劉明偉，柏友蘭，王小杰，李 欣

（承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

胃癌是全球第四大惡性腫瘤，每年大約有85萬新病例和65萬死亡病例[1]。胃癌的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，傳統(tǒng)的手術(shù)和化療效果都不甚理想，復(fù)發(fā)率高或毒副作用較大。由于生物治療因毒副作用小而廣受歡迎，因此迫切需要在分子腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，從而找到有效的治療靶點(diǎn)。

膜聯(lián)蛋白（annexin，ANX）是高度保守的蛋白質(zhì)，是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族，都具有相似的核心結(jié)構(gòu)域，幾乎存在于所有組織和細(xì)胞中，主要分布在質(zhì)膜的內(nèi)表面，在細(xì)胞骨架活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞粘附、膜受體調(diào)節(jié)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和有絲分裂等方面具有重要作用[2]。膜聯(lián)蛋白A7（annexinA7，ANXA7）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的膜聯(lián)蛋白，影響許多生理過程，包括分泌、激素釋放、膜轉(zhuǎn)運(yùn)等[3]。大量研究發(fā)現(xiàn)，ANXA7在許多惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，在胃癌組織中，ANXA7表達(dá)顯著增高，并發(fā)現(xiàn)，ANXA7 可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡[4]。本實(shí)驗(yàn)通過敲低胃癌MGC-803細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)，觀察其對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為進(jìn)一步研究胃癌治療靶點(diǎn)提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人胃癌MGC-803細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；細(xì)胞1640培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；lipofectamine3000（lipo3000）轉(zhuǎn)染試劑購自美國(guó)Invitroden公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自聯(lián)科生物；靶向ANXA7的siRNA購自上海吉瑪基因；ANXA7鼠抗人單克隆抗體購自美國(guó)Epitomics公司；PCNA鼠抗人單克隆抗體購自武漢三鷹生物；Casepase-3、Cleaved casepase-3及β-actin兔抗人單克隆抗體購自美國(guó)Abcam公司；羊抗鼠及羊抗兔二抗購自美國(guó)KPL公司；MTT購自河北貝博實(shí)驗(yàn)用品公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胃癌MGC-803細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，每孔3×105個(gè)，24h內(nèi)使細(xì)胞匯合度達(dá)到40%~60%。將細(xì)胞分為2組，以靶向ANXA7的siRNA轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞為低表達(dá)組（ANXA7-si）、以轉(zhuǎn)染陰性siRNA的細(xì)胞為陰性對(duì)照組（NC）。按照lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將30pmol siRNAOligo和5μl lipo3000分別加入無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，使終體積均為250μl，靜置5min，將兩液混勻，靜置20min，然后將混合液分別加至對(duì)應(yīng)的孔中。轉(zhuǎn)染后6h更換含血清的培養(yǎng)基。

1.3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ANXA7蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48h，6孔板每孔加入100μl RIPA裂解液，提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，蛋白變性后80V穩(wěn)壓電泳，每泳道30μg樣品，電泳后120mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，將各膜浸入ANXA7鼠抗人單克隆抗體（1:1000）室溫孵育2h，TBST洗膜3次，每次15min，后羊抗鼠二抗（1:2000）室溫孵育1.5h，TBST洗膜3次，每次5min，ECL化學(xué)發(fā)光儀顯影。Quantity One軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量，即目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值得比值。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以4×103個(gè)/孔接種于96孔板，每組5個(gè)復(fù)孔，各孔加入MTT 10μl（5mg/mL）,37℃孵育4h后棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔再加150μl DMSO震蕩10min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處的OD值，取各組平均值繪制增殖曲線。

1.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，以1000個(gè)/孔接種于6孔板，每孔加入RPMI 1640培養(yǎng)基2ml，培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見團(tuán)落時(shí)吸棄培養(yǎng)液，用PBS小心洗兩次后加入4%多聚甲醛固定20min，吸棄多聚甲醛，每孔再加入GIMSA 1ml染色10min，流動(dòng)水小心沖洗后室溫干燥，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的團(tuán)落，拍照并進(jìn)行分析。

1.6 PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將PI（碘化丙啶）溶于含0.1% TritionX-100的PBS中，終濃度為50μg/mL，含RNase 100μg/mL，避光保存；取1ml（1×106）的細(xì)胞懸液，加10μl的PI染液混合，作用10min；加入5ml PBS，1500r/min離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌2次。重懸細(xì)胞，滴片并用蓋玻片封片,上機(jī)檢測(cè)。

1.7 Western blot檢測(cè)增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48h，6孔板每孔加入100μl RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，蛋白變性后80V穩(wěn)壓電泳，每泳道30μg樣品，電泳后120mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，將各膜浸入PCNA、Cleaved casepase-3單抗（1:1000）室溫孵育2h，TBST洗膜3次，每次15min，后加入羊抗鼠二抗（1:2000）和羊抗兔二抗（1:2000）室溫孵育1.5h，TBST洗膜3次，每次5min，ECL化學(xué)發(fā)光儀顯影。Quantity One軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量，即目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)ANXA7敲低效率

如圖1所示，與陰性對(duì)照組（si-con）相比，實(shí)驗(yàn)組（si-ANXA7）ANXA7的表達(dá)顯著降低，效率達(dá)到82.33%。

圖1 Western blot檢測(cè)ANXA7的表達(dá)

2.2 ANXA7低表達(dá)抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖

如圖2所示，MTT和平板克隆法檢測(cè)結(jié)果均顯示，與陰性對(duì)照組（si-con）相比，實(shí)驗(yàn)組（si-ANXA7）的MGC-803細(xì)胞增殖受到顯著抑制。

圖2 ANXA7低表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖

2.3 ANXA7低表達(dá)促進(jìn)胃癌MGC-803細(xì)胞的凋亡

與陰性對(duì)照組（si-con）相比，實(shí)驗(yàn)組（si-ANXA7）的MGC-803細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)（圖3）。

圖3 ANXA7低表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡

2.4 增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組（si-ANXA7）中PCNA的表達(dá)顯著降低，而Cleaved casepase-3的表達(dá)顯著增高。

圖4 胃癌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，預(yù)后較差，手術(shù)治療仍然是一線治療方法，盡管已在外科技術(shù)、放療、化療等方面取得了進(jìn)步，但胃癌仍然是全球癌癥死亡的第二大原因。早期胃癌的5年生存率可達(dá)90%以上[5]，但由于早期診斷率低，大多數(shù)患者就診時(shí)已是晚期。因此，尋找早期的敏感診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)非常重要。

膜聯(lián)蛋白A7是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白的一員，影響許多功能和代謝過程，并與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。許多研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中ANXA7的表達(dá)增高：Srivastava等[7]發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌中ANXA7高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)ANXA7的表達(dá)水平與預(yù)后不良呈正相關(guān)；Hung等[8]研究表明，ANXA7高表達(dá)顯著促進(jìn)了惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生；Sun等[9]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中ANXA7顯著高表達(dá)，且其表達(dá)水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；袁虎方等[10]研究發(fā)現(xiàn)ANXA7在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。有研究證明，敲低人肝癌細(xì)胞中ANXA7可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移[11]；敲低胃癌細(xì)胞中ANXA7導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率顯著增高[12]。多種研究結(jié)果表明，ANXA7的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移、侵襲等過程密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過敲低胃癌MGC-803細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)，進(jìn)一步闡明其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

PCNA是一種細(xì)胞增殖核抗原，作為DNA聚合酶的附屬蛋白，通過促進(jìn)DNA聚合酶延伸DNA，促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。Casepase是一組半胱氨酸蛋白酶，可特異性的斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵，而Casepase-3是其中一種重要的剪切酶，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著不可替代的作用，當(dāng)細(xì)胞中的caspase-3被激活后，即成為cleaved caspase-3,可顯著促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，因此cleaved caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的可靠標(biāo)記。有研究發(fā)現(xiàn)，激活caspase-3活性可以顯著抑制人骨髓瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡[14]。Lin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)caspase-3的活性可以抑制卵巢的生長(zhǎng)。Zhou等[16]研究發(fā)現(xiàn)，抑制caspase-3的表達(dá)促進(jìn)了人結(jié)腸癌的增殖。抑制caspase-3的激活可以降低胃癌細(xì)胞的凋亡[17]，而下調(diào)cleaved caspase-3的表達(dá)增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低胃癌MGC-803細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組PCNA的表達(dá)顯著降低，而cleaved caspase-3的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖顯著降低而凋亡率顯著高于對(duì)照組，表明低表達(dá)ANXA7后可能通過抑制PCNA表達(dá)的同時(shí)增加caspase-3的激活，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，在胃癌MGC-803細(xì)胞中低表達(dá)ANXA7，可能在抑制PCNA表達(dá)的同時(shí)增加cleaved caspase-3的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，并有望通過更深層次的研究，使ANXA7成為胃癌診斷和治療的新靶點(diǎn)。