牛宏宇，張瑞雪，齊茂振，馬玉潔，曲 栓，靳亞平，林鵬飛

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌 712100)

CREBZF蛋白是cAMP反應元件結合蛋白(CREB)/激活轉錄因子(ATF)蛋白家族的成員，是一種含有b-ZIP結構域的轉錄因子[1]。CREBZF被發(fā)現(xiàn)于單純皰疹病毒(HSV)在機體中的潛伏過程，能夠競爭性抑制HSV的結構蛋白VP16與宿主細胞因子(HCF)形成復合體，進而抑制HSV的復制[2]。CREBZF因與內質網應激蛋白CHOP結構類似，可以與ATF4、X-盒結合蛋白1(XBP1)和同為CREB/ATF蛋白家族成員LUMAN等相互作用，參與調控哺乳動物的未折疊蛋白反應和內質網應激過程[3-5]。由于選擇不同的翻譯起始位點，CREBZF基因能夠翻譯成為兩種蛋白亞型，一種長亞型CREBZF(又被稱為SMILE)，一種短亞型Zhangfei。無論長短亞型，CREBZF蛋白的一級結構均包含一個b-ZIP、一個酸性激活域和一個宿主細胞因子結合域(HBM)[6]。但與其它b-ZIP蛋白不同，由于CREBZF的HBM缺乏天冬氨酸殘基，因此不能像其它b-ZIP蛋白一樣通過形成同源二聚體與靶基因的啟動子區(qū)結合發(fā)揮轉錄激活作用，而是需要與其他蛋白相互作用共同調控靶基因的轉錄[7]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，CREBZF參與調控哺乳動物的生殖內分泌過程。CREBZF通過影響Nr4a1和Nr5a1的表達水平，促進hCG誘導小鼠間質細胞中睪酮的產生[8]。CREBZF在小鼠子宮內膜上皮高表達，與胚胎植入密切相關，并被雌激素顯著上調[9]。在小鼠卵巢顆粒細胞中，CREBZF通過調節(jié)ERK1/2和mTOR信號通路促進細胞凋亡[10]。山羊是人類重要的肉乳食品來源，雌性山羊的繁殖性能直接影響生產效益[11-12]。子宮內膜容受性(RE)的建立決定了胚胎能否順利著床，在這個過程中，子宮內膜上皮細胞的凋亡發(fā)揮了關鍵作用[13-14]。

近年來，關于影響反芻動物胚胎附植和子宮容受性基因的研究越來越多，然而，CREBZF在山羊子宮中的作用仍未見研究報道。由于山羊CREBZF基因CDS區(qū)堿基GC含量高，難以通過PCR直接對其全長進行克隆，限制了對山羊CREBZF的深入研究。無縫克隆技術又稱“Seamless Cloning/In-Fusion Cloning”技術，是一種能夠高效地將多個基因片段與載體連接的新方法，具有連接精確、操作簡單、成本低等優(yōu)點[15-16]。本試驗通過分段擴增CREBZF基因和無縫克隆技術聯(lián)用，構建了編碼山羊CREBZF兩種亞型的基因過表達載體，并探究其對子宮內膜上皮細胞凋亡過程的影響，為深入研究CREBZF對山羊胚胎附植和子宮內膜容受性的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM/F-12培養(yǎng)液和Opti-MEM無血清培養(yǎng)液購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Invitrogen公司；Turbofect轉染試劑購自Fementas公司；RNA提取試劑、高保真PCR酶、限制性內切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ、DNA Marker購自TaKaRa公司；反轉錄試劑盒購自艾科瑞生物公司；無縫克隆酶(C113-02)、熒光定量試劑(Q311-02)購自Vazyme公司；無內毒素質粒小提中量試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；抗CREBZF兔多克隆抗體(DF3447)購自Affinity公司；抗GAPDH鼠單克隆抗體(JC-PA003)購自晶彩生物公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG為中暉赫彩公司產品。預染蛋白Marker購自GenStar公司。Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(KGA108)購自凱基生物公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

永生化山羊子宮內膜上皮細胞系由本實驗室建立、鑒定并保存[17]。將保存的gEECs復蘇，使用DMEM/F-12完全培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，當細胞密度達到80%匯合時進行傳代。本試驗所用細胞均保證處于對數(shù)生長期，細胞活性大于95%。

1.3 過表達載體的構建

1.3.1 引物設計與合成 根據(jù)NCBI中CREBZF的基因序列(XM_018042803)，應用Primer Premier 5.0軟件在其CDS區(qū)分段設計引物。其中，CREBZF的基因片段由2個片段同源重組構成，片段A正向引物F1的5′端添加了一段含有HindⅢ 酶切位點的上游載體同源臂，片段B反向引物R2的3′端添加了一段含有EcoRⅠ 酶切位點的下游載體同源臂，同時使2個片段之間存在一段重復序列互為同源臂。短亞型Zhangfei基因片段的正、反向引物均添加了載體同源臂。各同源重組片段引物設計技術原理見圖1，引物序列見表1，斜體表示載體同源臂，下劃線表示酶切位點。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 目的基因片段和線性化載體的獲取 使用TRIzol提取山羊子宮內膜上皮細胞總RNA,通過反轉錄試劑盒得到cDNA并作為模板，使用高保真酶進行PCR擴增分別獲得目的基因片段。載體構建所使用的pcDNA3.1(+)空載體由本實驗室保存，使用限制性內切酶HindⅢ 和EcoRⅠ 對pcDNA3. 1(+)載體進行雙酶切，產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定，使用試劑盒純化回收。

1.3.3 同源重組反應和轉化感受態(tài)細胞 使用NanoDrop One儀器測定基因片段和線性化載體濃度，計算各組分使用量。SMILE重組反應體系：片段A 5.7 ng，片段B 17.22 ng，線性化pcDNA3.1

圖1 引物設計技術原理Fig.1 Schematic representation of primers design

表1 目的基因片段引物序列

(+)載體108 ng，ExnaseⅡ無縫克隆酶2 μL，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL，加DEPC水至20 μL總體積；Zhangfei重組反應體系：Zhangfei基因片段17.72 ng，線性化pcDNA3.1(+)載體108 ng，Exnase Ⅱ無縫克隆酶2 μL，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL, 加水至20 μL總體積。反應條件：37 ℃作用30 min，然后立即置于冰上冷卻。將重組產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞(購自天根生化科技有限公司)，37 ℃搖菌60 min，涂于含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。用于轉化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落于含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌12 h，抽提重組質粒，并進行雙酶切鑒定和測序，鑒定正確的重組質粒分別命名為pcDNA3.1(+)-SMILE和pcDNA3.1(+)-Zhangfei。

1.4 載體轉染gEECs

將gEECs培養(yǎng)于6孔板，設置空白對照組、空載體組、過表達SMILE組和過表達Zhangfei組，待細胞長至80%匯合時換為無血清培養(yǎng)液，其中空白對照組不進行轉染操作，空載體組、過表達SMILE組和過表達Zhangfei組分別轉染pCDNA3.1(+)空載體、pcDNA3.1(+)-SMILE和pcDNA3.1(+)-Zhangfei。先將2 μg質粒和4 μL轉染試劑加入100 μL Opti-MEM中預混，室溫避光孵育20 min， 然后滴加在細胞培養(yǎng)皿中，使質粒終濃度為1 μg·mL-1，輕微晃動使其均勻分布。轉染12 h后更換為完全培養(yǎng)液，24 h后收集細胞。

1.5 qRT-PCR檢測CREBZF基因mRNA的表達

使用TRIzol提取各試驗組gEECs的總RNA，利用反轉錄試劑盒得到cDNA。根據(jù)NCBI查閱的山羊CREBZF(XM_018042803)和GAPDH(XM_005680968.3)基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計qRT-PCR引物。CREBZF上游引物：TACCTTCGGGCCGTCTTAG；下游引物：CGAG-TCGTCCTGGTCTTCC。GAPDH上游引物：TC-TGCTGATGCCCCCATGTT；下游引物：TGACCTTGCCCACAGCCTTG。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以反轉錄得到的cDNA為模板，使用ChamQ SYBR熒光定量試劑在Bio-Rad CFX96 PCR儀中進行qRT-PCR。

1.6 Western blot檢測SMILE和Zhangfei蛋白的表達

收集各試驗組細胞，使用裂解液提取細胞總蛋白質，BCA法測定蛋白濃度，剩余蛋白樣品加入5×Loading Buffer混勻，煮沸15 min。樣品進行SDS-PAGE電泳，120 V電壓濕轉90 min，將膜轉移至含10%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉120 min，去除封閉液，用TBST(含0.05% Tween20)洗膜3次，每次10 min，在1∶1 000稀釋的CREBZF一抗中4 ℃ 孵育過夜，用TBST洗去一抗，在1∶5 000稀釋的羊抗兔二抗中室溫孵育60 min，TBST洗去二抗，加入顯色試劑，在成像系統(tǒng)中觀察結果。

1.7 流式細胞術檢測凋亡率

將構建的過表達載體轉染gEECs，方法同“1.4”。除空載組、過表達組之外，設置細胞凋亡陽性對照組，在收集細胞之前向陽性對照孔中加入5% DMSO處理30 min、人工誘導細胞凋亡[18]。采用胰酶(不含EDTA)消化收集細胞，PBS洗滌2次， 使用500 μL的Binding buffer重懸細胞，根據(jù)說明書要求依次加入Annexin V-FITC和PI，混勻，室溫避光反應15 min，使用BD公司高速分選型流式細胞儀進行檢測。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 山羊SMILE基因分段片段和Zhangfei基因片段的PCR擴增

PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，圖2可見大小約為285、861和886 bp的特異性條帶，符合預期條帶大小。

M.DNA Marker DL2000；1.SMILE片段A加載體上游同源臂；2.SMILE片段B加載體下游同源臂；3.Zhangfei片段加載體上、下游同源臂M.DNA Marker DL2000; 1.Fragment A of SMILE gene with a sequence homologous to the vector’s positive strand; 2.Fragment B of SMILE gene with a sequence homologous to the vector’s nagetive strand; 3.Zhangfei gene flanked by two sequences homologous to the vector圖2 各目的基因片段PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification result of gene fragments

2.2 重組載體的雙酶切鑒定與測序

利用限制性內切酶Hind Ⅲ 和EcoRⅠ 對兩種重組質粒進行雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果(圖3)顯示pcDNA3.1(+)-SMILE泳道出現(xiàn)大小約為5 380 bp的線性化載體條帶和1 089 bp的SMILE條帶，pcDNA3.1(+)-Zhangfei泳道出現(xiàn)大小約為5 380 bp的線性化質粒條帶和846 bp的Zhangfei條帶。測序結果(圖4)與NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊CREBZF基因CDS區(qū)同源性為100%，顯示2種重組過表達載體構建正確。

M.DNA Marker DL10000；1.過表達載體pcDNA3.1(+)-SMILE雙酶切產物；2.過表達載體pcDNA3.1(+)-Zhangfei雙酶切產物M.DNA Marker DL10000;1.Double enzyme digestion pro-ducts of pcDNA3.1(+)-SMILE;2. Double enzyme digestion products of pcDNA3.1(+)-Zhangfei圖3 2種重組過表達載體雙酶切鑒定結果Fig.3 Double enzyme digestion identification of the two recombinant overexpression vectors

2.3 轉染過表達載體對相關基因表達的影響

如圖5所示，空載體組與對照組相比，CREBZF基因的mRNA表達水平無顯著性差異；轉染pcDNA3.1(+)-SMILE組和pcDNA3.1(+)-Zhangfei組與空載組比較，CREBZF基因mRNA的表達水平均顯著上升(P<0.01)。

Western blot結果顯示(圖6)，各組在50和40 ku均顯示條帶，過表達組相關蛋白表達量顯著高于空白對照組和空載組。結果表明：在生理條件下，gEECs主要表達長亞型SMILE，外源轉入pcDNA3.1(+)-SMILE后長、短兩種亞型的表達量均顯著增加，外源轉入pcDNA3.1(+)-Zhangfei后只有短亞型Zhangfei表達量顯著增加。

2.4 流式細胞術分析轉染過表達載體細胞凋亡率

如圖7所示，pcDNA3.1(+)組gEECs凋亡率為8.45%，與空載體組相比，轉染pcDNA3.1(+)-SMILE組凋亡率顯著上升至12.41%(P<0.01)，轉染pcDNA3.1(+)-Zhangfei組凋亡率上升至9.83%，但統(tǒng)計學差異不顯著，陽性對照組凋亡率則顯著上升至14.00%(P<0.01)，表明過表達長亞型SMILE促進gEECs凋亡。

3 討 論

為了深入研究CREBZF的功能和機制，本團隊在前期成功構建了小鼠CREBZF的慢病毒過表達載體和shRNA慢病毒干擾載體，并轉染至NIH 3T3細胞系進行了驗證[19]。而本研究的難點在于，山羊CREBZF基因的CDS區(qū)全長堿基GC含量高達70%，而3′端末尾35 bp堿基GC含量不足30%，并且具有一段“TTAAAATTTTCTTTTTT”序列，這種特殊性給引物設計帶來了困難，不易通過普通PCR對該基因CDS區(qū)全長直接克隆。趙煒等[20]通過分段克隆結合重疊延伸PCR方法，成功構建了高GC含量的人KAP-1基因定點突變載體。但重疊延伸PCR需要對基因片段進行多次PCR擴增，且傳統(tǒng)的載體構建過程需要進行酶切和連接過夜等一系列操作，耗時相對較長。無縫克隆技術是以同源重組原理為基礎的新技術，能夠通過同源臂的方式將目的基因片段之間及片段與載體連接，具有步驟簡單、效率高、無冗余序列等優(yōu)點，近年來被廣泛用于生物技術和轉基因動物育種等領域[21-25]。因此，本研究通過分段克隆的方式，解決了該基因由于高GC含量而難以直接克隆目的基因全長的問題。同時結合無縫克隆方法，在設計引物時使CREBZF基因2個片段之間形成同源臂，再添加上下游載體同源臂，借助無縫克隆酶快速、高效地構建了該基因的兩種重組過表達載體，為深入探究CREBZF蛋白不同亞型的功能差異和作用機制提供試驗材料。

前期研究發(fā)現(xiàn)，CREBZF在小鼠整個發(fā)情周期的子宮中都有表達，主要翻譯為長亞型SMILE，短亞型Zhangfei的表達很微弱[9]，這與本研究在山羊子宮內膜上皮細胞中的結果(圖6對照組)相一致，表明CREBZF在不同物種的同類組織器官中，長短亞型的選擇性翻譯存在一定的保守性。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)gEECs表達的長亞型SMILE在50～60 ku處顯示為2條條帶，在外源轉入pcDNA3.1(+)-SMILE后，這2條帶均同時被過表達(圖6)，Xie等[6]在MCF-7細胞中發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，推測這與蛋白翻譯后的修飾有關，因為在翻譯后被修飾可以改變蛋白自身在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率[26]。而SMILE在gEECs中具體存在哪種翻譯后修飾，還有待于深入研究。

圖7 流式細胞術檢測凋亡率Fig.7 Apoptotic rate detected by flow cytometry

胚胎能否在子宮順利著床取決于兩個方面：一是胚胎發(fā)育到具有著床能力的階段，另一個重要的條件是子宮需要處于容受性狀態(tài)(RE)[27]。在胚胎附植之前，子宮內膜在卵巢類固醇激素的作用下發(fā)生形態(tài)結構和功能的轉變，使子宮進入RE，但RE的存在時間并不長久，如果胚胎無法在這一窗口期完成附植，則造成妊娠失敗[28]。子宮內膜上皮細胞作為子宮內膜重要的組成部分，其凋亡的發(fā)生在子宮RE轉變過程中發(fā)揮重要的調控作用，但具體調控網絡仍需完善[29]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，CREBZF基因與細胞凋亡過程有著密切的聯(lián)系。比如，在ONS-76人腦髓母細胞瘤細胞中添加凋亡誘導劑白藜蘆醇，Zhangfei的表達水平顯著升高，而過表達Zhangfei能夠通過上調TrkA和Egr1，進而誘導ONS-76細胞凋亡[30]；在犬骨肉瘤細胞系中，Zhangfei可以協(xié)同腫瘤抑制蛋白p53，從而抑制細胞生長和促進凋亡發(fā)生，并激活骨鈣素的產生，誘導觸發(fā)細胞的程序性死亡[31]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SMILE通過磷酸化細胞內調節(jié)激酶1/2 (ERK1/2)和p70 S6激酶(S6K1)抑制ERK1/2和mTOR信號通路，使BAX和剪切型Caspase-3的表達水平上升，促進小鼠卵巢顆粒細胞發(fā)生凋亡[10]。本研究的結果顯示，SMILE在山羊子宮內膜上皮細胞中發(fā)揮與上述研究相似的促凋亡作用，提示SMILE可能參與調控子宮內膜轉向或離開RE狀態(tài)，最終影響山羊胚胎的附植，但是否通過BAX和Caspase等途徑進行調控需要進一步探究。

4 結 論

成功構建了山羊CREBZF蛋白兩種不同亞型的過表達載體：pcDNA3.1(+)-SMILE和pcDNA3.1(+)-Zhangfei；過表達長亞型SMILE能夠促進gEECs發(fā)生凋亡。