馮秀芝 吳繼雷 藥曉雨 任艷玲*

1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110847 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的發(fā)病機(jī)制研究逐步深入，可概括為骨代謝穩(wěn)態(tài)失衡。根據(jù)中醫(yī)學(xué)腎之精氣、陰陽(yáng)理論，女性在絕經(jīng)后，腎精虧虛，天癸竭絕，加之陰陽(yáng)關(guān)系失衡，出現(xiàn)骨髓空虛，任物無(wú)力。左歸丸和右歸丸是明代張景岳創(chuàng)制的經(jīng)典名方，用藥注重陰陽(yáng)既濟(jì)，能顯著改善PMOP患者血清學(xué)和組織學(xué)指標(biāo)。前期實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)左、右歸丸能促進(jìn)PMOP大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化，然而作用機(jī)制尚不十分明確。AMP(adenosine 5'-monophosphate ) 依賴的蛋白激酶(AMPK)是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，是細(xì)胞內(nèi)最重要的能量感受器，對(duì)維持細(xì)胞的能量平衡具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，幾乎參與細(xì)胞所有的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，是研究代謝性疾病的核心。本研究將基于AMPK/mTOR信號(hào)通路探討左、右歸丸對(duì)去卵巢大鼠BMSCs成骨分化的影響，以期闡明左、右歸丸治療PMOP的部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)2月齡雌性大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)買(mǎi)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，經(jīng)營(yíng)許可證號(hào)為SCXK(遼)2015-0001。

1.1.2藥物組成：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用中藥飲片均購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。左歸丸方劑組成：熟地黃24 g、山萸肉12 g、麩炒山藥12 g、枸杞12 g、牛膝9 g、菟絲子12 g、龜甲膠12 g、鹿角膠12 g(《中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)》)；右歸丸方劑組成：熟地黃24 g、麩炒山藥12 g、山萸肉12 g、枸杞12 g、菟絲子12 g、黑順片6 g、肉桂6 g、當(dāng)歸9 g、杜仲9 g、鹿角膠12 g(《中華人民共和國(guó)藥典》2015版·第一部)。將上述藥方用蒸餾水煎煮，制成濃縮煎劑。補(bǔ)佳樂(lè)(戊酸雌二醇片，生產(chǎn)企業(yè)：DELPHARM Lille S.A.S.藥品批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20171038)研磨成粉末狀，加入蒸餾水，按照一定體積制成混懸液。

1.1.3儀器與試劑：倒置顯微鏡(Leica，美國(guó))，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))，流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，生物安全柜(Thermo，美國(guó))；改良型α-MEM培養(yǎng)液(HyClone)，胎牛血清(SERANA，S-FBS-SA-015，德國(guó))，0.25 %胰蛋白酶(Sigma)，APC anti-mouse/rat CD29，PerCP/Cyanine5.5 anti-rat CD90/mouse CD90.1 (Thy-1.1) Antibody，PE anti-rat CD11b/c ，PE/Cy7 anti-rat CD45 Antibody，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)試劑盒(Solarbio，貨號(hào)BC2142)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理方案：將60只2月齡雌性SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白組(KB)、假手術(shù)組(SHAM)、模型組(OVX)、補(bǔ)佳樂(lè)組(BJL)、右歸丸組(YGW)、左歸丸組(ZGW)，每組10只。于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(室溫20 ℃～25 ℃，濕度30 %～35 %)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，除KB組和SHAM組外，進(jìn)行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，SHAM組模擬手術(shù)過(guò)程，僅摘除卵巢附近少許脂肪組織，KB組不做處理，術(shù)后3 d開(kāi)始灌胃給藥。根據(jù)“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值”，換算得出各給藥組以成人給藥量的6.3倍(以單位體重計(jì))劑量進(jìn)行灌胃給藥，具體如下：BJL組、YGW組、ZGW組分別按照0.09 mg/kg、10.26 g/kg、9.45 g/kg的灌胃量給藥，生藥量為1 g/mL。SHAM組和OVX組以1 g/kg蒸餾水灌胃，每日1次，灌胃12周。

1.2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及成骨分化誘導(dǎo):以上述方案灌胃12周后，取大鼠股骨與脛骨BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，以差時(shí)貼壁法得到大鼠原代BMSCs，待原代細(xì)胞融合至85 %～90 %時(shí)進(jìn)行首次傳代，于第三代進(jìn)行細(xì)胞鑒定并加入成骨分化誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，9 d后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。取材具體操作方案及成骨分化誘導(dǎo)液組成與前期實(shí)驗(yàn)相同[1]。

1.2.3BMSCs鑒定：取生長(zhǎng)期細(xì)胞觀察細(xì)胞形態(tài)；將P3代細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，分別加入APC anti-mouse/rat CD29、PerCP/Cyanine5.5 anti-rat CD90、PE anti-rat CD11b/c ，PE/Cy7 anti-rat CD45，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4ALP活性檢測(cè)：用堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組ALP活性。取成骨誘導(dǎo)10 d細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 ℃、10 000 r/min 離心8 min，取上清液待測(cè)。按試劑盒操作步驟將相應(yīng)試劑和待測(cè)樣品按順序混勻，并設(shè)空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔，于 510 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算各組堿性磷酸酶活性。

1.2.5BMSCs成骨誘導(dǎo)后礦化結(jié)節(jié)的觀察：取P3代細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后以5×107/L接種于24孔板，以成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)9 d后棄培養(yǎng)液，以PBS清洗2次，以乙醇(95 %)固定10 min，PBS清洗3次后進(jìn)行茜素紅染色，自來(lái)水沖洗并常溫干燥后于顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。

1.2.6Runx 2蛋白、AMPK /mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)：取成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)9 d細(xì)胞，以PBS清洗3次，甩干，將細(xì)胞刮至一角，每瓶(25 cm2)細(xì)胞加入100 μL細(xì)胞裂解液，冰上靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清；配制SDS-PAGE分離膠，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性后，每孔上樣25 μL，電泳后用半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜3 h，封閉液封閉后，Ⅰ抗(稀釋比：Runx 2、p70S6K1、p-p70S6K1為1∶500，AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR為1∶1 000)37 ℃孵育1 h，4 ℃過(guò)夜后，用TBST溶液清洗5次，置Ⅱ抗孵育液中37 ℃孵育1 h，用TBST溶液清洗3次，暗室加入ECL發(fā)光液，曝光，掃描圖像，檢測(cè)條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶的吸光度比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察

原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h后少量細(xì)胞貼壁，呈透亮圓形，3 d后貼壁細(xì)胞增多，5 d后進(jìn)行首次換液，貼壁細(xì)胞形成許多突觸，細(xì)胞呈多角形、扁長(zhǎng)的菱形或梭形，傳代后細(xì)胞融合，呈長(zhǎng)梭形，可見(jiàn)旋渦狀分布。見(jiàn)圖1。

圖1 BMSCs倒置顯微鏡下形態(tài)Fig.1 The morphology of BMSCs under an inverted microscope注：A：P2代2 d，B：P3代4 d。

圖2 BMSCs流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果Fig.2 Flow cytometry identification results of BMSCs

2.2 BMSCs的流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果

P3代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原，結(jié)果是APC anti-mouse/rat CD29和PerCP/Cyanine5.5 anti-rat CD90呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別是99.7 %和99.5 %；PE anti-rat CD11b/c和PE/Cy7 anti-rat CD45呈陰性，陰性率分別是3.3 %和1.2 %。見(jiàn)圖2。

2.3 左、右歸丸對(duì)去卵巢大鼠BMSCs ALP活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KB組與SHAM組比較，ALP活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)；OVX組與SHAM組比較，ALP活性明顯降低，有顯著性差異(P<0.05)；與OVX組比較，三個(gè)用藥組均能提高ALP活性，有顯著性差異(P<0.05)；三個(gè)用藥組比較，ZGW組提高ALP活性作用最明顯，BJL組與YGW組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 左、右歸丸對(duì)去卵巢大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)后礦化結(jié)節(jié)的影響

與KB組比較，OVX組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少；與OVX組比較，三個(gè)用藥組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多，且ZGW組優(yōu)于YGW組，YGW組優(yōu)于BJL組。見(jiàn)圖3。

表1 各組BMSCs成骨誘導(dǎo)后ALP活性

圖3 左、右歸丸對(duì)BMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)形成的影響Fig.3 Effect of Zuo and Yougui Pills on the formation of mineralized nodules by alizarin red staining after osteoinduction of BMSCs

2.5 左、右歸丸對(duì)去卵巢大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)后Runx 2蛋白表達(dá)的影響

與KB組比較，OVX組Runx 2蛋白表達(dá)水平下降，有顯著性差異(P<0.05)；與OVX組比較，各用藥組Runx 2蛋白表達(dá)水平均有不同程度的升高，說(shuō)明各用藥組均能促進(jìn)去卵巢大鼠BMSCs的成骨分化，有顯著性差異(P<0.05)，其中BJL組和ZGW組優(yōu)于YGW組，BJL組和ZGW組無(wú)顯著性差異。見(jiàn)圖4。

圖4 左、右歸丸對(duì)BMSCs成骨誘導(dǎo)后Runx2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 The effect of Zuo and Yougui pills on the expression of Runx2 protein after BMSCs osteoinduction注：與KB組比較，●P<0.05；與OVX組比較，★P<0.05；與BJL組比較，□P<0.05；與YGW組比較，△P<0.05。

2.6 左、右歸丸對(duì)去卵巢大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)后AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與KB組比較，OVX組AMPKα蛋白磷酸化水平升高，有顯著性差異(P<0.05)；與OVX組比較，各用藥組AMPKα蛋白磷酸化水平均有不同程度的降低，有顯著性差異(P<0.05)；與BJL組比較，ZGW組和YGW組AMPKα蛋白磷酸化水平降低，有顯著性差異(P<0.05)；ZGW組和YGW組比較無(wú)顯著性差異。見(jiàn)圖5。

與KB組比較，OVX組mTOR蛋白磷酸化水平降低，有顯著性差異(P<0.01)；與OVX組比較，三個(gè)用藥組mTOR蛋白磷酸化水平升高，有顯著性差異(P<0.05)；三個(gè)用藥組相比，BJL組和ZGW組mTOR蛋白磷酸化水平高于YGW組，有顯著性差異(P<0.05)，BJL組與ZGW組相比無(wú)顯著性差異。見(jiàn)圖6。

與KB組比較，OVX組p70S6K1蛋白磷酸化水平降低，有顯著性差異(P<0.05)；與OVX組比較，各用藥組p70S6K1蛋白磷酸化水平均有不同程度的升高，有顯著性差異(P<0.05)；三個(gè)用藥組相比，BJL組與YGW組無(wú)顯著性差異，ZGW組p70S6K1蛋白磷酸化水平明顯高于BJL組和YGW組，有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

圖5 左、右歸丸對(duì)BMSCs成骨誘導(dǎo)后AMPKα蛋白磷酸化水平的影響Fig.5 The effect of Zuo and Yougui pills on AMPKα protein phosphorylation after osteoinduction of BMSCs注：與KB組比較，●P<0.05；與OVX組比較，★P<0.05；與BJL組比較，□P<0.05。

圖6 左、右歸丸對(duì)BMSCs成骨誘導(dǎo)后mTOR蛋白磷酸化水平的影響Fig.6 The effect of Zuo and Yougui pills on the phosphorylation level of mTOR protein after osteoinduction of BMSCs注：與KB組比較，●P<0.05；與OVX組比較，★P<0.05；與BJL組比較，□P<0.05；與YGW組比較，△P<0.05。

圖7 左、右歸丸對(duì)BMSCs成骨誘導(dǎo)后p70s6k1蛋白表達(dá)水平的影響Fig.7 The effect of Zuo and Yougui pills on the expression of p70s6k1 protein after osteogenic induction of BMSCs注：與KB組比較，●P<0.05；與OVX組比較，★P<0.05；與BJL組比較，□P<0.05；與YGW組比較，▽P<0.05。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為女性絕經(jīng)后雌激素水平的驟然下降是PMOP發(fā)生的主要原因，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究皆顯示外源性雌激素或雌激素受體調(diào)節(jié)劑能通過(guò)多種作用機(jī)制抑制破骨細(xì)胞活性、提高成骨細(xì)胞的骨形成作用，提高骨密度，從而有效防治PMOP。但雌激素治療會(huì)帶來(lái)許多副作用，如增加子宮內(nèi)膜增生、冠狀動(dòng)脈疾病和靜脈血栓栓塞等的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PMOP以腎精虧虛為本，繼之陰陽(yáng)失衡，“陽(yáng)化氣、陰成形”功能失調(diào)，從而出現(xiàn)相關(guān)的病機(jī)變化和臨床癥狀，中醫(yī)藥防治PMOP有確切的臨床療效[3]。左、右歸丸為PMOP(骨痿)中醫(yī)藥診療指南(2019年版)推薦用藥[4]。左、右歸丸基于“精不足者，補(bǔ)之以味”“陰陽(yáng)既濟(jì)”立法，其中左歸丸以滋補(bǔ)腎之陰精為主，輔之以溫陽(yáng)；右歸丸以溫補(bǔ)腎陽(yáng)為主，輔之以滋陰?！瓣?yáng)化氣，陰成形”高度概括了陰陽(yáng)之功能，陽(yáng)氣主動(dòng)，在機(jī)體生長(zhǎng)壯老已的新陳代謝活動(dòng)中主要發(fā)揮氣化推動(dòng)作用；陰精主靜，構(gòu)成有形物質(zhì)本身，并主有形物質(zhì)的化生。左、右歸丸通過(guò)補(bǔ)腎填精，或以滋補(bǔ)陰精為主，輔以溫陽(yáng)，陽(yáng)中求陰，或以溫補(bǔ)腎陽(yáng)為主，輔以滋陰，陰中求陽(yáng)，以期陰陽(yáng)互濟(jì)，糾正PMOP陰陽(yáng)功能失衡的病理狀態(tài)。

AMPK/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞能量代謝的調(diào)控樞紐，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)具有極其重要的意義。mTOR即哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[5]。AMPK是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，被激活后通過(guò)磷酸化TSC2、抑制mTOR信號(hào)通路從而抑制細(xì)胞的合成代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)，而上調(diào)細(xì)胞分解代謝相關(guān)基因，增強(qiáng)細(xì)胞的自噬水平，從而促進(jìn)細(xì)胞能量產(chǎn)生，減少能量消耗，恢復(fù)AMP/ATP比值，以適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化[6-9]。文獻(xiàn)研究[10-11]顯示，激活A(yù)MPK能明顯抑制BMSCs的成骨分化，但亦有相反狀況。也有研究[12]顯示過(guò)度激活A(yù)MPK能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨并通過(guò)AMPK-Gfi1-OPN軸抑制3T3-L1細(xì)胞的成脂。一項(xiàng)糖尿病相關(guān)的骨丟失機(jī)制的研究[13]發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有Mst1/2激酶的情況下，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1的表達(dá)會(huì)丟失，并導(dǎo)致AMPK的激活和Runx2蛋白酶體的降解。另一方面有研究[14]提示AMPK的激活對(duì)成骨分化的促進(jìn)或抑制作用與時(shí)間相關(guān)，顱骨成骨細(xì)胞和MC-3T3細(xì)胞在分化早期表達(dá)激活的AMPK，但是持續(xù)性激活的AMPK則會(huì)抑制成骨分化；他們的后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)成骨分化的早期需要激活A(yù)MPK，促進(jìn)分解代謝保證分化早期成骨細(xì)胞的能量需求，但在第9天后則需要下調(diào)AMPK的磷酸化，以滿足分化后期合成代謝的需要。也有研究者[15]認(rèn)為骨代謝與能量代謝之間具有更為復(fù)雜的關(guān)系，而不是簡(jiǎn)單的促進(jìn)或抑制。因此，AMPK的激活對(duì)成骨分化的具體影響及其機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

前期研究[16-18]結(jié)果顯示，左、右歸丸能有效干預(yù)PMOP大鼠BMSCs的成骨與成脂分化平衡，二者均能促進(jìn)PMOP大鼠BMSCs的成骨分化，且左歸丸優(yōu)于右歸丸；二者均能抑制BMSCs的成脂分化，并且與TGF-β/Smad以及Smad-ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)有關(guān)。本課題體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與KB組比較，OVX組大鼠腰椎骨密度明顯降低，骨組織形態(tài)改變，骨小梁數(shù)量減少，排列紊亂，骨髓腔增大；左、右歸丸能增加PMOP大鼠腰椎骨質(zhì)密度，改善PMOP大鼠股骨組織形態(tài)，以左歸丸效果最為明顯；左、右歸丸能影響OVX大鼠的脂質(zhì)代謝、脂肪組織分布及形態(tài)，以右歸丸效果更明顯；左、右歸丸對(duì)PMOP大鼠骨髓組織PICP、OPG、TRAP、RANKL等骨代謝指標(biāo)均有不同程度的影響，上述影響皆與AMPK/mTOR信號(hào)通路有關(guān)[19-21]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，左、右歸丸能提高去卵巢大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)后ALP活性，明顯增加其成骨誘導(dǎo)后礦化結(jié)節(jié)的形成，并能提高其Runx 2蛋白的表達(dá)水平，因此，左、右歸丸能促進(jìn)去卵巢大鼠BMSCs的成骨分化，改善成骨誘導(dǎo)后的骨形成指標(biāo)，以左歸丸效果更佳，其中的作用機(jī)制可能是通過(guò)AMPK /mTOR信號(hào)通路參與了BMSCs的成骨分化。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析得出OVX組AMPKα蛋白的磷酸化水平較KB組顯著升高，mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化水平則降低，激活了細(xì)胞的能量代謝過(guò)程，抑制了細(xì)胞的合成代謝。左、右歸丸均能降低AMPKα蛋白的磷酸化水平，從而激活mTOR信號(hào)通路，提高mTOR和p70S6K1蛋白的磷酸化水平。因此左、右歸丸可能通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路抑制細(xì)胞的分解代謝，促進(jìn)其合成代謝，提高BMSCs的成骨分化能力，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的成熟、功能和活性，從而調(diào)整BMSCs的骨脂分化平衡。

綜上所述，左歸丸在影響PMOP大鼠BMSCs的骨脂分化平衡方面效果優(yōu)于右歸丸，而右歸丸在調(diào)節(jié)PMOP大鼠脂質(zhì)代謝方面的作用優(yōu)于左歸丸，近年來(lái)，骨髓脂肪組織在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮的作用正引起人們的關(guān)注，右歸丸防治PMOP的作用機(jī)制除了影響B(tài)MSCs的骨脂分化平衡外，對(duì)骨髓脂肪組織的形成及生物學(xué)調(diào)控作用的影響將是下一步的研究方向。