呂昌偉 張靜濤 郗海濤 強毅 張乾

西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院骨科，陜西 西安 710018

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜組織炎癥、滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)畸形為特征的慢性自身免疫性疾病[1]。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)是構(gòu)成滑膜結(jié)構(gòu)的主要細胞[2]，大量證據(jù)[3]表明FLS的異常激活是RA的發(fā)生與發(fā)展的重要因素，活化的RA-FLS表現(xiàn)出過度增殖和細胞凋亡不足等特征，同時能夠分泌大量炎癥因子如白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。因此，抑制FLS的異常激活被認為是預(yù)防RA進展的有效策略。

有研究[4]報道了中草藥銀杏可作為免疫調(diào)節(jié)劑，是治療類風濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的潛在藥物。銀杏素(ginkgetin)是從銀杏葉中提取的一種天然雙黃酮類化合物，已被證明具有抗炎、抗真菌、抗癌、增強免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護活性等作用，在多種疾病治療中具有廣泛的應(yīng)用前景[5]。目前銀杏素對類風濕關(guān)節(jié)炎的治療作用尚不明確。本研究擬從體內(nèi)和體外探討銀杏素在TNF-α誘導(dǎo)的FLS炎癥模型和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型中的作用和機制，以期為RA的治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：選取SPF級健康雄性Sprague Dawley大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院動物實驗中心提供。所有大鼠均飼養(yǎng)在標準環(huán)境中：12 h明暗循環(huán)，室溫(22±2)℃，可自由進食和飲水。本研究所有實驗經(jīng)西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院動物倫理委員會審核批準。

1.1.2試劑與儀器：試劑：銀杏素(美國Sigma-Aldrich)；茴香霉素(美國Sigma-Aldrich)；MH7A細胞(中國廣州Jennio Biotech)；si-TRAF3和其陰性對照(中國上海GenePharma)；胎牛血清和DMEM(美國Gibco)；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(美國BD Biosciences)；ELISA試劑盒(美國R&D Systems)；蛋白抗體(美國Abcam)；裂解緩沖液及BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國上海Beyotime)。儀器：流式細胞儀(美國BD Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1銀杏素溶液的制備：用二甲基亞砜(DMSO)溶解銀杏素以制備50 mmol/L儲備溶液，再用無血清DMEM培養(yǎng)基溶解至實驗濃度，DMSO的終濃度小于0.1 %。銀杏素溶液通過0.22 μm過濾器除菌并儲存在- 4 ℃。

1.2.2細胞培養(yǎng)、處理和轉(zhuǎn)染:成纖維樣滑膜細胞MH7A孵育在含有10 %胎牛血清和抗生素(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)的DEME培養(yǎng)基中，置于含有5 % CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此外，用10 ng/mL的TNF-α刺激MH7A細胞來模擬RA的局部炎癥。利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑并根據(jù)說明將si-TRAF3及其陰性對照scramble轉(zhuǎn)染到MH7A細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3CCK-8檢測細胞活力與增殖：將2×104個細胞接種于96孔板，于培養(yǎng)第24、48和 72 h向每個孔中加入10 μL CCK-8試劑，在含有5 % CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，通過酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：收集處理后的MH7A細胞，PBS洗滌兩次，以2×105個細胞/mL的濃度將細胞重懸于100 μL結(jié)合緩沖液中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，于4 ℃避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5CIA大鼠模型構(gòu)建及藥物處理：在30只SD大鼠中隨機選取8只為對照(Control)組，剩余22只用于建立CIA大鼠模型。CIA大鼠模型構(gòu)建：參照先前文獻報道的方法[6]，將牛II型膠原溶解在0.05 mol/L乙酸溶液中至終濃度為2 mg/mL，4 ℃下過夜充分溶解，再與等體積的弗氏不完佐劑于冰浴中混合，得到終濃度為1 mg/mL的膠原乳劑，首次于大鼠尾根部皮下注射200 μL膠原乳劑，第8天再次注射200 μL加強免疫。Control組用等量的生理鹽水處理。該模型在18只大鼠中成功建立，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分>6分。然后，隨機選擇16只造模成功的SD大鼠，分為CIA組(n=8)和CIA+銀杏素組(n=8)。于造模第22天開始，CIA+銀杏素組大鼠每天口服給藥銀杏素100 mg/kg，連續(xù)21 d。同時，Control組和CIA組大鼠每天口服等量的生理鹽水。造模第42天，三組大鼠全部存活，將大鼠安樂死，收集大鼠關(guān)節(jié)組織用于后續(xù)實驗。

1.2.6關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分:造模后每隔7天對大鼠關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)生及嚴重程度進行評分，采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評分方法(0～4分)：0分：無紅腫；1分：小趾關(guān)節(jié)輕度發(fā)紅或腫脹；2分：小趾和足趾關(guān)節(jié)腫脹，發(fā)紅；3分：踝關(guān)節(jié)以下的整個足爪全部腫脹和發(fā)紅；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)整個足部嚴重腫脹和發(fā)紅，喪失活動能力。每只大鼠四肢評分相加計算AI值，超過6分可判斷為模型成功誘導(dǎo)。

1.2.7關(guān)節(jié)腫脹度測定:采用水容積法測量大鼠關(guān)節(jié)腫脹度，從造模開始每7天測量一次大鼠后足容積，記錄容積值，直至實驗結(jié)束。計算其關(guān)節(jié)腫脹度。關(guān)節(jié)腫脹度表示為當前容積與造模前容積的差值。

1.2.8病理學(xué)觀察:造模第42天，處死所有大鼠，將踝關(guān)節(jié)組織在10 %甲醛溶液中固定24 h，EDTA脫鈣，石蠟包埋，制備組織切片，HE(hematoxylin and eosin)染色，顯微鏡下觀察病理形態(tài)。

1.2.9酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測IL-6和IL-1β含量：收集處理后的MH7A細胞和關(guān)節(jié)組織樣品上清液，根據(jù)使用說明，用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒檢測TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。

1.2.10Western blotting檢測蛋白表達：使用RIPA裂解緩沖液裂解MH7A細胞以及大鼠滑膜組織并提取總蛋白。總蛋白質(zhì)濃度通過BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒進行定量。將等量的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，在37 ℃下，用5 %脫脂奶室溫封閉2 h。然后將膜與以下抗體在4 ℃孵育過夜：anti-TRAF3(1∶1 000, Abcam，ab239357)，anti-p38(1∶1 000，Abcam，ab170099)，anti-p-p38(1∶1 000，Abcam，ab178867)和anti-GAPDH(1∶2 500，Abcam，ab9485)。用TBST緩沖液洗滌后，與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二級抗體(1∶2 000，Abcam，ab6721)在37 ℃下孵育1 h。用TBST洗滌后，用ECL檢測試劑將蛋白條帶可視化，使用Image LabTM軟件定量分析蛋白條帶的強度，計算目標蛋白的相對表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果用平均值±平均值的標準誤差(SEM)表示，組間數(shù)據(jù)差異用t檢驗(兩組間比較)和單因素方差分析(多組間比較)。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀杏素降低TNF-α刺激的MH7A細胞活力

圖1A為銀杏素的分子結(jié)構(gòu)。用TNF-α刺激MH7A細胞建立炎癥模型，用不同濃度的銀杏素處理48 h后檢測細胞活力。如圖1B所示，TNF-α刺激增強MH7A細胞活力，而銀杏素以劑量依賴性的方式降低TNF-α刺激的MH7A細胞活力，其濃度為40 μmol/L時對細胞增殖的抑制作用最為明顯。

圖1 銀杏素降低TNF-α刺激的MH7A細胞活力Fig.1 Ginkgetin reduces TNF -α-stimulated MH7A cell viability注：A：銀杏素的分子結(jié)構(gòu)；B：不同濃度銀杏素對降低TNF-α刺激的MH7A細胞活力影響。與未受任何處理的MH7A細胞活力比較，*P<0.05；與TNF-α刺激的MH7A細胞活力比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 銀杏素抑制TNF-α刺激的MH7A細胞增殖和炎癥因子分泌，促進細胞凋亡

與對照組相比，TNF-α刺激導(dǎo)致MH7A細胞增殖增強(圖2A)，凋亡減少(圖2B)，炎癥因子IL-6和IL-1β分泌增加(圖2C、圖2 D)。而40 μmol/L銀杏素處理能夠顯著抑制TNF-α刺激的MH7A細胞增殖和炎癥因子分泌，促進細胞凋亡。

2.3 銀杏素通過上調(diào)TRAF3抑制TNF-α刺激的MH7A細胞增殖和炎癥因子分泌，促進細胞凋亡

用銀杏素單獨或與si-TRAF3共同處理TNF-α刺激的MH7A細胞。Western blotting結(jié)果表明，TNF-α刺激降低了TRAF3表達，而銀杏素處理上調(diào)TRAF3表達，轉(zhuǎn)染si-TRAF3則逆轉(zhuǎn)銀杏素對TRAF3表達的促進作用(圖3A)。此外，銀杏素抑制了TNF-α刺激的MH7A細胞增殖(圖3B)，促進細胞凋亡(圖3C)，抑制了炎癥因子IL-6和IL-1β分泌(圖3D、圖3E)。而轉(zhuǎn)染si-TRAF3顯著逆轉(zhuǎn)了銀杏素對MH7A細胞增殖、凋亡和炎癥因子分泌的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明銀杏素能夠通過上調(diào)TRAF3抑制TNF-α刺激的MH7A細胞增殖和炎癥因子分泌，促進凋亡。

圖2 銀杏素調(diào)節(jié)TNF-α刺激的MH7A細胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)Fig.2 Ginkgetin modulates TNF -α-stimulated MH7A cell proliferation, apoptosis, and inflammatory response注：A：CCK-8法檢測MH7A細胞增殖；B：流式細胞儀檢測MH7A細胞凋亡；C：ELISA 檢測MH7A細胞培養(yǎng)上清液IL-6含量；D：ELISA 檢測MH7A細胞培養(yǎng)上清液IL-1β含量。*P<0.05，**P<0.01。

圖3 銀杏素通過上調(diào)TRAF3調(diào)節(jié)TNF-α刺激的MH7A細胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)Fig.3 Ginkgetin modulates TNF-α-stimulated MH7A cell proliferation, apoptosis, and inflammatory response by upregulating TRAF3 expression注：A：Western blotting 檢測TRAF3蛋白表達；B：CCK-8法檢測MH7A細胞增殖；C：流式細胞儀檢測MH7A細胞凋亡；D：ELISA 檢測MH7A細胞培養(yǎng)上清液IL-6含量；E：ELISA 檢測MH7A細胞培養(yǎng)上清液IL-1β含量。*P<0.05，**P<0.01。

2.4 銀杏素通過阻斷p38 MAPK通路抑制TNF-α刺激的MH7A細胞增殖和炎癥因子分泌，促進凋亡

圖4 銀杏素通過阻斷p38 MAPK通路調(diào)節(jié)TNF-α刺激的MH7A細胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)Fig.4 Ginkgetin modulates TNF-α-stimulated MH7A cell proliferation, apoptosis, and inflammatory response by blocking the p38 MAPK pathway注：A：Western blotting 檢測p-p38/p38蛋白表達；B：CCK-8法檢測MH7A細胞增殖；C：流式細胞儀檢測MH7A細胞凋亡；D：ELISA 檢測MH7A細胞培養(yǎng)上清液IL-6含量；E：ELISA 檢測MH7A細胞培養(yǎng)上清液IL-1β含量；F：Western blotting 檢測p-p38/p38、p-p65/p65和p-JNK/JNK蛋白表達。*P<0.05，**P<0.01。

為了探究銀杏素對p38 MAPK信號通路的影響，用銀杏素單獨或與p38激動劑茴香霉素共同處理TNF-α刺激的MH7A細胞。Western blotting結(jié)果表明，TNF-α刺激增強了p-p38蛋白表達，p38 MAPK信號通路被激活。而銀杏素處理抑制了p-p38蛋白表達，阻斷p38 MAPK信號通路。用茴香霉素處理則逆轉(zhuǎn)銀杏素對p-p38蛋白表達和p38 MAPK信號通路的抑制作用(圖4A)。此外，茴香霉素處理顯著逆轉(zhuǎn)了銀杏素處理導(dǎo)致的MH7A細胞增殖降低(圖4B)，使凋亡(圖4C)、炎癥因子IL-6和IL-1β分泌增加(圖4 D、圖4E)。同時，筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-TRAF3顯著減弱了銀杏素對p38 MAPK信號通路的抑制作用(圖4F)。此外，本研究還檢測了銀杏素通過上調(diào)TRAF3對NF-κB和JNK信號通路的影響，如圖4F所示，TNF-α刺激增加了p-p65和p-JNK蛋白表達，NF-κB和JNK信號通路被激活。而銀杏素處理對p-p65和p-JNK蛋白表達沒有明顯的抑制作用，且轉(zhuǎn)染si-TRAF3對p-p65和p-JNK蛋白表達沒有明顯的促進作用。這些結(jié)果表明銀杏素能夠通過阻斷p38 MAPK通路抑制TNF-α刺激的MH7A細胞增殖和炎癥因子分泌，促進凋亡。

2.5 銀杏素通過上調(diào)TRAF3緩解CIA大鼠的關(guān)節(jié)癥狀

用膠原誘導(dǎo)建立CIA大鼠模型，探究銀杏素對RA的作用及機制。與對照組相比，大鼠造模后關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和足爪腫脹度不斷升高，于造模后第21天達到最高值，大鼠的雙側(cè)足爪關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯發(fā)紅和腫脹。造模第22天開始每天灌胃銀杏素[50 mg/(kg·d)]治療21 d，與CIA組相比，銀杏素治療的大鼠關(guān)節(jié)炎評分和足爪腫脹度均顯著降低(圖5A、圖5B)?；そM織病理學(xué)評估顯示，對照組呈現(xiàn)清晰光滑的組織，無炎性細胞浸潤和滑膜增生，CIA組表現(xiàn)出明顯的炎性細胞浸潤、滑膜增生和血管翳形成，而銀杏素治療有效地減輕了CIA大鼠的滑膜炎性細胞浸潤以及滑膜增生。此外，Western blotting結(jié)果表明造模42 d后，CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TRAF3蛋白表達降低，銀杏素處理上調(diào)TRAF3蛋白表達(圖5C)。ELISA結(jié)果表明CIA大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥因子TNF-α, IL-6和IL-1β含量明顯升高，而銀杏素處理顯著降低CIA大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥因子的含量(圖5D～圖5F)。上述結(jié)果表明銀杏素能夠通過上調(diào)TRAF3緩解CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎。

圖5 銀杏素通過上調(diào)TRAF3緩解CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎Fig.5 Ginkgolin alleviates arthritis in CIA rats by upregulating TRAF3 expression注：A：CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分；B：CIA大鼠足爪腫脹度；C：Western blotting檢測CIA大鼠滑膜組織TRAF3蛋白表達；D：ELISA檢測CIA大鼠滑膜組織TNF-α含量；E：ELISA檢測CIA大鼠滑膜組織IL-6含量；F：ELISA檢測CIA大鼠滑膜組織IL-1β含量。CIA組相比于Control組，*P<0.05，**P<0.01；CIA+銀杏素組相比于CIA組，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，其特征在于滑膜組織炎癥、滑膜增生以及關(guān)節(jié)軟骨破壞。目前RA的治療藥物有許多，包括傳統(tǒng)的改善疾病的抗風濕藥物和逐漸受到重視的生物制劑，但這些藥物的治療效果仍不是很理想[7]。因此，開發(fā)治療類風濕關(guān)節(jié)炎的新藥一直受到重視。銀杏素是銀杏葉中的一種天然雙黃酮類化合物，對許多疾病具有藥理活性，包括癌癥[8]、動脈粥樣硬化[9]、阿爾茨海默癥[10]以及炎性疾病[11]。此外，銀杏素曾被報道[12]在大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎中表現(xiàn)出較強的抗關(guān)節(jié)炎活性和鎮(zhèn)痛活性，可能是潛在的抗關(guān)節(jié)炎藥。鑒于其抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，本研究探討了銀杏素在TNF-α誘導(dǎo)的FLS炎癥模型和CIA大鼠模型中的作用及機制，結(jié)果表明銀杏素抑制了FLS的細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，同時能夠抑制炎癥因子IL-6和IL-1β分泌。進一步的體內(nèi)研究證明，銀杏素能夠有效緩解CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎。

TNF受體相關(guān)因子3屬于TNF受體相關(guān)因子蛋白家族，是多種炎癥反應(yīng)的負調(diào)節(jié)因子[13]。先前研究[14]發(fā)現(xiàn)TRAF3能夠顯著抑制IL-17誘導(dǎo)的NF-κB和MAPKs活化，在TRAF3轉(zhuǎn)基因小鼠中，消除IL-17對軟骨的破壞作用，提示TRAF3是軟骨退化和骨關(guān)節(jié)炎的潛在新治療靶標。此外，有研究[15]報道了CIA大鼠滑膜免疫炎性損傷與TRAF3低表達相關(guān)，中藥處方藤莓湯可能通過上調(diào)TRAF3表達抑制NF-κB信號通路激活，進而抑制炎癥反應(yīng)，改善CIA模型大鼠滑膜免疫炎性損傷。值得注意的是，有研究[16]發(fā)現(xiàn)一種天然黃酮類化合物槲皮素，能夠通過上調(diào)TRAF3表達抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠有明顯的抗銀屑病作用。銀杏素也屬于黃酮類化合物，因此筆者推測銀杏素緩解CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的作用機制可能與調(diào)節(jié)TRAF3表達相關(guān)。本研究結(jié)果表明在TNF-α誘導(dǎo)的FLS炎癥細胞模型和CIA大鼠模型中，銀杏素上調(diào)了TRAF3表達，進而調(diào)節(jié)FLS增殖、凋亡和炎癥因子分泌，減輕CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎。

絲裂原活化蛋白激酶MAPK通路的激活與炎癥反應(yīng)有關(guān)。越來越多的研究[17-18]報道了p38 MAPK信號通路是RA中介導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥和軟骨損傷的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)途徑，它參與持續(xù)炎癥、滑膜增殖、血管翳形成和關(guān)節(jié)破壞，是促進RA發(fā)生和發(fā)展的重要因素。研究報道在CIA大鼠中，LXA4能夠抑制p-p38表達并阻斷p38 MAPK信號通路。LXA4和SB203580(p38抑制劑)均降低了CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分以及炎癥因子分泌，而茴香霉素(p38激動劑)可以逆轉(zhuǎn)LXA4對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥的保護作用。因此，p38 MAPK通路是RA治療的潛在有效靶標[19]。值得注意的是，之前的研究[20]證明了TRAF3是MAPK信號傳導(dǎo)的負調(diào)節(jié)因子。本研究表明TRAF3表達下調(diào)與RA相關(guān)，銀杏素通過上調(diào)TRAF3表達，抑制p-p38蛋白表達，阻斷p38 MAPK信號通路，抑制FLS增殖并誘導(dǎo)凋亡，同時抑制炎癥因子IL-6和IL-1β分泌，進而減輕CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在TNF-α誘導(dǎo)的FLS炎癥細胞模型和CIA大鼠模型中，TRAF3表達下調(diào)，而銀杏素通過上調(diào)TRAF3表達，抑制了FLS增殖并誘導(dǎo)凋亡，同時抑制炎癥因子IL-6和IL-1β分泌，減輕CIA大鼠的關(guān)節(jié)癥狀，其機制與TRAF3介導(dǎo)的p38 MAPK通路失活有關(guān)。