鮑哲明 單青 李晨 陳孟莉*

1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院，北京 100089 2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第960醫(yī)院骨科，山東 濟(jì)南 250031

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種由年齡、創(chuàng)傷、炎癥等多種因素相互作用引起的關(guān)節(jié)軟骨退行性改變，軟骨損傷是OA的重要表現(xiàn)，OA的病理、生理改變不止是軟骨的損傷修復(fù)，同時(shí)也存在關(guān)節(jié)軟骨下骨的結(jié)構(gòu)改變，在OA的形成和發(fā)展病理過(guò)程中相互促進(jìn)、相互影響[1]。大量研究[2]證明軟骨下骨結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)改變與軟骨退變存在一定的相關(guān)性。

動(dòng)物模型是研究骨關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制和治療的常用方法之一，主要分為藥物誘導(dǎo)、關(guān)節(jié)制動(dòng)、手術(shù)誘導(dǎo)和自發(fā)性O(shè)A、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等[3]。碘乙酸鈉(monosodium Iodoacetate, MIA)作為一種甘油醛-3-磷酸脫氫酶抑制劑，能夠抑制軟骨細(xì)胞代謝，引起軟骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解。MIA誘導(dǎo)的大鼠OA模型會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的破壞，軟骨下骨結(jié)構(gòu)損傷、炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)疼痛等改變[4]。

本研究采用大鼠膝關(guān)節(jié)腔中注射MIA的方法建立大鼠OA模型，并通過(guò)Micro-CT以及組織切片等途徑來(lái)觀察關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的改變，探討MIA造模后不同時(shí)段OA模型的病理改變以及OA不同階段軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的變化特點(diǎn)，進(jìn)一步明確軟骨改變對(duì)軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取SPF級(jí)8周齡雄性Wistar大鼠36只，體重為240～260 g，許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010，飼養(yǎng)于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，能夠自由活動(dòng)、攝食和飲水。本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)為SQ2020127。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材：碘乙酸鈉(阿拉丁，中國(guó))，4 %多聚甲醛溶液(Servicebio，中國(guó))，10 % EDTA溶液(Servicebio，中國(guó))，甲苯胺藍(lán)染液(Servicebio，中國(guó))，番紅固綠染液(Servicebio，中國(guó))；微量進(jìn)樣器(50 μL，上海安亭，中國(guó))，小動(dòng)物Micro-CT(Quantum GX，PerkinElmer，美國(guó))，光學(xué)顯微鏡(Eclipse E100，尼康，日本)，電子天平(XS105DU，Mettler Toledo，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1分組及處理方法：將36只Wistar大鼠編號(hào)，使用隨機(jī)數(shù)字法分成3組，每組12只，分別為空白對(duì)照組(Sham組)、OA造模2周組(OA-2W組)、OA造模4周組(OA-4W組)。配置60 g/L 濃度MIA的0.9 %生理鹽水溶液。將大鼠腹腔注射45 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。OA造模組采用微量進(jìn)樣器抽取配好的碘乙酸鈉溶液50 μL，于右膝關(guān)節(jié)髕骨下中間偏外側(cè)關(guān)節(jié)間隙斜45 °穿刺后推入MIA溶液，同法Sham組右膝關(guān)節(jié)注射等量生理鹽水溶液。所有大鼠飼養(yǎng)在相同的鼠籠內(nèi)并自由活動(dòng)4周，Sham組和OA-4W組自飼養(yǎng)的第1周開始注射，造模4周；OA-2W組自飼養(yǎng)的第3周時(shí)注射，造模2周。

1.2.2標(biāo)本取材處理：所有大鼠飼養(yǎng)4周后，采用過(guò)量麻醉后頸椎脫臼法處死。固定消毒后，縱行切開大鼠右膝關(guān)節(jié)皮膚、皮下組織，暴露膝關(guān)節(jié)腔。骨剪離斷右側(cè)包含脛骨上端約2 cm的膝關(guān)節(jié)骨頭，去除附著的軟組織、肌肉組織等，隨即放置于4 %多聚甲醛溶液固定48 h備用。

1.2.3Micro CT掃描與分析將取下固定的膝關(guān)節(jié)脛骨豎直平放入樣品槽內(nèi)，使標(biāo)本縱軸垂直于射線。掃描參數(shù)：電流114 mA，電壓70 kV，視野25 mm，體素尺寸50 μm，曝光時(shí)間14 min。將掃描結(jié)果導(dǎo)入Analyze 12.0軟件進(jìn)行骨微結(jié)構(gòu)的定量分析，選取脛骨平臺(tái)下50層厚度為感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，測(cè)量結(jié)果包括松質(zhì)骨的骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁連接密度(connectivity density, Conn.D)，將掃描后的圖像導(dǎo)入Mimics Research 21.0進(jìn)行三維圖像重建，獲得脛骨平臺(tái)圖像。

1.2.4組織學(xué)評(píng)價(jià)：將脛骨近端標(biāo)本放入4 %多聚甲醛溶液中固定48 h后，放入10 % EDTA脫鈣液脫鈣約4周，梯度脫水，浸蠟包埋，所有樣本取冠狀位縱切，厚度4～5 μm。分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色、甲苯胺藍(lán)染色、番紅固綠染色。通過(guò)顯微鏡觀察切片并拍照，OA組織學(xué)評(píng)價(jià)采用OOCHAS(osteoarthritis cartilage histopathology assessment system)評(píng)分方法[5]，由雙盲的獨(dú)立第三者計(jì)數(shù)評(píng)分，每個(gè)標(biāo)本取三張連續(xù)切片觀察計(jì)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT掃描圖像結(jié)果

三維重建圖像可見(jiàn)(圖1)，Sham組關(guān)節(jié)面光滑平整;OA-2W組關(guān)節(jié)面粗糙，可見(jiàn)局部軟骨缺損，部分區(qū)域有潰瘍形成，關(guān)節(jié)周緣少許骨贅形成;OA-4W組可見(jiàn)關(guān)節(jié)表面軟骨大量缺損，關(guān)節(jié)面極度粗糙，軟骨下骨質(zhì)裸露，關(guān)節(jié)周緣大量骨贅形成。

冠狀剖面圖像可見(jiàn)(圖2)，Sham組軟骨下骨小梁結(jié)構(gòu)均勻，排列整齊有序;OA-2W組骨小梁稀疏，出現(xiàn)鏤空現(xiàn)象，且骨小梁變薄，骨小梁連接減少，部分骨小梁結(jié)構(gòu)排列紊亂;OA-4W組骨小梁稀疏程度更加嚴(yán)重，骨小梁間出現(xiàn)大量缺損，部分骨小梁連接中斷，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失。

圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨端Micro-CT三維重建圖像Fig.1 Micro-CT 3D reconstruction image of knee tibia in rats

圖2 大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨端Micro-CT冠狀剖面圖像Fig.2 Micro-CT coronal section image of knee tibia in rats

2.2 軟骨下骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.2.1骨密度與骨量：與Sham組相比，MIA造模后脛骨軟骨下出現(xiàn)了骨密度下降、骨量降低的情況，且隨著造模時(shí)間增加而逐漸加重。Sham組軟骨下松質(zhì)骨BMD平均為(1 367.97±37.43)mg/cc，OA-2W組軟骨下松質(zhì)骨BMD平均為(1 330.66±38.99)mg/cc(t=2.060，P=0.047 6)。而OA-4W組BMD下降至(1 285.5±47.08)mg/cc(t=5.143，P<0.000 1)。Sham組BV/TV平均為(38.22±3.284)%，OA-2W組相比下降至(30.72±5.122)%(t=4.563，P<0.000 1)，OA-4W組持續(xù)下降至(25.81±2.608)%(t=8.068，P<0.000 1)。見(jiàn)圖3。

2.2.2骨小梁結(jié)構(gòu)：與Sham組相比，MIA造模后軟骨下骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)稀疏改變，骨小梁變薄，軟骨下骨質(zhì)疏松進(jìn)一步加重。Sham組Tb.Th平均為(0.191 2±0.029 3)mm，OA-2W組下降至(0.175 0±0.019 4)mm(t=1.074，P=0.291 8)，OA-4W組下降至(0.141 4±0.029 9)mm(t=4.595，P<0.000 1)。Sham組Tb.Sp平均為(0.428 8±0.071 0)mm，OA-2W組升高至(0.475 0±0.090 3)mm(t=1.249，P=0.222 0)，OA-4W組升高至(0.530 7±0.089 3)mm(t=2.945，P=0.006 4)。Sham組Conn.D平均為(57.94±8.050)mm-3，OA-2W組下降至(52.39±8.781)mm-3(t=1.727，P=0.096 0)，OA-4W組下降至(45.48±10.14)mm-3(t=3.368，P=0.002 4)，見(jiàn)圖3。

2.2.3組織切片染色及評(píng)分：通過(guò)顯微鏡下觀察HE染色切片、甲苯胺藍(lán)染色切片和番紅固綠染色切片可見(jiàn)(圖4)，Sham組關(guān)節(jié)表面平整，軟骨細(xì)胞排列整齊。細(xì)胞及軟骨基質(zhì)染色正常，沒(méi)有減退現(xiàn)象；OA-2W組軟骨表面粗糙出現(xiàn)裂隙，軟骨表層變薄，軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈團(tuán)簇樣聚集，軟骨表面纖維化，深層軟骨細(xì)胞出現(xiàn)肥大，空泡狀改變，表層軟骨失染，部分軟骨染色減退；OA造模4周后可見(jiàn)軟骨表面大面積潰瘍?nèi)睋p，部分軟骨下骨質(zhì)裸露，軟骨表面覆蓋大量的纖維素，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂，局灶性細(xì)胞壞死，僅存少數(shù)淡染區(qū)域甚至全部失染。軟骨組織切片OOCHAS評(píng)分，Sham組平均為0(0,1)分，OA-2W組平均為12(9.75,15)分，較Sham組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004 7)，OA-4W組平均為24(20,24)分，較Sham組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。見(jiàn)圖5。

圖3 大鼠脛骨軟骨下骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)Fig.3 Subchondral bone microstructural parameters of knee tibial in rats注：OA-2W組、OA-4W組與空白組之間分別進(jìn)行比較，nsP≥0.05，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。

圖4 大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨軟骨面HE染色切片、甲苯胺藍(lán)染色切片和番紅固綠染色切片F(xiàn)ig.4 HE staining section, toluidine blue staining section and Safranin-Fast Green Staining section of knee tibial cartilage surface in rats注：SBP：軟骨下骨板；AC：關(guān)節(jié)軟骨；比例尺：100 μm。

圖5 大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨軟骨組織OOCHAS評(píng)分Fig.5 OOCHAS score of knee tibial cartilage in rats注：OA-2W組、OA-4W組與空白組之間分別進(jìn)行比較，**P<0.01，****P<0.000 1。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型是研究骨關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制和治療方法的重要途徑。OA模型通常分為自發(fā)性模型和繼發(fā)性模型。繼發(fā)性模型主要包括侵入性模型和非侵入性模型，是目前最為常用的造模方式[6]。侵入性模型包括手術(shù)誘導(dǎo)和化學(xué)誘導(dǎo)兩種方式。手術(shù)誘導(dǎo)的優(yōu)點(diǎn)是可重復(fù)性好，造模時(shí)間短，文獻(xiàn)報(bào)道[7]用于研究的時(shí)間長(zhǎng)，材料方法獲取方便，對(duì)于技術(shù)要求低。缺點(diǎn)是與人類自然發(fā)生的退變性O(shè)A的變化特點(diǎn)相似性較差，存在感染的風(fēng)險(xiǎn)，由于造模速度快，對(duì)于慢性病理特點(diǎn)的研究效果較差；化學(xué)誘導(dǎo)方法無(wú)需手術(shù)，能夠減少潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)，相對(duì)于手術(shù)造模侵入性更小。MIA作為一種甘油醛-3-磷酸脫氫酶抑制劑，是目前最常用的化學(xué)造模方法。Morais等[8]在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA后發(fā)現(xiàn)，OA模型表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的變性和凋亡，能夠造成軟骨損傷，與人體骨關(guān)節(jié)炎癥狀十分相似。很多學(xué)者使用MIA造模后，對(duì)于造模時(shí)間與OA嚴(yán)重程度的關(guān)系，沒(méi)有一個(gè)準(zhǔn)確的判斷，這就給使用動(dòng)物模型研究疾病帶來(lái)了很大的不確定性和困難。既往學(xué)者報(bào)道[9-10]隨著注射MIA濃度劑量增加，OA的嚴(yán)重程度會(huì)逐漸加重，局部關(guān)節(jié)注射1.5～3 mg MIA造模1周后即可產(chǎn)生明顯的OA改變。本研究在使用3 mg MIA膝關(guān)節(jié)注射2周后發(fā)現(xiàn)，大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)了局部軟骨缺損，軟骨表面不規(guī)則，屬于OA疾病中期的病理表現(xiàn)。而在造模4周后可見(jiàn)關(guān)節(jié)表面軟骨大量缺損，軟骨下骨質(zhì)裸露，關(guān)節(jié)周緣大量骨贅形成，屬于晚期的OA程度。

軟骨下骨對(duì)表面的關(guān)節(jié)軟骨起到重要的減震功能，可以通過(guò)重塑在關(guān)節(jié)活動(dòng)期間不斷適應(yīng)機(jī)械環(huán)境的變化，衰減約30 %的關(guān)節(jié)負(fù)荷[11]。既往研究[12]表明，OA發(fā)病過(guò)程中的各種原因可能會(huì)導(dǎo)致軟骨下骨吸收和骨重塑，進(jìn)而引起關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)力改變導(dǎo)致退行性變加重。因此研究OA發(fā)生時(shí)軟骨下骨的骨微結(jié)構(gòu)改變，有助于我們更好的了解骨關(guān)節(jié)炎疾病的病理進(jìn)展特點(diǎn)。

許多研究[13]發(fā)現(xiàn)人體非膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨密度與軟骨厚度間存在正相關(guān)性，即軟骨越薄，軟骨下骨密度越低。在手術(shù)誘導(dǎo)OA造模的研究中，有學(xué)者[14]發(fā)現(xiàn)早期關(guān)節(jié)軟骨下骨及骨小梁厚度降低，骨吸收增加導(dǎo)致骨密度下降，晚期雖然會(huì)有軟骨下骨骨形成增加，骨贅形成，但其下方的松質(zhì)骨丟失嚴(yán)重，骨小梁進(jìn)一步變薄[15]。Siebelt等[16]注射木瓜蛋白酶造模后也發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間推移，軟骨下骨板會(huì)變薄，出現(xiàn)孔隙率增高，骨小梁丟失，骨量降低等表現(xiàn)。本研究通過(guò)使用MIA對(duì)大鼠進(jìn)行OA造模發(fā)現(xiàn)，隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，OA程度逐漸加重，軟骨下骨會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，骨密度下降，松質(zhì)骨會(huì)呈現(xiàn)骨小梁變薄，骨分離度增加，骨小梁連接密度下降的情況，并且這種情況會(huì)隨著OA嚴(yán)重程度加重而逐漸加重。在造模4周后達(dá)到OA的晚期階段，并沒(méi)有出現(xiàn)很多文章中報(bào)道的OA軟骨下骨密度增高的情況[17]。

結(jié)合以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體的相關(guān)研究結(jié)果，筆者推測(cè)在OA早期，骨吸收活躍，新生骨組織礦化率低，會(huì)出現(xiàn)軟骨下骨密度降低，骨小梁變薄，造成骨小梁間隙增大，導(dǎo)致軟骨下骨板結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞。在人體的OA發(fā)展過(guò)程中，早期軟骨下骨小梁連接密度的下降會(huì)造成軟骨下骨在緩沖軟骨受到的應(yīng)力方面能力下降。但隨著人體OA的進(jìn)展，膝關(guān)節(jié)軟骨磨損加重，關(guān)節(jié)會(huì)逐漸通過(guò)代償出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形，促使軟骨下負(fù)重能力發(fā)生改變，為了提供更多的載荷以承載緩沖關(guān)節(jié)承受的沖擊，軟骨下骨發(fā)生代償性致密改變，造成了晚期部分區(qū)域骨密度增高的現(xiàn)象[18]。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA等藥物引起的軟骨損傷退變，由于造模時(shí)間短，病情進(jìn)展快，不會(huì)出現(xiàn)人類自然病情發(fā)展過(guò)程中由于承受膝關(guān)節(jié)應(yīng)力負(fù)荷而導(dǎo)致軟骨下骨代償性骨密度增加的情況。本研究對(duì)動(dòng)物進(jìn)行OA造模的時(shí)候，短期內(nèi)就可以模擬OA從輕度到重度的病理改變過(guò)程，軟骨下骨呈現(xiàn)的骨密度下降、骨質(zhì)疏松改變，可能是關(guān)節(jié)內(nèi)炎性破壞本身造成的直接結(jié)果。

本研究采用的是藥物注射形成關(guān)節(jié)內(nèi)炎性反應(yīng)、破壞關(guān)節(jié)軟骨來(lái)模擬OA的形成，相比于手術(shù)造模等其他方法，可能和人體創(chuàng)傷形成的OA存在一定的區(qū)別。另外，在造模的過(guò)程中，由于空白組注射后干預(yù)4周，沒(méi)有設(shè)立同OA造模2周組對(duì)比的空白注射2周組，并且組之間可能存在個(gè)體及活動(dòng)能力的差異，給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)偏倚。

通過(guò)對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)注射MIA進(jìn)行OA造模，發(fā)現(xiàn)在MIA造模2周時(shí)達(dá)到OA中期階段，造模4周時(shí)為OA晚期階段，這為將來(lái)更好的應(yīng)用動(dòng)物OA模型形成了理論依據(jù)。同時(shí)通過(guò)對(duì)軟骨下骨的骨微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，OA會(huì)造成軟骨下骨密度減低、骨小梁稀疏等骨質(zhì)疏松表現(xiàn)，并且隨著OA病情進(jìn)展，這種情況會(huì)逐漸加重。