隱孔菌［（Pk.）Hubbard］為多孔菌科隱孔菌屬真菌，一般生長在針葉樹的死木、倒木、腐朽木上。作為一種云南地區(qū)民間藥用植物，常被用作治療氣管炎和哮喘的藥物。其脂溶性部分主要單體化學(xué)成分為倍半萜類，該類成分體外具有細(xì)胞毒性，對腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，但具體靶點(diǎn)和作用機(jī)制無深入研究?？鼓[瘤作用涉及通路和靶標(biāo)較多，文獻(xiàn)對于倍半萜類化合物抗腫瘤靶標(biāo)有一些報(bào)道。Yang等認(rèn)為Hirsutanol通過增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；Chabranol 致低分化胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子機(jī)制可能與凋亡通路中p53、Bcl-2、Caspase-3基因的異常轉(zhuǎn)錄相關(guān)；Parthenolide與抑制PI3K/Akt 信號通路有關(guān)；人參中倍半萜成分抗腫瘤作用可能與降低Bcl-2和VEGF表達(dá)及激活p38MAPK蛋白通道有關(guān)。由于各個(gè)通路中仍含有眾多的作用蛋白，且多數(shù)仍未能合成得到，通過實(shí)驗(yàn)手段，驗(yàn)證化合物對于各靶點(diǎn)作用強(qiáng)弱不易進(jìn)行，比較盲目，耗時(shí)費(fèi)力。通過虛擬篩選則可以快速得到相互作用的基本信息，可以為藥物機(jī)制研究和藥物設(shè)計(jì)提供重要的參考。分子對接是利用作圖軟件將小分子（配體）放置于大分子靶標(biāo)（受體）的結(jié)合區(qū)域，再通過計(jì)算參數(shù)，從而預(yù)測兩者的結(jié)合能力和結(jié)合方式。通過結(jié)合能力強(qiáng)弱，可以初步推測分子可能的作用機(jī)制，并能快速準(zhǔn)確地描述藥物與潛在靶標(biāo)間的相互作用方式，為衍生物的制備提供科學(xué)依據(jù)，借助虛擬篩選，可以縮短了藥物研發(fā)周期，減少研發(fā)費(fèi)用。目前，已有利用分子對接技術(shù)來研究分子作用機(jī)制及進(jìn)行活性組分的篩選。本研究以前期分離得到的有活性的倍半萜骨架分子為基礎(chǔ)，通過在線反向找靶，尋找空間上與此類分子較為匹配的抗腫瘤靶標(biāo)。另外，考慮到常見抗腫瘤通路中有些是通過結(jié)構(gòu)修飾（氧化、磷酸酯化或酯化）的方式實(shí)現(xiàn)競爭性拮抗，因此將文獻(xiàn)報(bào)道過的倍半萜類抗腫瘤常見分子通路也列入考查范圍。本研究利用分子對接的方式考查活性分子與選定靶點(diǎn)的結(jié)合程度，推測其抗腫瘤主要作用靶點(diǎn)和相互作用方式，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)所得該類分子活性數(shù)值，分析不同分子骨架具有不同生物活性的原因，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬方式考查該類分子與蛋白靶點(diǎn)結(jié)合的穩(wěn)定性。該研究能夠?yàn)殡[孔菌中倍半萜類成分作用機(jī)制的研究和衍生物的制備提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

前期研究從隱孔菌子實(shí)體的乙酸乙酯提取物中分離得到19個(gè)倍半萜類化合物，它們分屬四個(gè)骨架類型，選取各個(gè)骨架中體外細(xì)胞毒活性較高的分子作為代表，進(jìn)行分子對接。它們的結(jié)構(gòu)如圖1所示，體外對五種腫瘤細(xì)胞的IC如表1所示。其中化合物4和化合物2體外細(xì)胞毒性較好，且對白血病HL-60細(xì)胞株毒性較強(qiáng)。

廈門某碼頭胸墻面層混凝土裂縫預(yù)防及控制措施…………………………………………………… 楊志文（10-189）

1.2 關(guān)鍵抗腫瘤靶點(diǎn)的選擇及準(zhǔn)備

抗腫瘤作用靶點(diǎn)眾多，本研究從空間匹配程度及倍半萜類抗腫瘤常見特異性結(jié)合（如對靶標(biāo)進(jìn)行氧化、酯化等結(jié)構(gòu)修飾）靶點(diǎn)兩個(gè)方面入手進(jìn)行初步篩選。通過在線投遞化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用反向找靶網(wǎng)站PharmMapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper）、SEA（http：//sea.bkslab.org）、Target Hunter（https：//www.cbligand.org/TargetHunter）進(jìn)行初篩，這些網(wǎng)站均是由國內(nèi)外不同高校開發(fā)，通過不同的算法，從不同的數(shù)據(jù)庫（如PharmMapper 利用遺傳算法，與來自TargetBank，DrugBank，BindingDB 和PDTD 這幾個(gè)數(shù)據(jù)庫，超過7000個(gè)受體基礎(chǔ)的藥效團(tuán)模型進(jìn)行匹配）中自動(dòng)查詢與小分子構(gòu)象最為匹配的藥效團(tuán)，根據(jù)匹配程度進(jìn)行排序，能夠從空間匹配度入手迅速完成靶點(diǎn)的初步預(yù)測，從篩選結(jié)果中選出與抗腫瘤相關(guān)的靶點(diǎn)備用。同時(shí)，有些倍半萜類化合物能夠與特定抗腫瘤靶點(diǎn)特異性結(jié)合，通過查閱文獻(xiàn)，考查該類化合物常見抗腫瘤通路，結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB，從中選出清晰度高，結(jié)構(gòu)解析清楚的人源靶標(biāo)蛋白備用。從空間匹配和特異性結(jié)合兩方面衡量，最終選擇了14個(gè)靶蛋白作為分子對接的受體。

綜上分析，船型尺度在考慮交通安全、過閘效率、應(yīng)急救援、航道暢通等方面的現(xiàn)實(shí)條件影響下，無法針對所有船舶類型進(jìn)行尺度放寬；同時(shí)，隨著水運(yùn)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，對專業(yè)化、集約化船舶有更大體量的運(yùn)輸需要，服務(wù)于新興業(yè)態(tài)發(fā)展有更深層次的訴求，因此尺度放寬界定為集裝箱船、滾裝船和江海直達(dá)船，意在先行先導(dǎo)，優(yōu)勢驅(qū)動(dòng)。

在兩個(gè)軟件中分別選中蛋白分子和配體結(jié)合最優(yōu)構(gòu)象，DS利用“View Interactions”及“View Interactions（Advanced）”觀察配體與蛋白分子3D 和2D 作用圖。Maestro 中通過“Ligand Interaction”直接產(chǎn)生2D 作用圖。

1.3 小分子配體的準(zhǔn)備

國內(nèi)PDA大致有兩種形式，一是讀者直接通過郵箱、論壇、到館推薦的方式向圖書館提供所需文獻(xiàn)的信息；二是圖書館與原版圖書的出版商或是代理商合作，在圖書館舉辦大型原版書展，邀請讀者參與，并根據(jù)他們的挑選情況進(jìn)行現(xiàn)場采買。2014年5月，天津大學(xué)圖書館和中國進(jìn)出口總公司就曾聯(lián)合舉辦了這樣的原版書展，參展的都是最新出版的原版外文圖書，是經(jīng)有關(guān)專家和國外出版社推薦，從劍橋大學(xué)出版社等眾多國際知名出版社中精選出來的，他們讓圖書館的讀者現(xiàn)場參與挑選，最后，根據(jù)推薦情況進(jìn)行擇優(yōu)訂購。像這樣讓讀者充分參與圖書采購決策，能夠增加原版外文圖書的利用率，將滯架率降低。

1.4 分子對接

采用DS和Maestro軟件進(jìn)行對接。DS中靶點(diǎn)活性口袋的確定通過選中原晶體復(fù)合物中配體小分子，優(yōu)先利用“From Current selection”或者直接選用“From PDB Site Records”，定義活性口袋，半徑選擇為10?。Maestro 中活性口袋定義方法參照DS 中活性位點(diǎn)三維坐標(biāo)確定。DS 中利用LibDock 工具，規(guī)定構(gòu)象數(shù)量，通過“High Quality”對接，DS 中對接結(jié)果以“LibDockScore”來衡量不同分子及不同構(gòu)象與蛋白受體對接情況。Maestro中通過XP（extra precision）進(jìn)行“Ligand Docking”，對接結(jié)果以“Docking Score”來衡量。記錄各個(gè)分子最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象的得分情況。分子對接領(lǐng)域任何一種單獨(dú)的策略并不具備絕對優(yōu)勢，不同的靶標(biāo)需要利用不同的搜索算法和打分函數(shù)的組合來獲得最優(yōu)結(jié)果。本研究兩個(gè)打分軟件采用不同算法。Maestro運(yùn)算時(shí)間稍長，精度稍高，Maestro Score得分越低說明結(jié)合越好；而Libdock 運(yùn)算速度較快，Libdock Score得分越高，說明結(jié)合越好。

1.5 相互作用結(jié)果分析

靶蛋白三維結(jié)構(gòu)從PDB（http：//www.rcsb.org）中搜索下載，優(yōu)先選擇人源蛋白且分辨率較高的晶體結(jié)構(gòu)，確定PDB 代碼分別為5XP3（T2R-TTL）、2VPB（Bcl9）、2O6L（UDP-glucuronosyltransferase 2B7）、3HR4（iNOS）、1ORD（Inducible ornithine decarboxylase）、3BKY（β-lymphocyte antigen CD20）、3CKI（Metalloproteinase inhibitor 3）、1O4N（Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src）、3IW4（Protein kinase C-α）、2IOE（Protein kinase C-β）、1UNQ（Akt，序列1-123）、3QKL（Akt，序列144-480）、4QTB（Mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、3HHM（Phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate 3-kinase，PI3K），它們被用作為分子對接研究的載體。分別利用Discovery Studio 4.0（DS）和Maestro 12.3（Maestro）軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行補(bǔ)全不完整殘基、刪去配體分子和水分子、加氫和賦電荷等優(yōu)化處理。

1.6 分子動(dòng)力學(xué)模擬

運(yùn)用DS（Libdock）和Maestro對4個(gè)倍半萜類化合物和篩選出的14個(gè)蛋白序列進(jìn)行對接打分，結(jié)果見表2。從結(jié)果可見，兩個(gè)軟件打分大體趨勢是相同的，均顯示各小分子配體與蛋白序列1UNQ有較高的對接打分，故認(rèn)為該類倍半萜類化合物更容易與1UNQ匹配結(jié)合，推測1UNQ蛋白序列為該類物質(zhì)主要作用靶點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 四個(gè)倍半萜分子與潛在靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果

通過DS軟件分別對純蛋白受體和對接得到的復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。通過“Simulation”對制備過的各個(gè)分子結(jié)構(gòu)增加CHARMM力場，利用“Solvation”溶劑化蛋白。對添加了溶劑體系的蛋白利用“Standard Dynamics Cascade”進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬參數(shù)設(shè)置。升溫時(shí)間設(shè)置為40 ps，平衡時(shí)間設(shè)置為400 ps，模擬采樣時(shí)間設(shè)置為10 000 ps，模擬步長為2 fs，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。10 ns模擬結(jié)束后分析RMSD值和RMSF值。

由Maestro 軟件得到的4 個(gè)倍半萜類化合物與1UNQ最優(yōu)結(jié)合的2D相互作用（圖2），顯示該類成分與受體的相互作用主要依靠羧基與蛋白之間以氫鍵和靜電力相互作用。分子中的氧原子（紅色部分）是其與蛋白靶點(diǎn)產(chǎn)生作用的主要基團(tuán)。各化合物及蛋白復(fù)合物原配體與蛋白結(jié)合位點(diǎn)類似（表3），說明該類化合物與該活性口袋有良好作用。

2.2 四個(gè)倍半萜分子與蛋白序列1UNQ的2D相互作用圖

你是左撇子嗎？如果答案肯定，你就屬于在人群中只占十分之一的少數(shù)派。在學(xué)習(xí)、生活中，也許你曾遭遇過一些尷尬和痛苦，比如，吃飯的時(shí)候怕和你的筷子打架，誰都不愿意挨著你坐。隨著社會的開明程度不斷提高，左撇子們的境遇變得越來越好，甚至在某些領(lǐng)域還獨(dú)占鰲頭。比如，在體育競賽中，左撇子的擊劍手、棒球投球手、拳擊手，相比于同實(shí)力右撇子選手，則更容易獲得勝利。再來看一個(gè)事實(shí)，在美國的倒數(shù)前7任總統(tǒng)中，有4位都是左撇子——福特、老布什、克林頓和奧巴馬。左撇子并非生理缺陷，而是正常的遺傳現(xiàn)象，科學(xué)家稱它為“偏側(cè)優(yōu)勢”。

2.3 四個(gè)倍半萜化合物與1UNQ最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象

本次研究采用的SiO2溫標(biāo)為無蒸汽損失SiO2溫標(biāo)、最大蒸汽損失在100 ℃SiO2溫標(biāo)、無蒸汽損失玉髓溫標(biāo)，陽離子溫標(biāo)主要采用Na-K、Na-K-Ca、K-Mg溫標(biāo)。

分子對接結(jié)果中四個(gè)倍半萜類化合物與蛋白靶點(diǎn)結(jié)合打分最高的構(gòu)象（圖3）即為該分子與1UNQ最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象，可以發(fā)現(xiàn)四個(gè)不同的倍半萜化合物與靶蛋白結(jié)合的最優(yōu)構(gòu)象存在較大的差別。

2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果

比較1UNQ純蛋白序列和化合物4結(jié)合后復(fù)合體結(jié)構(gòu)的RMSD值，復(fù)合物RMSD值波動(dòng)圖見圖4，其均值為（1.41±0.02）?。約3 ns后整個(gè)復(fù)合物趨于穩(wěn)定，無較大波動(dòng)，相對于1UNQ純蛋白波動(dòng)值為（1.75±0.21）?略低。復(fù)合物RMSF值較高的氨基酸序列為TYR18，ASN53，ARG69，ARP80。

以隱孔菌中分離得到的具有一定體外細(xì)胞毒性的4個(gè)化合物作為小分子配體。通過Chem 3D軟件將化合物轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，將其在DS分子窗口中復(fù)制粘貼到一個(gè)窗口中，并保存為mol2格式文件，對接前分別載入DS和Maestro中，通過賦予CHARMM力場，規(guī)定相應(yīng)PH 范圍等進(jìn)行優(yōu)化操作，用于與蛋白結(jié)構(gòu)的分子對接。

3 討論

本研究顯示，四個(gè)倍半萜化合物體外對五個(gè)腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性強(qiáng)弱為化合物4>化合物2>化合物1>化合物3。不同的倍半萜骨架體外細(xì)胞毒性存在明顯差異。通過反向找靶和分子對接技術(shù)，我們推測1UNQ蛋白序列為該類物質(zhì)主要作用靶點(diǎn)。根據(jù)不同三萜骨架與1UNQ的2D相互作用圖，不同化合物分子主要依靠羧基、羥基與蛋白靶點(diǎn)相應(yīng)位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵或靜電作用。體外細(xì)胞毒性最高的化合物4與蛋白靶點(diǎn)之間作用鍵最多且作用距離較短，結(jié)合更為牢固。另外，結(jié)合表3所列與配體結(jié)合具體作用靶標(biāo)氨基酸，化合物4的C-15位較為特殊，此處的羥基能夠與受體TYR-18位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵作用，推測該位置對于活性有較大貢獻(xiàn)。

同時(shí)，根據(jù)四個(gè)倍半萜化合物與1UNQ最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象進(jìn)一步分析不同骨架對活性的影響，認(rèn)為空間構(gòu)象上的變化通過影響配體與靶標(biāo)相互之間鍵合來影響其生物活性?；衔?由于雙鍵在環(huán)內(nèi)，使得雙環(huán)處在離受體較近的空間位置，從而導(dǎo)致了分子與受體結(jié)合時(shí)產(chǎn)生了空間位阻，導(dǎo)致部分紅色位點(diǎn)無法與相應(yīng)的蛋白位點(diǎn)產(chǎn)生作用，降低了生物活性；化合物3由于形成了環(huán)合，其結(jié)構(gòu)中的一個(gè)雙環(huán)被固定在位阻位置，且為剛性結(jié)構(gòu)，極大影響了分子與蛋白的結(jié)合，使得活性大為減?。换衔?中雙鍵位于環(huán)外，通過自由轉(zhuǎn)動(dòng)使其結(jié)合最優(yōu)構(gòu)象中雙環(huán)并不影響與蛋白靶點(diǎn)的結(jié)合，同時(shí)，C-15位羥基剛好與蛋白序列上TYR18形成氫鍵，增加了親和力；化合物1（紅色部分少一些）與1UNQ形成的相互作用力相對化合物2和化合物4較少，且由于分子較小，與相應(yīng)靶點(diǎn)空間匹配度不如二聚體，結(jié)合較為松散。

通過分子動(dòng)力學(xué)模擬對該類倍半萜化合物與1UNQ的結(jié)合穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，該技術(shù)能夠模擬自然狀態(tài)下兩者的結(jié)合，可以還原一些目前的技術(shù)手段所不能檢測到的反應(yīng)過程，通過分析分子三維構(gòu)象的變化，說明配體與受體結(jié)合的穩(wěn)定性?；衔?與1UNQ復(fù)合體的RMSD值小于1UNQ的RMSD值，提示分子與1UNQ 有較穩(wěn)定的結(jié)合。RMSF 值較高的位置則是1UNQ與化合物分子產(chǎn)生相互作用的鄰近基團(tuán)，這些位點(diǎn)構(gòu)象變化較大，以利于更好與配體化合物產(chǎn)生結(jié)合，也使得結(jié)合形成的復(fù)合物較為穩(wěn)定。

Akt激酶是一種重要的蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)控蛋白，Akt的活性與其自身的磷化、去磷酸化密切相關(guān)，且通過磷酸化下游底物蛋白和轉(zhuǎn)錄因子來影響細(xì)胞增殖的過程。本研究選擇了Akt蛋白激酶中兩段不同的序列1UNQ（1-123）和3QKL（144-480）進(jìn)行研究，文獻(xiàn)報(bào)道其行使磷酸化主要的靶點(diǎn)為Thr-308、Ser-473和Tyr-474，均存在于后端序列3QKL中。前端序列1UNQ中重要的靶點(diǎn)為Lys-14或Lys-20，這兩個(gè)位置的乙?；軌蛘T導(dǎo)Akt三級結(jié)構(gòu)的破壞，使其無法與下游PIP（3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇）結(jié)合，從而阻斷信號傳導(dǎo)，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞增殖起到抑制作用。對接的結(jié)果顯示隱孔菌中倍半萜化合物與1UNQ作用比3QKL更好，說明該類化合物并不是通過占據(jù)后端蛋白作用靶點(diǎn)而起競爭抑制作用，更多是與前端蛋白序列有良好作用。從2D相互作用圖可見，它們與Lys-14有相互作用，推測該類倍半萜類化合物能夠引起Lys-14位乙?；?，導(dǎo)致Akt無法與下游PIP結(jié)合，影響細(xì)胞的增殖。

本研究選取體外實(shí)驗(yàn)有較好細(xì)胞毒性的隱孔菌倍半萜分子作為研究對象，通過反向找靶和文獻(xiàn)調(diào)研初篩了14個(gè)可能作用靶點(diǎn)，利用分子對接技術(shù)，對倍半萜分子和可能靶點(diǎn)結(jié)合情況進(jìn)行打分，最后確定蛋白激酶B的前端蛋白序列1UNQ為潛在的作用靶點(diǎn)。結(jié)合實(shí)際體外細(xì)胞毒數(shù)據(jù)，認(rèn)為不同倍半萜骨架分子與靶蛋白結(jié)合存在不同的位阻，進(jìn)而導(dǎo)致不同的生物活性。該類化合物與靶點(diǎn)有較穩(wěn)定的結(jié)合，通過引起Lys-14位乙?；?，導(dǎo)致Akt無法與下游PIP結(jié)合，影響細(xì)胞的增殖。該研究對于進(jìn)一步研究該類分子抗腫瘤作用機(jī)制及其衍生物的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。