謝紅波，趙 晴，穆威杉，史萌萌，石林春，劉金欣*，趙春穎*，李云峰

（1.承德醫(yī)學院 河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000； 2.中國醫(yī)學科學院＆北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所）

蒼術(shù)，為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea（Thunb.）DC.或北蒼術(shù)Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根莖，具有健脾燥濕、祛風散寒、明目的功效[1,2]。自2003年“非典”事件之后，蒼術(shù)市場需求量逐年上漲，野生資源日益枯竭，市場供需矛盾尖銳，急需擴大蒼術(shù)商品生產(chǎn)規(guī)模[3-6]。然而，蒼術(shù)自然狀態(tài)下的結(jié)實率遠低于關(guān)蒼術(shù)Atractylodes japonica Koidz.和白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.[5]。同時，部分地區(qū)常將關(guān)蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)Atractylodes koreana (Nakai) Kitam.混作北蒼術(shù)用于入藥[7]，造成了蒼術(shù)種子市場存在種源混亂、種質(zhì)混雜現(xiàn)象的主要原因。種子作為中藥材生產(chǎn)的源頭，保證其基原的準確性顯得尤為重要。DNA條形碼技術(shù)是通過利用不同生物基因組中一段通用的、具有差異特征的DNA片段來進行物種鑒定，可以不受外界環(huán)境影響及經(jīng)驗的限制，具有客觀、準確等特點，其歷經(jīng)20余年的發(fā)展，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物類及動物類中藥材鑒定領(lǐng)域[8-10]。與中藥材相比，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對中藥材種子鑒定研究主要面臨以下問題[11,12]：（1）中藥材種子大小不一，微小種子的DNA難以提??；（2）種子通常含有大量的油脂或淀粉類物質(zhì)，抑制PCR的擴增效率；（3）對于異花授粉植物，種子多為雙親遺傳的雜交體，雜交對測序質(zhì)量的影響尚需驗證。本研究嘗試基于ITS2和psbA-trnH序列對北蒼術(shù)種子進行鑒定研究及序列特征分析，探討北蒼術(shù)種子DNA條形碼技術(shù)鑒定的可行性，以期為保障北蒼術(shù)種子基原的準確鑒定提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

SQP型電子天平（德國Sartorius公司），MM400型球磨儀（德國Retsch公司），T100型聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增儀（美國Bio-Rad公司），NanoDropTM One型超微量分光光度計（美國Thermo Scientific公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），ChemiDocTMXRS+型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司），SZX16型高級研究體視顯微鏡（日本Olympus公司），植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.2 樣品收集

從蒼術(shù)種植基地和市場收集北蒼術(shù)種子12份，包括河北省承德市、張家口市、保定市以及遼寧省、甘肅省等地區(qū)，種子經(jīng)承德醫(yī)學院趙春穎教授鑒定（表1）。所有樣品存放于承德醫(yī)學院中藥研究所（河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室）。

表1 種子樣品的采集信息

1.3 種子的形態(tài)學觀察

隨機挑取北蒼術(shù)種子20粒，利用體視顯微鏡觀察種子的外觀形態(tài)特征（形狀、大小、顏色、表面紋理等），使用數(shù)顯游標卡尺（上海史丹利五金工具有限公司）測量種子的長度和寬度。參照《農(nóng)作物種子檢測規(guī)程》GB/T3543.7-1995，采用百粒法測定種子的千粒重。

1.4 DNA提取、PCR擴增及測序

隨機挑選顆粒飽滿的種子1粒，用75%酒精棉對種子表面進行消毒，稱重后研磨。剩余步驟參照植物基因組DNA提取試劑盒產(chǎn)品說明書提取種子的總DNA，并調(diào)整其水浴條件為56℃，水浴8~12 h或過夜。ITS2序列和psbA-trnH序列的擴增引物、PCR擴增體系和擴增程序參照“中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”[9]。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后使用ABI 3730XL型測序儀進行雙向測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用超微量分光光度計測定種子DNA的濃度和純度，對其質(zhì)量進行評價；采用瓊脂糖凝膠電泳法對PCR產(chǎn)物進行檢測，并計算其PCR擴增成功率；利用CodonCode Aligner V9.0.1對測序峰圖進行質(zhì)量評估、預(yù)處理及序列拼接?；陔[馬爾可夫模型（hidden markov model，HMM）對獲得的ITS2序列進行注釋[13]。psbA-trnH序列根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫上的參考序列進行處理，其中，psbA的保守區(qū)序列為CGAAGCTCCATCTACAAATGGATAA，trnH的保守區(qū)序列為GGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAG。利用MEGA-X進行多序列比對和序列特征分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 北蒼術(shù)種子形態(tài)特征

北蒼術(shù)種子為瘦果，倒卵圓形或長橢圓形，偶有彎曲，長5.33~7.91mm，寬1.87~3.28mm；表面褐色，有不規(guī)則條紋狀縱溝，密被白色長直毛，有時稀疏，順向貼服；頂端有羽毛狀冠毛，黃褐色，易脫落；基部呈環(huán)狀，萌發(fā)時胚根由此突破種子；胚直立，具有2片子葉，肉質(zhì)，無胚乳。北蒼術(shù)種子的千粒重約為14.01g。北蒼術(shù)種子外觀形態(tài)特征如圖1。

圖1 北蒼術(shù)種子的外觀形態(tài)特征

2.2 DNA提取結(jié)果及PCR擴增成功率

北蒼術(shù)單粒種子的重量在13.87~26.35 mg之間，根據(jù)趙晴等[11]提出的“中藥材種子DNA條形碼分子鑒定原則”，采用單粒取樣的方式。DNA提取結(jié)果顯示，北蒼術(shù)種子樣品的DNA濃度均在148.4~418.4ng/μL范圍內(nèi)，平均值為268.89ng/μL，其在260nm和280nm處的吸光度比值A(chǔ)260nm/A280nm處于2.0~2.1之間，表明所提取的種子DNA質(zhì)量良好，均可滿足后續(xù)PCR擴增要求（表2）。使用ITS2和psbA-trnH通用引物對所獲得的種子DNA進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測后發(fā)現(xiàn)，所有種子樣品的PCR產(chǎn)物均可檢測到1條清晰、明亮的條帶，PCR擴增成功率為100%（圖2）。

表2 北蒼術(shù)種子的DNA提取質(zhì)量

圖2 北蒼術(shù)種子的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 DNA測序及序列質(zhì)量分析

去除低質(zhì)量區(qū)域和引物序列后，ITS2單向測序的Contig information顯示堿基質(zhì)量Q（quality value）≥20的比例為99.1%，且經(jīng)雙向測序拼接后均可獲得高質(zhì)量的測序結(jié)果，拼接結(jié)果長度均＞225 bp，其Contig information顯示Q30的堿基數(shù)量占比99.6%（圖3）；盡管獲得的psbA-trnH序列由于串聯(lián)重復(fù)序列單元（poly A/T），導(dǎo)致部分序列測序時發(fā)生信號減弱的現(xiàn)象，但其單向測序結(jié)果的Contig information顯示Q20的堿基數(shù)量比例高達98.2%；經(jīng)雙向測序拼接后的序列長度均＞385 bp，且Contig information顯示Q30的堿基數(shù)量占比98.2%，序列質(zhì)量良好（圖4）。

圖3 北蒼術(shù)種子樣品HSZZ2894_2F的ITS2序列峰圖

圖4 北蒼術(shù)種子樣品HSZZ2894_PA的psbA-trnH序列峰圖

2.4 北蒼術(shù)種子DNA條形碼序列特征分析

共獲得北蒼術(shù)種子DNA條形碼序列24條，包括12條ITS2序列和12條psbA-trnH序列。其中ITS2的序列長度為228~230 bp，比對后長度230 bp，GC含量在68.7%~69.3%之間，平均值為68.02%；獲得的12條ITS2序列除220和223位點存在插入/缺失外，尚無發(fā)現(xiàn)變異位點，序列特征（圖5）。

圖5 北蒼術(shù)種子ITS2序列的序列特征

12條北蒼術(shù)種子的psbA-trnH序列長度為389~398 bp，比對后序列長度為401 bp，GC含量在23.8%~24.3%之間，平均值為24.05%；含有3個變異位點，分別為32、77位點的A-G變異，86位點的C-A變異；在50、154、340、365位點分別存在一個插入/缺失位點，在233~238位點存在一個6 bp的插入/缺失區(qū)域；12條psbA-trnH序列分為4個單倍型，H1為主導(dǎo)單倍型，包含9條序列，H2、H3和H4單倍型各包含1條序列，其主導(dǎo)單倍型序列特征（圖6）。

圖6 北蒼術(shù)種子psbA-trnH序列主導(dǎo)單倍型H1的序列特征

3 討論

3.1 DNA條形碼技術(shù)可以用于中藥材北蒼術(shù)種子的鑒定

北蒼術(shù)種子含有豐富的油脂類成分[15]，在研磨時容易被氧化，影響DNA的提取質(zhì)量和濃度[9]。本研究在DNA提取過程中，采用單粒取樣的方式，可以有效避免不同北蒼術(shù)種子之間遺傳物質(zhì)的相互干擾。分別使用酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)和氯仿/異戊醇（24:1）進行抽提，加入與上清液等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇進行DNA沉淀，所有樣品均可獲得高質(zhì)量的北蒼術(shù)種子DNA，滿足后續(xù)PCR擴增需求。采用瓊脂糖凝膠電泳法對獲得的PCR產(chǎn)物進行檢測，發(fā)現(xiàn)所有種子樣品的PCR產(chǎn)物均可檢測到1條清晰、明亮的條帶，PCR擴增成功率為100%。盡管部分種子樣品由于插入/缺失以及poly結(jié)構(gòu)導(dǎo)致單向序列的測序質(zhì)量較低，但雙向拼接后皆可獲得較高質(zhì)量的測序結(jié)果。對北蒼術(shù)種子的ITS2和psbA-trnH序列特征分析表明，不同產(chǎn)地、不同批次的北蒼術(shù)種子種內(nèi)變異較小，遺傳穩(wěn)定性好。由此可見，基于DNA條形碼技術(shù)可以穩(wěn)定獲得北蒼術(shù)種子的ITS2和psbA-trnH序列，利用DNA條形碼技術(shù)對北蒼術(shù)種子的基原物種進行鑒定分析具有一定的可行性。

3.2 DNA條形碼技術(shù)有利于推進蒼術(shù)種子標準化

當前，我國中藥材種子種苗尚缺乏系統(tǒng)的質(zhì)量管理體系，現(xiàn)有的中藥材種子種苗相關(guān)標準中僅有少部分品種如人參、三七等是專門針對中藥材而制定的，大部分歸屬于農(nóng)業(yè)和林業(yè)，涉及的中藥材不足《中國藥典》收載的20%，有待進一步完善[16]。種子種苗是中藥材生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，保障中藥材種子種苗的真實性是中藥材安全生產(chǎn)的首要條件和重要前提[17]。然而，傳統(tǒng)的中藥材種子真?zhèn)舞b定往往依靠種子的形態(tài)特征和顯微特征進行，對檢測人員的專業(yè)知識和經(jīng)驗具有較高的要求，特別是對于同屬植物或細小類種子的鑒定存在一定困難[12,17]。相對于其他傳統(tǒng)及分子鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)具有三大明顯優(yōu)勢：鑒定結(jié)果可重復(fù)性良好，方法通用性強，可構(gòu)建統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫和鑒定平臺，易于推廣和標準化[18]。劉金欣等[19]基于構(gòu)建的黃芩DNA條形碼數(shù)據(jù)庫對市售黃芩種子進行鑒定，表明基于ITS2序列可用于黃芩種子的物種鑒定。石林春等[12]通過對51份知母種子進行鑒定研究，建議psbA-trnH作為知母種子鑒定的DNA條形碼序列，可用于知母種子的真實性鑒定。本研究利用ITS2和psbA-trnH序列對北蒼術(shù)種子進行鑒定研究及序列特征分析，進一步證明DNA條形碼技術(shù)可以有效應(yīng)用于中藥材種子的鑒定，有利于實現(xiàn)對中藥材種子的數(shù)字化監(jiān)管，推進中藥材種子標準化工程，對于中藥現(xiàn)代化具有重要的意義。