呂迪 陳茹梅 周曉今

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

茉莉酸（jasmonic acid，JA）是一類重要的植物激素，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、生物脅迫及非生物脅迫的防御應(yīng)答反應(yīng)，包括根的伸長、病原菌侵染、葉片衰老和冷脅迫等［1-5］。JAZ蛋白是JA信號(hào)通路中的重要組成部分，當(dāng)植物處于正常生長狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)的JA含量較低，大量積累的JAZ蛋白與下游轉(zhuǎn)錄因子MYC2結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，從而調(diào)控JA信號(hào)通路下游基因的表達(dá)。當(dāng)植物受到外界脅迫或接收到特定的生長發(fā)育信號(hào)時(shí)，體內(nèi)的JA含量迅速升高，SCFCOI1復(fù)合體中的COI1蛋白與活性JA分子結(jié)合，從而促進(jìn)該復(fù)合體與底物JAZ蛋白相互作用并將其泛素化降解。JAZ蛋白的泛素化降解解除了其對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子MYC2的抑制，從而激活下游JA信號(hào)通路基因的表達(dá)［6-9］。JAZ蛋白含有ZIM和Jas兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。ZIM結(jié)構(gòu)域包含TIFY基序，其通過與其他蛋白形成二聚體發(fā)揮阻遏作用；Jas結(jié)構(gòu)域位于JAZ蛋白的C端，與JAZ蛋白的泛素化降解相關(guān)［6，10］。目前玉米中已報(bào)道23個(gè)JAZ家族基因，它們的表達(dá)具有組織特異性。有研究表明，干旱脅迫會(huì)誘導(dǎo)ZmJAZ2、ZmJAZ4、ZmJAZ19和ZmJAZ21等基因的表達(dá)［11］，說明JAZ基因在非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

MYC2屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，其C端具有保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，是響應(yīng)JA信號(hào)的核心轉(zhuǎn)錄因子。在許多生物途徑中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子都是轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，而MYC2作為正調(diào)控因子在JA信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。MYC2能激活受JA誘導(dǎo)的抗蟲基因表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗蟲能力［5，12］。Chen等［13］的 研 究 表 明 JA 以 MYC2依賴的方式抑制擬南芥初級(jí)根分生組織細(xì)胞的分裂；MYC2還是JAZ介導(dǎo)的黃酮類生物合成的正調(diào)控因子，過表達(dá)MYC2的擬南芥植株表現(xiàn)出更多的花青素積累［5］。JAZ還可以通過與其他信號(hào)通路調(diào)控因子的相互作用，調(diào)節(jié)MYC2的活性從而介導(dǎo)JA信號(hào)與其他的激素信號(hào)途徑產(chǎn)生交叉互話。例如，擬南芥中的赤霉素信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子RGA（repressor of ga1-3）通過與MYC2競爭結(jié)合JAZ1，從而抑制JAZ蛋白對(duì)MYC2的調(diào)控作用［14］。此外，最近的研究通過DAP-Seq分析發(fā)現(xiàn)ZmMYC2可結(jié)合許多植物激素生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子編碼基因的啟動(dòng)子［15］，提示MYC2可作為樞紐整合多種植物內(nèi)源生長發(fā)育和外源性環(huán)境信號(hào)［16-18］。

雖然JAZ蛋白對(duì)MYC2的調(diào)控作用在擬南芥和水稻中都有較為深入的研究［19-20］，但是仍未見關(guān)于玉米中JAZ蛋白和MYC2在體內(nèi)互作的報(bào)道。本研究篩選了玉米中不同表達(dá)模式的JAZ基因ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12，通過玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和BiFC技術(shù)研究ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12與ZmMYC2的相互作用，探究這些JAZ蛋白是否都具有結(jié)合ZmMYC2的特征，為深入研究玉米JAZ蛋白的生理功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

溫室培養(yǎng)的玉米Z58自交系黃化苗，于三葉期分離葉片原生質(zhì)體。

分析ZmJAZs基因相對(duì)表達(dá)量的植物材料為大田生長的玉米Z58自交系，分別取其根、莖、葉、雄穗和未授粉的雌穗，以及授粉后12 d、21 d和28 d的胚和胚乳保存至-80℃冰箱備用。

大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司；pRTL2-GFP、pRTL2-YFPN、pRTL2-YFPC（以下簡稱為pYFPC和pYFPN）載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；核定位Marker載體pNLSDsRed由本實(shí)驗(yàn)室保存；KOD one Mix為TOYOBO公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、Infusion克隆試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；SYBR Green Mix為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ZmJAZs基因?qū)崟r(shí)熒光定量表達(dá)分析 使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)ZmActin（內(nèi)參）與ZmJAZs基因的特異性引物（表1），以1.1中植物材料提取的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，參照SYBR Green Mix說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。熒光定量反應(yīng)體系（20 μL）：2 × SYBR Green Mix 10 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8 μL、 上 下 游 引 物 各 0.4 μL、ROX Ⅱ 0.2 μL。反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 30 s；94℃變性15 s，60℃退火及延伸34 s，循環(huán)40次。每個(gè)處理重復(fù)3次。采用Ct值法（2-ΔΔCt法）分析ZmJAZs基因在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers used in qRT-PCR

1.2.2 含有同源重組末端序列的ZmMYC2、ZmJAZ4、ZmJAZ8和 ZmJAZ12基 因 克 隆 根 據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的ZmMYC2基因，以及MaizeGDB玉米基因組數(shù)據(jù)庫（www.maizegdb.org）中ZmJAZ4（GRMZM2G024680）、ZmJAZ8（GRMZM2G086920）和ZmJAZ12（GRMZM2G101769）基因的全長CDS序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF的引物。利用Z58的cDNA做 模 板， 通 過 ZmMYC2、ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12基因的特異上游引物和下游引物（表2）擴(kuò)增得到目的基因的ORF序列。然后，設(shè)計(jì)Infusion克隆用的引物并以各基因的ORF序列回收產(chǎn)物為模板擴(kuò)增獲得用于構(gòu)建亞細(xì)胞定位和BiFC載體的Infusion插入片段。PCR程序?yàn)椋?4℃ 預(yù)變性 5 min；98℃ 變性 10 s，55℃ 退火 15 s，68℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；68℃ 終延伸10 min。其中ZmMYC2基因擴(kuò)增時(shí)延伸時(shí)間為90 s。

表2 PCR擴(kuò)增所用引物Table 2 Primers used for gene cloning

1.2.3 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建 通過Xho I和Xba I雙酶切pRTL2-GFP載體，電泳并回收線性載體片段。之后用Infusion克隆試劑盒將片段ZmMYC2-GFP、ZmJAZ4-GFP、ZmJAZ8-GFP、ZmJAZ12-GFP和回收的載體片段相連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16 h，挑取單克隆搖菌，雙酶切鑒定后，將菌液送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序。構(gòu)建成功的載體分別命名為pZmMYC2-GFP、pZmJAZ4-GFP、pZmJAZ8-GFP 和 pZmJAZ12-GFP。將上述載體大提質(zhì)粒并定量至1 100 ng/μL待用。

1.2.4 BiFC載體的構(gòu)建 通過Xho I和Xba I雙酶切pYFPN和pYFPC載體，電泳并回收線性載體片段。然后用Infusion克隆試劑盒將載體片段與帶有同源重組末端的目的基因序列連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16 h，挑取單克隆搖菌，雙酶切鑒定后，將菌液送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序。構(gòu)建成功的載體分別命名為pZmMYC2-YFPN、pZmMYC2-YFPC、pZmJAZ4-YFPN、pZmJAZ4-YFPC、pZmJAZ8-YFPN、pZmJAZ8-YFPC、pZmJAZ12-YFPN和pZmJAZ12-YFPC。將上述載體大提質(zhì)粒并定量至1 100 ng/μL待用。

1.2.5 載體轉(zhuǎn)化玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體 首先配制轉(zhuǎn)化玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體所需的試劑，酶解液（0.4 mol/L甘露醇、0.02 mol/L KCl、0.02 mol/L MES 調(diào)節(jié)pH 至 5.7、1.5% CelluLase R10、0.4% Macerozyme R10、0.01 mol/L CaCl2和 0.1% BSA）、W5緩 沖 液（0.002 mol/L MES 調(diào)節(jié)pH至 5.7、0.154 mol/L NaCl、0.125 mol/L CaCl2、0.005 mol/L KCl）、MMg 緩 沖 液（0.004 mol/L MES 調(diào) 節(jié) pH至 5.7、0.4 mol/L甘 露醇、0.015 mol/L MgCl2）和40% PEG-Ca2+溶液（40%PEG4000、0.2 mol/L 甘露醇、0.1 mol/L CaCl2）。

取玉米黃化苗第二片真葉的中間5-7 cm部分，將其切成0.5-1 mm的細(xì)絲，轉(zhuǎn)移至含有酶解液的平皿中，在28℃ 搖床上以35 r/min的轉(zhuǎn)速于黑暗條件下酶解4 h。然后使用350目的過濾網(wǎng)將酶解液過濾至50 mL離心管中，加入等體積的W5緩沖液，混勻后在4℃、100×g轉(zhuǎn)速條件下離心2 min，沉淀原生質(zhì)體，之后棄去上清液。再加入3 mL冷的W5緩沖液冰上孵育30 min。棄上清后加入3 mL的MMg緩沖液重懸細(xì)胞，此時(shí)即收集到了玉米葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體，鏡檢觀察細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)，冰上靜置待用。

亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)中，在2 mL的離心管中分別加入細(xì)胞核定位的紅色熒光蛋白表達(dá)載體pNLS-DsRed和目標(biāo)蛋白亞細(xì)胞定位載體各10 μL。BiFC實(shí)驗(yàn)中，在2 mL的離心管中分別加入pNLSDsRed、融合表達(dá)YFPN和YFPC的載體各7 μL。混勻各載體后加入200 μL的原生質(zhì)體。然后加入220 μL的40% PEGCa2+溶液，混勻，并于室溫靜置30 min。隨后加入880 μL W5緩沖液，100×g轉(zhuǎn)速室溫離心2 min，棄上清；加入1 mL的W5緩沖液，黑暗常溫培養(yǎng)12-16 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 玉米ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12基因的表達(dá)分析

利用qRT-PCR的方法分析ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12在玉米Z58自交系各個(gè)組織部位的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖1所示，ZmJAZ4主要在胚乳中高表達(dá)，在根、莖、葉、雄穗和未授粉的雌穗中表達(dá)量相對(duì)較低；ZmJAZ8主要在雄花和雌穗這類生殖器官中高表達(dá)；ZmJAZ12在植株的絕大多數(shù)組織均有表達(dá)，且表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，在胚乳中表達(dá)量相對(duì)較低。

圖1 ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expressions of ZmJAZ4，ZmJAZ8，and ZmJAZ12

2.2 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

利用反轉(zhuǎn)錄玉米cDNA為模板用基因特異引物擴(kuò) 增 ZmMYC2、ZmJAZ4、ZmJAZ8和 ZmJAZ12的ORF序列。通過Infusion方法將各基因的ORF與亞細(xì)胞定位載體骨架連接，最后構(gòu)建成功的載體分別命 名 為 pZmMYC2-GFP、pZmJAZ4-GFP、pZmJAZ8-GFP和pZmJAZ12-GFP（圖2-A）。雙酶切鑒定分別獲得 1 460 bp 和 650 bp（ZmMYC2）、651 bp（ZmJAZ4）、651 bp（ZmJAZ8）、714 bp（ZmJAZ12）的特異條帶（圖2-B）。因?yàn)閆mMYC2的CDS在651 bp處存在一個(gè)Xho I的酶切位點(diǎn)，所以酶切檢測獲得了1 460 bp和650 bp兩個(gè)片段。同時(shí)對(duì)構(gòu)建完成的載體進(jìn)行了測序，結(jié)果通過DNAMAN比對(duì)與MaizeGDB數(shù)據(jù)庫中的序列一致，結(jié)合酶切檢測和測序結(jié)果表明亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建正確。

圖2 亞細(xì)胞定位載體和酶切鑒定電泳圖Fig.2 Vectors for subcellular localization and enzyme digestion identification

2.3 BiFC融合載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

利用反轉(zhuǎn)錄玉米的cDNA為模板用上述引物擴(kuò) 增 ZmMYC2、ZmJAZ4、ZmJAZ8和 ZmJAZ12的ORF序列。通過Infusion方法將各基因的ORF與BiFC載體連接，形成ZmMYC2、ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12分別與YFPN和YFPC融合表達(dá)的載體（圖3-A）。雙酶切鑒定分別獲得1 460 bp和650 bp（ZmMYC2）、651 bp（ZmJAZ4）、651 bp（ZmJAZ8）、714 bp（ZmJAZ12）的特異條帶（圖3-B）。同時(shí)對(duì)構(gòu)建完成的載體進(jìn)行了測序，結(jié)果通過DNAMAN比對(duì)與MaizeGDB數(shù)據(jù)庫中的序列一致，結(jié)合酶切檢測和測序結(jié)果表明BiFC融合表達(dá)載體構(gòu)建正確。

圖3 BiFC載體構(gòu)建示意圖和酶切鑒定電泳圖Fig.3 Vectors for BiFC assay and enzyme digestion identification

2.4 亞細(xì)胞定位結(jié)果

取培養(yǎng)好的原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦顯微觀察GFP熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，在激光共聚焦顯微鏡下 pZmMYC2-GFP、pZmJAZ4-GFP、pZmJAZ8-GFP和ZmJAZ12-GFP均在細(xì)胞核中檢測到GFP熒光信號(hào)，同時(shí)該熒光信號(hào)與細(xì)胞核的紅色熒光信號(hào)重合（圖4）。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)設(shè)置pRTL-GFP轉(zhuǎn)化的空載GFP為對(duì)照，GFP在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有分布。亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明ZmMYC2、ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12均定位于細(xì)胞核中。

圖4 ZmJAZ4、ZmJAZ8、ZmJAZ12和ZmMYC2的亞細(xì)胞定位Fig. 4 Subcellular localization of ZmJAZ4，ZmJAZ8，ZmJAZ12 and ZmMYC2

2.5 BiFC檢測蛋白互作

取培養(yǎng)好的原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦顯微觀察YFP熒光信號(hào)，設(shè)置pYFPC和pZmMYC2-YFPN、pYFPN和pZmMYC2-YFPC為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，在激光共聚焦顯微鏡下陰性對(duì)照無熒光信號(hào)，僅有核熒光信號(hào)；而pZmMYC2-YFPN和pZmJAZ4-YFPC、pZmMYC2-YFPN和 pZmJAZ8-YFPC、pZmMYC2-YFPN和 pZmJAZ12-YFPC、pZmMYC2-YFPC和pZmJAZ4-YFPN、pZmMYC2-YFPC和 pZmJAZ8-YFPN、pZmMYC2-YFPC和pZmJAZ12-YFPN均在細(xì)胞核中檢測到Y(jié)FP熒光信號(hào)，同時(shí)該熒光信號(hào)與核熒光信號(hào)重合（圖5）。BiFC結(jié)果表明ZmMYC2和ZmJAZ4、ZmJAZ8、ZmJAZ12在植物體內(nèi)存在蛋白互作，且相互作用發(fā)生在細(xì)胞核中。

圖5 ZmMYC2與ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12的BiFC互作驗(yàn)證Fig. 5 BiFC assay to verify interactions between ZmJAZs with ZmMYC2

3 討論

多種植物激素中，普遍認(rèn)為赤霉素、生長素、脫落酸和細(xì)胞分裂素是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的重要激素，茉莉酸和水楊酸在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫中發(fā)揮主要作用。但是近些年隨著對(duì)JA信號(hào)通路的研究越來越多，發(fā)現(xiàn)JA不僅在植物抵抗生物脅迫過程中發(fā)揮作用，而且在植物的性別決定以及生長發(fā)育中也發(fā)揮重要作用。在玉米ts1（tasselseed1）突變體的研究中克隆得到的ts1基因，其編碼產(chǎn)物具有13-脂氧合酶（13-lipoxygenase，13-LOX）的特征，13-LOX酶類是茉莉酸合成途徑重要的酶類。ts1突變體未成熟雄花序中脂氧合酶的活性消失，且內(nèi)源茉莉酸濃度降低至野生型玉米的十分之一，對(duì)突變體未成熟雄花序外施JA可恢復(fù)雄花的正常發(fā)育［21］，說明JA的缺乏是造成突變體表型的原因，也說明JA是玉米雄花性別決定中的一種重要的信號(hào)物質(zhì)。另外有研究表明JA對(duì)擬南芥葉肉細(xì)胞中的葉綠素有明顯的降解作用，進(jìn)而使植物葉片生長受到抑制，表現(xiàn)出黃化衰老的特征［22］。JA通過COI1可抑制光合作用過程中的關(guān)鍵酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的表達(dá)，干擾光合作用進(jìn)程，進(jìn)而抑制幼苗的生長［23］。擬南芥中的JA不敏感突變體coi1中的F-box蛋白突變使其不能參與形成SCF（Skp1/Cullin/F-box）復(fù)合體，導(dǎo)致JAZs蛋白降解調(diào)控失效，突變體表現(xiàn)為對(duì)JA激素不敏感且雄性不育［24］。與此不同的是，番茄中對(duì)應(yīng)的jai1（jasmonic acid-insensitive1）突變體也是JA不敏感的突變體，突變位點(diǎn)同樣位于F-box蛋白，但是突變體表現(xiàn)為雌性不育［25］。由此可見，不同植物的JA信號(hào)調(diào)控機(jī)制既有保守性又存在差異性。

另有研究表明，ZmJAZ4在非生物脅迫處理（鹽、干旱、ABA等）時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)，推測ZmJAZ4蛋白可能作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在逆境脅迫信號(hào)通路中發(fā)揮一定的調(diào)控作用［26］。和ZmJAZ4相反，ZmJAZ12在干旱脅迫下被抑制表達(dá)［27］；ZmJAZ4主要在籽粒中高表達(dá)，而ZmJAZ12在各個(gè)組織均有表達(dá)，提示玉米在應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)，不同的JAZ蛋白在各自表達(dá)的組織部位可能發(fā)揮不同的作用。在黑粉菌（Sphacelotheca reiliana）侵染后ZmJAZ4和ZmJAZ8被誘導(dǎo)表達(dá)，莖腐病菌（F.moniliforme）侵染后ZmJAZ12也被上調(diào)表達(dá)［27］，提示ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12在抵抗病原菌侵染的過程中發(fā)揮作用。

玉米的生殖發(fā)育過程和擬南芥以及水稻不同，玉米的生殖發(fā)育過程中還涉及雌雄花的性別決定，因此JA信號(hào)通路在玉米中的作用可能更為復(fù)雜。MYC2和JAZ蛋白的互作是JA信號(hào)通路傳導(dǎo)中的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)MYC2還是JA和其他激素信號(hào)途徑交叉互話的核心轉(zhuǎn)錄因子，更深入細(xì)致地探究JA信號(hào)通路在玉米中的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制就顯得很有必要。JAZ蛋白和MYC2作為JA信號(hào)通路中的重要組分，明確兩者之間的相互作用關(guān)系對(duì)后續(xù)研究將提供重要的基礎(chǔ)。同時(shí)，為后續(xù)通過Pull-down和Co-IP等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證ZmJAZ和ZmMYC2的相互作用，探尋其互作位點(diǎn)提供了參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究在玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中對(duì)JA信號(hào)通路中3個(gè)不同的JAZ家族蛋白ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12與ZmMYC2的互作關(guān)系進(jìn)行了BiFC驗(yàn)證。結(jié)果顯示，3個(gè)不同的ZmJAZ蛋白均可與ZmMYC2在細(xì)胞核中互作。