趙 娟，李立煊，陳雯敏，肖金龍，仲 濤

(四川農(nóng)業(yè)大學 畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130)

甲狀腺激素(TH)對動物機體維持正常生長發(fā)育和新陳代謝至關(guān)重要，主要參與調(diào)控骨骼、腦和生殖器官的生長發(fā)育，且會影響神經(jīng)細胞增殖、分化和遷移[1-3]。正常生理狀態(tài)下，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控下，下丘腦釋放促甲狀腺激素釋放激素(TRH)調(diào)節(jié)腺垂體促甲狀腺激素(TSH)的分泌，后者則刺激甲狀腺細胞分泌TH。妊娠期間，母體的“下丘腦-垂體-甲狀腺軸”存在特殊應(yīng)激反應(yīng)，下丘腦中的TH/TH受體(TRs)可通過TH/TRs-親吻促動素(kisspeptin，KISS)-促性腺激素釋放激素(GnRH)通路、TH/TRs-GnRH通路以及室管膜細胞可塑性的改變共同調(diào)控GnRH神經(jīng)脈沖的釋放，由雌激素和人絨毛膜促性腺激素(HCG)影響甲狀腺的功能，通過負反饋作用調(diào)節(jié)甲狀腺激素的分泌[4-5]。近年來，妊娠期甲狀腺激素異常已成為臨床常見病。妊娠期甲狀腺激素異常不僅會對母體的健康產(chǎn)生影響，還會影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼、大腦和生殖器官的發(fā)育[6]。甲狀腺激素主要有兩種：T4(甲狀腺素)的分泌量大，被認為是促激素；T3(三碘甲狀腺原氨酸)的分泌量較低，但生物活性高。這兩種激素與血清蛋白結(jié)合后，由不同類型的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運到靶細胞中。進入靶細胞后脫碘酶催化T4和T3酚環(huán)或酪硅環(huán)上碘原子的去除，介導甲狀腺激素的活化和失活[7]。

目前已知的脫碘酶有3種：Ι型碘甲狀腺原氨酸脫碘酶(D1)、Ⅱ型碘甲狀腺原氨酸脫碘酶(D2)和Ⅲ型碘甲狀腺原氨酸脫碘酶(D3)，分別由Ι型硒代脫碘酶基因(DIO1)、Ⅱ型硒代脫碘酶基因(DIO2)和Ⅲ型硒代脫碘酶基因(DIO3)的mRNA編碼，它們的催化特性和組織分布各不相同。D1能夠與3,3′,5-三碘-L-甲狀腺氨酸 (T3)和3,3′,5′-三碘-L-甲狀腺氨酸(rT3)進行5-和5′-脫碘反應(yīng)[8-9]；通過外環(huán)碘化作用，D2可將激素原T4轉(zhuǎn)化為具有生物活性的激素T3,并將rT3轉(zhuǎn)化為3,3′-二碘-L-甲狀腺氨酸 (3,3′-T2)，從而增加TH的信號傳導[10-11]；D3是主要的T3和T4失活酶，可通過催化T3、T4分別轉(zhuǎn)化為無生物活性的代謝產(chǎn)物3,3′-T2和rT3[12-14]。機體內(nèi)的甲狀腺激素水平主要通過脫碘酶的協(xié)同作用維持動態(tài)平衡，以滿足機體需要[15]。在胚胎發(fā)育過程中，D3在妊娠子宮、胎盤、胎兒組織中高表達并降解TH，避免胚胎過度或過早暴露于成年甲狀腺激素水平[16-17]。

DIO3位于delta樣同源物1和Ⅲ型碘甲狀腺原氨酸脫碘酶(delta-like homologue 1 and type Ⅲ iodothyronine deiodinase，DLK1-DIO3)印記域的最遠端，由一個外顯子構(gòu)成，編碼Ⅲ型脫碘酶，參與體內(nèi)甲狀腺激素的降解過程。研究表明，敲除DIO3的小鼠視網(wǎng)膜視錐細胞會退化，還可能導致耳聾和耳蝸過早的分化[18-20]。視交叉上核將視網(wǎng)膜接收的不同光照信號傳至松果體，通過調(diào)控褪黑素的分泌時長調(diào)節(jié)促甲狀腺激素的分泌，進而作用于下丘腦促進DIO3和DIO2的表達。DIO3和DIO2通過調(diào)控下丘腦局部T3和T4的動態(tài)平衡影響促性腺激素釋放激素基因的表達，從而影響季節(jié)性發(fā)情[21-22]。例如，黑線倉鼠下丘腦DIO3和DIO2在春季和秋季表達量較高，與其繁殖高峰一致，間接證實了DIO3/DIO2可通過調(diào)節(jié)光周期信號轉(zhuǎn)導間接調(diào)控動物的繁殖活動[23-24]。本試驗通過分析灌胃甲狀腺激素(L-T4)對小鼠胎盤中DIO3的表達及胚胎數(shù)的影響，研究妊娠期DIO3與甲狀腺激素之間的分子調(diào)控機制，為妊娠期甲狀腺激素異常的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究所用6周齡健康昆明小鼠(其中包括70只 雌鼠和35只雄鼠)，由成都達碩實驗動物有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器

甲狀腺素(L-T4)購于德國Sigma-Aldrich公司；TRIzol?Reagent購于美國Invitrogen公司；DEPC、DMF購于成都博瑞克生物技術(shù)公司；PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII熒光染料試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司。超凈工作臺(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司，S.H.S-840U型)；實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD，CFX96型)。

1.3 試驗設(shè)計與動物飼養(yǎng)管理

雌性小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，腹腔灌胃10 U PMSG(溶于0.3 mL生理鹽水)，正常飼喂48 h后將雄鼠和雌鼠以1∶2的比例合籠過夜。次日清晨對雌鼠進行陰道檢測，若陰道處可見乳白色陰栓則視為妊娠第1天[25]。將妊娠小鼠隨機分為5組，試驗組分別灌胃0.25(SG，n=10)、1.25(MG，n=10)、2.50(LG，n=10)和5.00 μg·μL-1(HG，n=10)的左旋甲狀腺素，對照組給予等量的生理鹽水(CG，n=10)，每天灌胃80 μL，持續(xù)10 d。觀察母鼠懷孕情況并記錄妊娠天數(shù)，采集試驗組妊娠天數(shù)分別為第10和18天的小鼠胎盤(n=4/組)并記錄胚胎數(shù)。此外，采集對照組第10、14和18天的胎盤及未妊娠小鼠卵巢(n=3/組)。

動物房溫度為(20 ± 2)℃，相對濕度為40%～70%，自然光照下，每3天對鼠籠清洗消毒并更換墊料。試驗期間小鼠可自由采食和飲水。

1.4 小鼠胎盤組織石蠟切片顯色原位雜交檢測

小鼠經(jīng)折頸法處死[26]，采集妊娠第10、14和18天 小鼠胎盤組織用石蠟包埋后制片，每個時期取1只小鼠。剩余的胎盤組織經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃ 冰箱中冷凍保存。將切片依次浸入二甲苯、分級乙醇中，隨后用DEPC水清洗。用蛋白酶K(3%檸檬酸稀釋)37 ℃消化25 min，PBS液沖洗。預(yù)雜交后，滴加含有探針DIO3 mRNA(BIO-5′-GGTCTGGGCGCAGAGCCTCAGCGAGTGAAG-CAG-3′)的濃度為5 ng·μL-1的雜交液，37 ℃雜交過夜。將切片在37 ℃下洗滌15 min，室溫洗滌10 min。 滴加封閉血清BSA和親合素化過氧化物酶，然后用DAB和蘇木素顯色，脫水后封片。將其置于顯微鏡下鏡檢，采集圖像并分析。

1.5 小鼠胎盤組織石蠟切片免疫組化分析

采集各妊娠期小鼠胎盤組織制成石蠟切片，每個時期取1只小鼠。脫蠟后放入EDTA(pH 9.0)緩沖液中抗原修復。冷卻后放入PBS(pH 7.4)中脫色。將玻片放入3%過氧化氫溶液中，室溫下避光25 min，PBS沖洗15 min。加3% BSA或10%兔血清，室溫封閉30 min。甩掉封閉液，一抗4 ℃ 下孵育過夜；用PBS沖洗15 min，二抗室溫下孵育50 min。 PBS沖洗15 min，滴加DAB顯色液，水洗終止顯色。用蘇木素染液輕度復染3 min后水洗，樹脂封片，采集鏡檢圖像并分析。

1.6 小鼠血清中甲狀腺激素水平檢測

對小鼠進行眼眶取血，采集的血樣送到四川省八一康復醫(yī)院，用CHEMCLIN?600全自動化學發(fā)光儀測定妊娠第10天小鼠血清中FT3、FT4和TSH水平。

1.7 胎盤組織RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol法提取胎盤組織樣中的總RNA[27]：將提前凍存的組織樣在液氮中迅速研磨成粉，稱取100 mg組織放入1 mL TRIzol中，按試劑盒說明書提取RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白儀檢測RNA的質(zhì)量和濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，過程按照說明書進行，cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 DIO3引物設(shè)計與合成

以GenBank中小鼠DIO3 mRNA序列(NM_172119.2)為模板，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物。F: 5′-CCTGAGCCCGAAGTAGAG-3′，R: 5′-GGTCCCTTGTGCGTAGTC-3′，預(yù)期產(chǎn)物大小237 bp，退火溫度61.4 ℃。以GAPDH為內(nèi)參基因，F(xiàn): 5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，R: 5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，預(yù)期片段大小233 bp，退火溫度59.5 ℃。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.9 熒光定量PCR檢測基因表達

PCR反應(yīng)體系為10 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMII 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板0.8 μL，RNase-free ddH2O 3.2 μL。PCR 擴增反應(yīng)的程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃反應(yīng)10 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用相對定量分析方法，以GAPDH作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法分析DIO3的相對表達量。利用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行分析和制圖，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標準誤”表示。P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 DIO3基因在妊娠小鼠胎盤組織中的表達

利用RT-qPCR技術(shù)檢測妊娠期第10、14、18天的小鼠胎盤組織以及未妊娠母鼠卵巢組織中DIO3基因的mRNA表達情況。結(jié)果顯示，DIO3的表達水平隨妊娠時間增長呈遞減趨勢，其中第10天表達量最高；之后降低，在第18天表達量最低，且低于未妊娠時的表達量。DIO3在4個妊娠時期的表達呈極顯著差異(P<0.01，圖1)。

數(shù)據(jù)柱形標注不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同The different capital letters above the bars show very significant differences(P<0.01), the same as below圖1 DIO3基因在不同妊娠期小鼠胎盤組織中的表達量Fig.1 DIO3 gene mRNA expression in placenta of mice at different gestation stages

2.2 石蠟切片顯色原位雜交及免疫組化分析

為進一步檢測妊娠小鼠胎盤組織中DIO3基因的表達情況，利用石蠟切片顯色原位雜交技術(shù)對不同妊娠時期的小鼠胎盤組織內(nèi)DIO3基因 mRNA進行亞細胞定位。原位雜交結(jié)果顯示，DIO3在不同妊娠時期均有表達，其中在妊娠第10天的小鼠胎盤組織中DIO3表達量最高，在第18天的表達量最低，即DIO3基因 mRNA的表達量隨妊娠發(fā)展呈遞減趨勢(圖2A和2B)。利用免疫組化檢測不同妊娠時期的小鼠胎盤組織內(nèi)脫碘酶蛋白含量。免疫組化結(jié)果顯示，脫碘酶蛋白含量隨妊娠發(fā)展呈遞減趨勢，其中第10天的小鼠胎盤組織中最高，在第18天最低，而第14天的蛋白含量介于兩者之間(圖2C)，與熒光定量PCR和原位雜交結(jié)果一致。

A、B. 分別表示不同妊娠期小鼠胎盤內(nèi)DIO3 mRNA表達量和陰性對照；C表示不同妊娠期小鼠胎盤內(nèi)DIO3的蛋白水平；細胞核呈藍色；DIO3 mRNA和蛋白呈棕黃色A, B. Represent DIO3 mRNA expression and negative controls in mice placentas at different gestation periods, respectively; C. Represents the protein level of DIO3 in mice placentas at different gestation periods. The nucleus is blue; DIO3 mRNA and protein are brownish yellow圖2 不同妊娠期小鼠胎盤組織中DIO3原位雜交(A、B，200×)及免疫組化(C，400×)結(jié)果Fig.2 In situ hybridization(A,B,200×)and immunohistochemical(C,400×)results of DIO3 in mice placentas at different gestation periods

2.3 灌胃L-T4對孕鼠血清TSH、FT3、FT4水平及胚胎數(shù)的影響

利用灌胃針將L-T4灌入小鼠胃內(nèi)，檢測發(fā)現(xiàn)妊娠母鼠血清中TSH、FT3和FT4的水平變化趨勢一致，均隨灌胃L-T4濃度的增加呈現(xiàn)升高趨勢，且灌胃劑量最高的母鼠血清中甲狀腺激素水平最高(圖3A、3B、3C)。此外，灌胃組母鼠體內(nèi)的血清TSH、FT3和FT4水平顯著高于對照組，且各處理組間差異顯著(P< 0.05)。對比分析發(fā)現(xiàn)，妊娠第10天灌胃組妊娠母鼠胚胎數(shù)量略大于對照組(CG組)，但差異不顯著；妊娠第18天灌胃組和對照組妊娠母鼠胚胎數(shù)量大致相同。除此之外，各灌胃組間妊娠母鼠胚胎數(shù)量無顯著差異(圖3D、3E)。

數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)The different lowercase letters above the bars show significant differences(P<0.05)圖3 L-T4對孕鼠血清中甲狀腺激素水平及胚胎數(shù)的影響Fig.3 Effect of L-T4 on serum thyroid hormone level and embryo number in pregnant mice

2.4 灌胃L-T4對DIO3表達量的影響

利用RT-qPCR技術(shù)檢測灌胃不同劑量L-T4的小鼠胎盤組織中DIO3的表達情況。如圖4所示，妊娠第10天時，DIO3的表達隨灌胃劑量的增加而增加。DIO3的表達量在對照組與高劑量灌胃組(HG組)之間呈極顯著差異(P<0.01)，對照組與SG、MG和LG組之間無顯著差異(P> 0.05)。妊娠第18天時，對照組DIO3的表達量極顯著高于灌胃組(P<0.01)。DIO3的表達隨灌胃劑量的增加而增加，但HG與SG組DIO3的表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖4 不同處理組小鼠體內(nèi)DIO3基因mRNA表達量Fig.4 DIO3 gene mRNA expression level in mice in different treatment groups

3 討 論

DIO3在胎兒組織和新生兒大腦區(qū)域中表達，從而有效控制甲狀腺激素對胎兒生長發(fā)育的影響[28]。DIO3可以保護胎兒免受母體高水平T4的侵害，并促進其細胞增殖和生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常生理狀態(tài)下，妊娠時小鼠胎盤中DIO3表達水平顯著高于未妊娠時期的水平。另外，小鼠胎盤中DIO3表達量隨妊娠發(fā)展顯著降低，于分娩前達到最低水平，甚至低于未妊娠時期的表達水平。當DIO3缺乏時，會導致胎兒的神經(jīng)發(fā)育異常，表明TH過量的有害作用，并揭示DIO3在調(diào)節(jié)腦TH行為中的關(guān)鍵作用。在神經(jīng)元中，DIO3的表達可以使甲狀腺激素失活并減少氧氣消耗，造成細胞特異性甲狀腺功能低下，減少缺血引起的缺氧性腦損傷[29]。TH的狀態(tài)對性腺的發(fā)育和功能有重要影響，在睪丸上表現(xiàn)得尤為明顯。TH通過影響睪丸細胞增殖和分化，從而影響睪丸大小、精子生成和類固醇生成[30]。

妊娠狀態(tài)下機體產(chǎn)生的甲狀腺激素通過胎盤在胎兒早期的生長發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但胚胎過早暴露于成年甲狀腺激素水平可能導致畸形、生長改變、智力遲鈍甚至死亡[31]。隨著妊娠的發(fā)展，胎兒生長變快，妊娠小鼠的代謝隨之加快，導致TH的消耗增加，機體局部的TH水平降低，甚至低于未妊娠時期的狀態(tài)。胎兒和新生兒的血清甲狀腺素水平顯著低于剛出生幾個小時的嬰兒[32]，這可能是由于胎兒肝以及胎盤DIO3的高表達。DIO3的表達可使甲狀腺激素失活，而當TH水平下降時，DIO3的表達量也隨之降低，但具體的作用機制還有待查證。出生后TSH快速增加，誘導甲狀腺分泌T3和T4及胎盤的缺失，同時DIO1和DIO2表達量增加[33]。大量研究表明，L-T4對治療輕度甲狀腺功能減退癥患者有一定效果[34-37]。本試驗中，灌胃L-T4的小鼠血清中甲狀腺激素水平高于未處理組的激素水平，而且經(jīng)不同濃度梯度L-T4處理后的妊娠小鼠血清中TSH、FT3、FT4水平隨灌胃濃度的增加均呈現(xiàn)升高的趨勢，由于這3個指標在臨床上能夠直觀反映甲狀腺激素水平，因此，妊娠小鼠體內(nèi)的TH水平也逐漸升高，表明灌胃L-T4能夠促進甲狀腺激素的分泌。這與范穌圳等[38]得到的結(jié)果相一致。研究表明，鴨蛋清內(nèi)注射外源性T3會誘導出雛前肝DIO3 mRNA表達降低和出雛后D1和D3蛋白含量及酶活性的降低[39]。本試驗中，灌胃L-T4的小鼠DIO3 mRNA表達顯著高于未處理組，與上述結(jié)果一致。灌胃梯度濃度的L-T4能夠誘導甲狀腺激素的分泌，同時導致DIO3 mRNA表達量升高，推測可能是甲狀腺激素的升高能夠促進DIO3 mRNA的表達。

許多研究表明，印記基因DIO3和繁殖性狀之間存在某種關(guān)聯(lián)[40-42]。例如，DIO3可通過與DIO2協(xié)同作用下丘腦中甲狀腺激素的動態(tài)平衡，從而影響生殖激素的分泌，調(diào)控哺乳動物的繁殖活動[42]。Hernandez等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，破壞DIO3的印跡狀態(tài)或敲除DIO3印記基因會影響D3酶的活性，導致甲狀腺激素水平異常，增大死胎率，導致產(chǎn)仔數(shù)減少。但在本試驗中，妊娠第10天時灌胃組妊娠母鼠胚胎數(shù)量略大于對照組，但差異不顯著；妊娠第18天灌胃組和對照組妊娠母鼠胚胎數(shù)量大致相同。除此之外，各灌胃組間妊娠母鼠胚胎數(shù)量無顯著差異。這些結(jié)果表明，灌胃L-T4可能會誘導胚胎提前形成，但對孕鼠最終胚胎數(shù)的影響并不顯著，推測DIO3對產(chǎn)仔數(shù)的影響可能存在物種差異，仍需進一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，在正常生理條件下，小鼠胎盤組織中DIO3的表達量隨妊娠時間的延長而呈現(xiàn)下降趨勢。灌胃L-T4可導致妊娠母鼠血清中甲狀腺激素含量增加，進而促進胎盤組織中DIO3的表達。灌胃L-T4對孕鼠最終胚胎數(shù)無顯著影響。以上研究結(jié)果提示，DIO3基因可能與妊娠期小鼠甲狀腺激素的動態(tài)變化及胚胎發(fā)育有關(guān)，為進一步研究妊娠期甲狀腺激素水平調(diào)控的分子機制提供理論基礎(chǔ)。