A）、細(xì)胞內(nèi)的mitoROS水平明顯上調(diào)（<0.001，圖3B）；激光共聚焦結(jié)果顯示：與對照組相比，miR-132上調(diào)的HUVECs細(xì)胞內(nèi)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔通透性明顯增加（<0.001，圖3C）。

重慶自貿(mào)區(qū)的成立，對我國擴(kuò)大開放，深化改革，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義，同時，重慶自貿(mào)區(qū)也是我國提高創(chuàng)新能力，促進(jìn)科技進(jìn)步，推動產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化轉(zhuǎn)型的重要試點(diǎn)。健全且合理的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)是重慶自貿(mào)區(qū)健康發(fā)展的重要保障。在重慶自貿(mào)區(qū)的發(fā)展過程中，自貿(mào)區(qū)知識產(chǎn)權(quán)行政管理機(jī)制怎樣完善、自貿(mào)區(qū)多元化知識產(chǎn)權(quán)糾紛解決機(jī)制怎樣構(gòu)建、自貿(mào)區(qū)知識產(chǎn)權(quán)司法保護(hù)與法律適用、自貿(mào)區(qū)海關(guān)知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)以及如何構(gòu)建完善的自貿(mào)區(qū)知識產(chǎn)權(quán)服務(wù)體系等一系列問題日益顯著，重慶自貿(mào)區(qū)知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)工作不僅面臨新的要求和挑戰(zhàn)，也面臨一個完善重慶自貿(mào)區(qū)知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)制度的重要契機(jī)。

2.4 miR-132可損傷線粒體內(nèi)膜NADH氧化還原呼吸鏈復(fù)合物

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）均使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、置于恒溫孵育箱中培養(yǎng)。每24 h更換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞密度超過70%時，以0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

教師針對課本實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生思考其中的不足并要求提出改進(jìn)方案，這樣不僅能夠激發(fā)學(xué)生的課堂參與性，使學(xué)生認(rèn)真思考，更重要的是能夠激活學(xué)生的思維，促進(jìn)學(xué)生思維的發(fā)展.

長期做一名農(nóng)村小學(xué)的班主任，經(jīng)歷告訴我，學(xué)生的成長不能看過去，要看他們的今天和明天。一旦真正走近了學(xué)生，了解了學(xué)生，愛的種子就會生根、發(fā)芽 。通過三年級一年的打磨，小宇有了翻天覆地的變化，四年級被同學(xué)們選為班干部，還當(dāng)上了大隊干部。期末統(tǒng)考，他取得了年級總分第3名的好成績，直到現(xiàn)在，成績一直穩(wěn)居前列。有一周，他被評為“光榮升旗手”，站在國旗下，他發(fā)自肺腑的演講久久在我耳邊回響：“以前，我是一個不愛學(xué)習(xí)，學(xué)習(xí)差、紀(jì)律松散、屢屢犯錯的學(xué)生，是老師的親切教導(dǎo)和同學(xué)們的熱情幫助，我才有機(jī)會站在這臺上，驕傲地、自豪地說我是光榮升旗手！”

2.5 miR-132可促進(jìn)HUVECs細(xì)胞的鐵死亡進(jìn)程

細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，上調(diào)miR-132的HUVECs細(xì)胞內(nèi)的還原型蛋白被顯著抑制、氧化型蛋白顯著提升（<0.001，圖5A、B）。同時，與對照組相比，上調(diào)miR-132的表達(dá)后，細(xì)胞氧化還原相關(guān)的蛋白GPX4顯著下降、NOX4蛋白顯著上升（<0.001，圖5C、D）。

3 討論

AS作為全球主要的致死性疾病。不健康的生活方式（如高脂肪食物的大量攝入、運(yùn)動減少、生活壓力過大等）均可導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)、細(xì)胞氧化應(yīng)激，繼而導(dǎo)致動脈粥樣硬化的形成。

miRNAs是一種非編碼RNA。目前，已在人類組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)的miRNA有1000多個，其參與著50%以上哺乳動物蛋白質(zhì)編碼基因的調(diào)控，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。最新的研究證據(jù)表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能維持與多種miRNA的表達(dá)密切相關(guān)，包括miR-143/miR-145、miR-21、miR-31和miR-221/miR-222等。研究證實(shí)miR-132與癌癥、神經(jīng)元可塑性和血管生成等密切相關(guān)。然而，目前尚不清楚miR-132是否也參與動脈粥樣硬化的演進(jìn)。在本研究中，我們收集動脈粥樣硬化患者的組織標(biāo)本及血清樣本進(jìn)行RT-qPCR 分析，結(jié)果顯示動脈粥樣硬化組織中miR-132的表達(dá)較正常組織顯著上調(diào)。此外，我們還成功通過構(gòu)建過表達(dá)miR-132的HUVECs模型，進(jìn)一步對其細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)、線粒體功能及鐵死亡關(guān)鍵蛋白等進(jìn)行分析，闡明miR-132在動脈粥樣硬化的演進(jìn)中的關(guān)鍵調(diào)控作用。

細(xì)胞和組織中ROS的生成和清除之間的不平衡被稱為氧化應(yīng)激，而機(jī)體內(nèi)ROS的動態(tài)平衡對機(jī)體具有重要影響。既往研究發(fā)現(xiàn)，ROS有利于膠原沉積和血管平滑肌細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展。本研究深入分析miR-132對內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控作用，結(jié)果顯示上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-132的表達(dá)水平后，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧水平異顯著升高，但其如何調(diào)控動脈粥樣硬化尚不清楚。

鐵死亡是一種由于細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷所致的、鐵依賴的新型死亡方式。鐵死亡與很多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如肝炎、急性腎衰及急性心衰等。鐵死亡在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。例如PTGS2通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。抑制小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的鐵死亡可以抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)。上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中GPX4的表達(dá)可有效阻斷氧化應(yīng)激、增強(qiáng)對動脈的保護(hù)、延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生。在本研究中，我們也進(jìn)一步證實(shí)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-132的表達(dá)可以影響細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而抑制CPX4的表達(dá)、促進(jìn)HUVECs鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述，在動脈粥樣硬化的演進(jìn)過程中，miR-132處于高表達(dá)狀態(tài)，并引起內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的異常升高，進(jìn)而引起線粒體功能障礙，如線粒體膜電位改變，線粒體ROS升高，線粒體膜通道開放等，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GPX4蛋白降低以及氧化酶NOX4蛋白上升、誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生，最終促進(jìn)動脈粥樣硬化的演進(jìn)。本研究闡明了miR-132在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用及機(jī)制，miR-132 有望成為動脈粥樣硬化診療的關(guān)鍵標(biāo)志物。