楊 杰，陳 蓉，胡文娟，吳巧玲，陳健美，李興濤

(贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，國家臍橙工程技術(shù)研究中心，江西贛州 341000)

SQUAMOSA promoter binding protein-like(SPL)蛋白又被稱為SQUAMOSA promoter binding protein(SBP)-box proteins，是廣泛存在于綠色植物中的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物胚胎發(fā)育、葉片生長、成花轉(zhuǎn)變、育性、赤霉素響應(yīng)及脅迫應(yīng)答等過程中起重要調(diào)控作用[1]。已發(fā)現(xiàn)的SPL/SBP家族成員都具有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域，能識別并結(jié)合到SQUAMOSA(SQ-UA)啟動子上[2]。該結(jié)構(gòu)域由76個氨基酸殘基組成，一般含2個鋅指結(jié)構(gòu)域，即Cys-Cys-His-Cys(C2HC)和Cys-Cys-Cys-His(C3H)，以及1個保守核定位信號[3]。此外，部分SPL基因的表達(dá)還會受到miR156/miR157的調(diào)控[4]。

SPL基因家族是多基因家族，參與植物生長發(fā)育和逆境脅迫等過程[5]。目前，桃[2]、擬南芥[6]、水稻[7]、番茄[8]和草莓[9]等植物的SPL基因已被陸續(xù)鑒定。其中，Chao等[5]發(fā)現(xiàn)AtSPL1和AtSPL12的過量表達(dá)會增強(qiáng)擬南芥的耐熱性；過量表達(dá)AtSPL3和AtSPL9會使擬南芥提前開花[10]；AtSPL15在花誘導(dǎo)過程中通過激活花調(diào)節(jié)因子FRUITFULL(FUL)和 miR172b 來誘導(dǎo)擬南芥開花[11]；Wang等[12]發(fā)現(xiàn)AtSPL2可直接作用于ASYMMETRIC LEAVES2(AS2)來調(diào)控花器發(fā)育和植物育性；將水稻OsSPL16高表達(dá)，可提高其籽粒的質(zhì)量和產(chǎn)量[13]。

甜橙(Citrussinensis)是柑橘中主要的鮮食品種，因其汁多味美、營養(yǎng)豐富受到消費(fèi)者喜愛。但是中國甜橙品種單一，成熟期集中在11、12月份，造成鮮果集中上市，制約了鮮橙產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展?！M南早’是國家臍橙工程技術(shù)研究中心選育的甜橙早花品種，是甜橙品種‘紐荷爾’的芽變系，果實(shí)熟期比‘紐荷爾’提前30 d以上[14]。本課題組經(jīng)過多年觀察發(fā)現(xiàn)，‘贛南早’比‘紐荷爾’提前10～15 d開花。研究發(fā)現(xiàn)，在果樹栽培過程開花期提早，果實(shí)可提早成熟[15-16]。SPL基因家族在植物花發(fā)育過程起重要調(diào)控作用，但至今其在甜橙成花誘導(dǎo)過程中的作用機(jī)制尚未被報(bào)道。本研究鑒定了CsSPL基因家族，分析其蛋白理化性質(zhì)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)等及其在甜橙不同組織的表達(dá)，并通過qRT-PCR對比分析甜橙不同花期品種成花過程中CsSPLs的相對表達(dá)水平，為探討CsSPLs在甜橙開花調(diào)控等方面的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜橙早花品種‘贛南早’和對照品種‘紐荷爾’來自贛南師范大學(xué)國家臍橙工程技術(shù)研究中心，均是枳橙為砧木的8年生果樹。于2019年11月1日開始采集生長良好、長勢一致的甜橙品種短枝新梢(方向朝南)的花芽和葉片進(jìn)行對比試驗(yàn)，之后每隔30 d(5個成花時期)取樣一次，每次取3棵。經(jīng)液氮冷凍后置于-80 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甜橙SPL基因鑒定甜橙基因組數(shù)據(jù)來自CPBD(http://citrus.hzau.edu.cn/)，SPL-family模型(PF03110)來自Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)。使用HMMER3.0軟件搜索CsSPLs，通過CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/term)和InterPro(https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)驗(yàn)證序列保守結(jié)構(gòu)域，去除SBP結(jié)構(gòu)域不完整的基因，得到的CsSPLs按照其在染色體的位置依次進(jìn)行命名。

1.2.2 甜橙SPL基因分析利用ExPASy在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/compute_pi/)和ProtComp9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)分析CsSPLs的等電點(diǎn)、分子量及亞細(xì)胞定位；采用在線軟件SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODLE(https://swissmodel.expasy.org/)分別預(yù)測分析CsSPLs的蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；使用Map MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)在線繪制CsSPLs在染色體上的分布；使用GSDS v2.0(http://gsds.gao-lab.org/)繪制CsSPLs的基因結(jié)構(gòu)圖；利用MEME(http://meme-suite.org/)分析CsSPLs編碼的蛋白保守基序，Motif數(shù)量設(shè)為10；在MEGA 6.0中使用鄰接法對甜橙和擬南芥的SPL蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建，bootstrapping為1 000；使用TBtools分析CsSPLs間的共線性；利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測CsSPLs啟動子區(qū)的順式作用元件；從CPBD下載甜橙不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用TBtools進(jìn)行表達(dá)熱圖的繪制。

1.2.3 RNA提取和qRT-PCR檢測根據(jù)CsSPLs基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)，以柑橘ACTB作為內(nèi)參基因，引物為CsACTB-F/CsACTB-R。使用植物總RNA提取試劑盒(Simgen，中國杭州)提取樣品總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Simgen，中國杭州)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用2×SYBR Green PCR Mix(Simgen，中國杭州)在Light-Cycler 480型實(shí)時熒光定量PCR儀(Roche，Basel，Switzerland)進(jìn)行qRT-PCR操作，每個樣品3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系10 μL，其中，cDNA和ddH2O各2 μL，上下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green PCR Mix 5 μL。PCR程序：95 ℃ 60 s；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s；40 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算CsSPLs的表達(dá)水平，使用DPS數(shù)據(jù)處理軟件分析基因表達(dá)量間的差異顯著性，SigmaPlot 14.0軟件制圖。

表1 甜橙SPL基因的qRT-PCR引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 甜橙SPL基因鑒定及理化性質(zhì)分析

從甜橙基因組鑒定出15個CsSPLs，根據(jù)染色體位置依次命名為CsSPL1～CsSPL15(表2)。CsSPL蛋白的CDS長度為394～3 229 bp，其中CsSPL3蛋白最短，CsSPL15蛋白最長；氨基酸數(shù)量為130～1 075 aa；等電點(diǎn)為5.99～9.28，其中CsSPL2、CsSPL7、CsSPL12和CsSPL14的等電點(diǎn)均小于7，為酸性蛋白，CsSPL11等電點(diǎn)是7，為中性蛋白，其余CsSPL蛋白均為堿性蛋白；CsSPL蛋白的分子量差異較大，最大CsSPL15為118.75 kD，最小CsSPL3為14.73 kD。亞細(xì)胞定位預(yù)測的結(jié)果顯示，僅CsSPL1、CsSPL6、CsSPL8和CsSPL9定位在細(xì)胞外，其余CsSPL蛋白均定位在細(xì)胞核。

表2 甜橙SPL蛋白理化性質(zhì)

2.2 甜橙SPL蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

甜橙SPL蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明(表3)，無規(guī)則卷曲是構(gòu)成甜橙SPL蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要組成部分，所占比例在31.28%～72.03%之間，其次是α-螺旋和β-折疊，所占比例分別為11.11%～43.59%和5.56%～6.67%。

表3 甜橙SPL蛋白二級結(jié)構(gòu)組成

2.3 甜橙SPL基因的染色體分布

15個CsSPLs不均勻地分布在甜橙6條染色體上(圖1)。其中，chrUn上分布最多，為4個CsSPLs；chr1和chr7次之，各有3個CsSPLs；chr2和chr9各有2個CsSPLs；chr5上最少，僅有1個CsSPLs。

2.4 甜橙SPL基因的結(jié)構(gòu)和保守基序

CsSPLs的基因結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜(圖2)。內(nèi)含子數(shù)為1～9個，其中CsSPL10、CsSPL11和CsSPL15的內(nèi)含子數(shù)最多，為8～9個；CsSPL3、CsSPL4和CsSPL5內(nèi)含子數(shù)最少，均為1個。外顯子數(shù)為2～9個；CsSPLs被劃分成8個亞族，同一亞族CsSPLs的基因結(jié)構(gòu)較為相似，如CsSPL1、CsSPL8和CsSPL14同屬S9亞族，均含3個長度相似的外顯子，證明親緣關(guān)系近的CsSPLs具有較保守的基因結(jié)構(gòu)。

CsSPLs的蛋白序列含有10個保守性較強(qiáng)的Motif(圖3)。除CsSPL5只含Motif 1和Motif 3外，其余CsSPLs均含有Motif 1、Motif 2和Motif 3。此外，CsSPL10、CsSPL12和CsSPL15還含有Motif 4～Motif 9；CsSPL2、CsSPL7、CsSPL9和CsSPL14都含有Motif 10?？傮w來看，同一亞族的CsSPLs具有相似的Motif分布。但是，個別亞族間不同的CsSPLs含有不同的Motif，如CsSPL3的Motif數(shù)量相比于同一亞族的其他基因有缺失，暗示同一亞族的CsSPLs有不同的調(diào)控功能。對10個Motif結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(表4)，發(fā)現(xiàn)Motif 4含有50個保守氨基酸，Motif 10保守氨基酸數(shù)最少，僅有11個。

表4 甜橙SPL蛋白保守序列

2.5 甜橙SPL基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

構(gòu)建擬南芥(17個)和甜橙(15個)SPL家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示，整個進(jìn)化樹被分為9個亞族(S1～S9)。除S2亞族之外，其余8個亞族均含CsSPLs。其中S3、S8和S9亞族均含3個CsSPLs，數(shù)量最多；其次是S6亞族，含2個CsSPLs；S1、S4、S5和S7亞族最少，各僅含1個CsSPLs。

2.6 甜橙SPL基因的共線性分析

為了確定甜橙SPL家族成員的復(fù)制事件，對甜橙基因組進(jìn)行了共線性分析(圖5，A)。結(jié)果顯示，CsSPL6/CsSPL9和CsSPL8/CsSPL14存在共線性關(guān)系，分別位于chr5、chr7和chrUn上。為進(jìn)一步闡明SPL基因在甜橙和雙子葉模式植物擬南芥間的進(jìn)化關(guān)系，對2個物種進(jìn)行了共線性分析。如圖5，B所示，在甜橙和擬南芥之間鑒定出CsSPL8/AtSPL13b、CsSPL11/AtSPL7、CsSPL14/AtSPL13a和CsSPL14/AtSPL13b共4個同源基因?qū)?，其中AtSPLs均位于擬南芥5號染色體上，CsSPLs分別位于chr7、chr9和chrUn上。此外，存在共線性關(guān)系的基因在進(jìn)化分析中被劃在同一亞族。揭示這些基因的起源進(jìn)化中發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)，暗示它們的結(jié)構(gòu)和功能存在相似性。

2.7 甜橙SPL基因的順式作用元件預(yù)測

預(yù)測CsSPLs上游2 000 bp啟動子序列上光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和逆境脅迫響應(yīng)元件的分布情況(圖6)。其中，15個CsSPLs均存在光響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件，推測CsSPLs在甜橙響應(yīng)光調(diào)控及體內(nèi)激素平衡過程中發(fā)揮重要作用；除CsSPL2和CsSPL6外，其他13個CsSPLs均存在數(shù)量不一的逆境脅迫響應(yīng)元件，揭示了CsSPLs在不同抗逆生境中起重要的調(diào)控作用。

2.8 甜橙SPL基因在其不同組織的表達(dá)分析

基于甜橙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析CsSPLs在甜橙愈傷組織、花、葉片和果實(shí)中的表達(dá)情況，繪制CsSPLs的表達(dá)熱圖(圖7)。結(jié)果表明，CsSPLs在甜橙不同組織中的表達(dá)量存在較大差異。其中CsSPL3、CsSPL11、CsSPL12和CsSPL15在甜橙愈傷組織中優(yōu)勢表達(dá)；CsSPL3、CsSPL7、CsSPL8、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15在甜橙花中高表達(dá)；CsSPL4、CsSPL7、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15在甜橙葉片中高表達(dá)；甜橙果實(shí)中高表達(dá)的基因包括CsSPL3、CsSPL10、CsSPL12和CsSPL15。

2.9 甜橙SPL基因的表達(dá)特異性分析

選擇花和葉片中高表達(dá)基因CsSPL3、CsSPL4、CsSPL7、CsSPL8、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15，在甜橙早花品種‘贛南早’和對照品種‘紐荷爾’成花階段進(jìn)行相對表達(dá)量檢測(圖8)。結(jié)果顯示，8個CsSPLs在兩甜橙品種的花芽和葉片中均有表達(dá)。各時期CsSPLs在花芽和葉片中的相對表達(dá)量表現(xiàn)為早花品種‘贛南早’均高于對照品種‘紐荷爾’。其中，在4時期和5時期，CsSPLs在兩甜橙品種的相對表達(dá)差異顯著，‘贛南早’比‘紐荷爾’上調(diào)數(shù)倍。這些結(jié)果證明，CsSPLs在甜橙成花發(fā)育和開花時期等過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

3 討 論

SPL基因家族廣泛存在于植物中，且基因成員數(shù)量不會隨著基因組大小的變化而成比例變化[17]。本研究從甜橙基因組中鑒定得到15個CsSPLs，其數(shù)量較蘋果(27個)少，與番茄(15個)一致，比野草莓(14個)多[3,9]。15個CsSPLs的內(nèi)含子-外顯子數(shù)量差異較大，40%的CsSPLs含有2個內(nèi)含子和3個外顯子，最多的CsSPL15的內(nèi)-外顯子數(shù)量均為9，而最少的CsSPL3僅含1個內(nèi)含子和2個外顯子。該結(jié)果與前人在苦蕎[18]和小麥[19]中的研究結(jié)果相近。CsSPL12的基因結(jié)構(gòu)不同于CsSPL10和CsSPL15，這可能是同一亞族不同基因在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了內(nèi)含子的丟失或增加。此外，CsSPLs的氨基酸長度變化范圍較大，這可能與CsSPLs的功能多樣性有關(guān)。

Preston 等[20]根據(jù)進(jìn)化關(guān)系將擬南芥SPL蛋白序列的進(jìn)化樹構(gòu)建為8個亞族。本研究中甜橙和擬南芥SPL蛋白序列聚類為9個亞族，其中AtSPLs同樣被劃分在除S4亞族之外的8個亞族，而CsSPLs被劃分在S1、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9亞族。CsSPL4和AtSPL3分別被劃分在2個亞族，需進(jìn)一步研究其功能的互補(bǔ)性。另外，CsSPLs的啟動子區(qū)域包括大量與植物生長發(fā)育和逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，劉婷婷等[21]也發(fā)現(xiàn)蘿卜SPL基因家族成員啟動子上存在激素、低溫和干旱的響應(yīng)元件，支持了本研究的分析結(jié)果。

目前已有許多研究證明SPL基因家族參與花的生長發(fā)育，在調(diào)控植物成花周期過程中發(fā)揮重要作用[22]。本研究分析了花和葉片中高表達(dá)CsSPLs在兩甜橙品種中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)各時期CsSPL3、CsSPL4、CsSPL7、CsSPL8、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15均在早花品種‘贛南早’中優(yōu)勢表達(dá)；其中4和5時期，CsSPLs在兩甜橙品種花芽和葉片中的相對表達(dá)差異顯著增加。推測CsSPLs積極參與對甜橙開花周期的調(diào)控過程。本研究全面分析了甜橙SPL基因家族，發(fā)現(xiàn)CsSPLs響應(yīng)甜橙花芽分化和開花過程，為解析CsSPLs調(diào)控開花周期的功能機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料，以便在后續(xù)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。甜橙中參與成花的關(guān)鍵基因的挖掘?yàn)樘鸪鹊脑缡?、鮮果非集中上市提供了新的途徑。