李佳欣，石曉虹，齊潔敏

（承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北承德 067000）

葡萄胎（hydatidiform mole，HM）是女性生殖系統(tǒng)常見的滋養(yǎng)層細(xì)胞疾病，有良性葡萄胎和惡性葡萄胎之分，多見于育齡期婦女。目前組織病理學(xué)診斷是臨床上主要的診斷方法，但是有些病人在發(fā)生轉(zhuǎn)移后才能確診，給臨床及時(shí)診斷帶來困難。惡性葡萄胎發(fā)展的關(guān)鍵因素之一是細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，而單一病理學(xué)診斷缺乏鑒別良、惡性葡萄胎的可靠指標(biāo)，研究其表達(dá)變化可能對(duì)臨床鑒別診斷良、惡性葡萄胎有意義。因此本實(shí)驗(yàn)選擇與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)P-選擇素，聯(lián)合采用qRT-PCR技術(shù)、免疫組化SP法及Western Blot技術(shù)，在基因及蛋白水平上分析其在良、惡性葡萄胎組織中的表達(dá)，綜合分析不同點(diǎn)，為臨床大夫早期鑒別診斷以及精準(zhǔn)治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集河北省承德市醫(yī)院、承德市婦幼保健院、承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和秦皇島市第一醫(yī)院2016年6月～2019年10月經(jīng)手術(shù)切除的良性葡萄胎組織標(biāo)本50例，惡性葡萄胎組織標(biāo)本22例（術(shù)后病理已證實(shí)為惡性葡萄胎），所有病例臨床病理資料齊全。

1.2 組織標(biāo)本的處理

將組織標(biāo)本分為兩部分，一部分固定在10%中性甲醛液中，之后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片等步驟，用于免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。另一部分新鮮組織存放于液氮罐中，提取組織mRNA和蛋白以進(jìn)行qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)。

1.3 試劑

IgG羊抗兔二抗（KPL公司）；β-actin抗體（Bioworld生物公司）；蛋白Marker（Thermo公司）；免疫組化試劑盒（中杉金橋公司）；轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒（北京天根生化科技公司）；大連寶生物公司設(shè)計(jì)合成內(nèi)參基因和目的基因引物，引物序列如表1。

表1 引物序列

1.4 方法

1.4.1 qRT-PCR技術(shù) 向新鮮組織標(biāo)本中加入適量Trizol，用組織研磨儀對(duì)其進(jìn)行充分研磨，然后離心提取組織中的總RNA，操作全程注意低溫?zé)o酶，最后測(cè)定RNA濃度。參照試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為穩(wěn)定的cDNA后，進(jìn)行qRTPCR反應(yīng)檢測(cè)P-選擇素 mRNA的表達(dá)。將引物、模板等依次加入八連排管中后，放入qRT-PCR儀中，參照說明書設(shè)置反應(yīng)程序：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)，其中所有樣本設(shè)置3個(gè)副孔，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。采用2-△△Ct相對(duì)定量法表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 免疫組化SP法檢測(cè) 標(biāo)本制成蠟塊后進(jìn)行切片，參照試劑盒說明書步驟染色，當(dāng)惡性葡萄胎細(xì)胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為P-選擇素陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野進(jìn)行雙盲判定。最后依據(jù)P-選擇素染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)聯(lián)合判定結(jié)果。（1）染色強(qiáng)度評(píng)分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。（2）陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：＜5%為0分，5%~25%為1分，25~50%為2分，≥50%為3分，上述兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘，若得分0~1分為，2~3分為+，4~6分為++，＞6分為+++[1]。

1.4.3 Western Blot技術(shù)檢測(cè) 稱取約100mg新鮮的良、惡性葡萄胎組織置于勻漿器中，加入1ml裂解液研磨，待靜置裂解后離心，取上清于新的EP管中，測(cè)定總蛋白濃度后進(jìn)行加熱變性處理。40μg蛋白上樣量，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉2h后加入一抗，P-選擇素抗體濃度為1:500，β-actin抗體濃度為1:3000，4℃孵育過夜。第二天，搖床復(fù)溫1h，TBST洗膜后，二抗?jié)舛?:10000孵育50min，最后采用ECL化學(xué)發(fā)光法發(fā)光并采集圖像。條帶灰度值用Image-J軟件分析，目的蛋白條帶灰度值比內(nèi)參蛋白條帶灰度值，即為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 P-選擇素mRNA的表達(dá)情況

與良性葡萄胎組織相比（6.81±0.20），惡性葡萄胎組織（8.63±0.41）P-選擇素mRNA的表達(dá)明顯增多（t=13.43，P＜0.05，見圖1）。

圖1 P-選擇素mRNA在良、惡性葡萄胎組織中的表達(dá)

2.2 P-選擇素蛋白的表達(dá)情況

2.2.1 免疫組化結(jié)果 P-選擇素蛋白的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于良、惡性葡萄胎組織滋養(yǎng)層細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)（如圖2）。與良性葡萄胎組織相比，惡性葡萄胎組織中P-選擇素蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率及陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度顯著高于良性葡萄胎組織（P＜0.05），見表2。

表2 P-選擇素蛋白在良、惡性葡萄胎組織中的表達(dá)情況

圖2 免疫組化SP法檢測(cè)P-選擇素蛋白的表達(dá)

2.2.2 Western Blot 技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示 與良性葡萄胎組織相比（0.55±0.04），惡性葡萄胎組織（1.02±0.06）P-選擇素蛋白表達(dá)較良性葡萄胎組織增強(qiáng)（t=24.53，P＜0.05，圖3），這與免疫組化結(jié)果互相吻合，在蛋白水平上起到相互驗(yàn)證的作用，結(jié)果更準(zhǔn)確。

圖3 P-選擇素蛋白良、惡性葡萄胎在的表達(dá)

3 討論

選擇素是粘附因子中一個(gè)重要的大家族[2]，包括E-選擇素、L-選擇素和P-選擇素，其中,P-選擇素主要參與炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化以及血栓形成等病理過程。Qi等[3]發(fā)現(xiàn)P-選擇素通過介導(dǎo)血小板的粘附促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。周俊超等[4]采用免疫組化及PCR法檢測(cè)腦膜瘤組織中P-選擇素表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組同期健康體檢者相比，P-選擇素表達(dá)水平顯著升高，認(rèn)為P-選擇素可以作為腦膜瘤侵襲性判定的參考指標(biāo)。馮蓮[5]在大腸癌研究中發(fā)現(xiàn)P-選擇素表達(dá)升高，認(rèn)為P-選擇素參與了大腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程，可作為大腸癌臨床防治的新方向，這與Korniluk等[6]的研究結(jié)果一致。Nasti等[7]在P-選擇素基因敲除的小鼠體內(nèi)接種乳腺癌細(xì)胞，與野生型小鼠相比，缺乏P-選擇素的小鼠存活率更高，抑制P-選擇素對(duì)乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有重要的治療意義。在黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn),P-選擇素可介導(dǎo)血小板黏附，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[8]，進(jìn)而建立小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移瘤模型將P-選擇素敲除，發(fā)現(xiàn)P-選擇素的缺失抑制了黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移[9]。Rip1-Tag2小鼠胰島β細(xì)胞瘤中對(duì)P-選擇素進(jìn)行了敲除，同樣也發(fā)現(xiàn)P-選擇素缺失可抑制Rip1-Tag2小鼠胰島β細(xì)胞瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。郭杏丹等[11]發(fā)現(xiàn)，P-選擇素在卵巢癌組織中高表達(dá)，其蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者3年生存率低于陰性表達(dá)患者，這種高表達(dá)狀態(tài)對(duì)患者預(yù)后不利。劉夏炎等[12]研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌患者的預(yù)后與外周血P-選擇素的表達(dá)具有相關(guān)性。王闖等[13]研究發(fā)現(xiàn)，P-選擇素參與了宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展，尤其是浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的過程。在胃癌中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者P-選擇素陽(yáng)性表達(dá)率增高，且P-選擇素陽(yáng)性表達(dá)者5年生存率明也顯著低于陰性表達(dá)者，這表明P-選擇素陽(yáng)性表達(dá)的胃癌易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移并且預(yù)后差[14]。在非小細(xì)胞癌[15]、子宮內(nèi)膜癌[16]、喉癌[17]的研究中均可發(fā)現(xiàn)P-選擇素的表達(dá)升高，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。侵襲、轉(zhuǎn)移不可缺少環(huán)節(jié)就是惡性腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等粘附，P-選擇素作為粘附因子通過介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞與血小板發(fā)生黏附對(duì)腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用[7]，因此抑制P-選擇素表達(dá)就有可能降低腫瘤細(xì)胞與血小板與黏附力，達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移目的。

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)研究對(duì)P-選擇素在良、惡性葡萄胎組織中的表達(dá)存在空缺。本實(shí)驗(yàn)從基因和蛋白水平全面檢測(cè)粘附因子P-選擇素在良、惡性葡萄胎組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)惡性葡萄胎組織P-選擇素mRNA、蛋白表達(dá)水平與良性葡萄胎相比較均有升高（P＜0.05），說明P-選擇素在蛋白水平和基因水平上都參與了葡萄胎的發(fā)生、發(fā)展。在良性葡萄胎轉(zhuǎn)變成惡性葡萄胎過程中，存在著P-選擇素mRNA和蛋白表達(dá)從低表達(dá)量到高表達(dá)量的變化過程，當(dāng)其表達(dá)量累積到一定程度會(huì)發(fā)生質(zhì)變，其轉(zhuǎn)化機(jī)制需要更深一步研究。

從病理學(xué)角度看，葡萄胎的侵襲性、轉(zhuǎn)移性可作為良、惡性葡萄胎的區(qū)別點(diǎn)，如果能夠找出葡萄胎侵襲、轉(zhuǎn)移性的標(biāo)志物，可利用子宮內(nèi)膜組織刮出的標(biāo)本進(jìn)行良、惡性葡萄胎的鑒別診斷。我們用三種方法在基因及蛋白水平上檢測(cè)并進(jìn)行綜合分析，每種試驗(yàn)方法結(jié)果是一致的，故而最后得出的結(jié)論可靠性、準(zhǔn)確性更大。大部分惡性葡萄胎患者采用放化療手段而不進(jìn)行手術(shù)，惡性葡萄胎標(biāo)本收集難，病例數(shù)較少，日后隨著收集的樣本數(shù)量增多，可做深層次研究為早期發(fā)現(xiàn)葡萄胎惡變可提供新線索。