石暉琴，張 工，張彥民，遲煥榮，李 沛，李兆飛，趙國(guó)忠*

（1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.山東巧媳婦食品集團(tuán)有限公司，山東 淄博 255400；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

食醋在我國(guó)有著3 000多年的發(fā)展歷史，其作為調(diào)味品可以提升食物的風(fēng)味和口感。大紅浙醋是一種屬于廣東特色的中國(guó)傳統(tǒng)食醋，由于復(fù)雜的微生物發(fā)酵體系，使其呈現(xiàn)清香的風(fēng)味和透亮的玫瑰色。大紅浙醋主要由糖化階段、酒精發(fā)酵階段以及醋酸發(fā)酵階段發(fā)酵而成[1]。

醋酸菌作為醋酸發(fā)酵階段中的重要微生物，其屬于革蘭氏陰性的需氧菌，能夠快速并不完全氧化大量的碳水化合物和醇，產(chǎn)生有機(jī)酸作為最終產(chǎn)物[2]。有機(jī)酸決定了食醋的品質(zhì)，為食醋清香而酸甜的風(fēng)味作出了重要貢獻(xiàn)。有趣的是，醋酸菌包含很多新屬和種，每個(gè)菌株都有獨(dú)特的生長(zhǎng)需求。醋酸菌可以利用廣泛的化合物作為氮的來(lái)源，如從簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)化合物到復(fù)雜的有機(jī)化合物，甚至銨離子都可以作為唯一的氮源提供醋酸菌生長(zhǎng)代謝。因此，研究不同種類(lèi)醋酸菌生長(zhǎng)的具體營(yíng)養(yǎng)源濃度和類(lèi)型是解除其生長(zhǎng)限制的重要前提[3-4]。有研究通過(guò)單一營(yíng)養(yǎng)缺乏實(shí)驗(yàn)，確定了天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和色氨酸是巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）CICIM B7003的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)氨基酸[5]。還有研究報(bào)道，天冬氨酸和谷氨酸能對(duì)巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）的代謝和抗酸脅迫產(chǎn)生有益影響[6]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)氨基酸是通過(guò)平衡極端環(huán)境條件下的氧化還原電勢(shì)[7]，提升糖利用率以及保護(hù)特定微生物免受競(jìng)爭(zhēng)的侵害，以此對(duì)微生物的代謝產(chǎn)生影響[8-11]。

為了研究大紅浙醋發(fā)酵中特定醋酸菌的營(yíng)養(yǎng)需求，本研究首先采用鈣透明圈法從大紅浙醋中分離篩選醋酸菌，并通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定；然后研究10種氮源對(duì)巴氏醋酸桿菌產(chǎn)酸量的影響，并對(duì)10種氮源組成進(jìn)行定性和定量分析，得出產(chǎn)酸代謝的關(guān)鍵氨基酸；最后挑出10種關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行驗(yàn)證，不僅可以了解醋酸菌對(duì)氨基酸的需求，還可以通過(guò)使用干預(yù)手段直接投入關(guān)鍵氨基酸以降低食醋生產(chǎn)成本和提升食醋發(fā)酵效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大紅浙醋樣品：采用無(wú)菌方式從廣州致美齋食品有限公司獲取發(fā)酵不同天數(shù)的大紅浙醋樣品。

1.1.2 試劑

5種酵母抽提物（yeast extract，YE）1#YE、2#YE、3#YE、4#YE、5#YE：安琪酵母股份有限公司；動(dòng)物蛋白胨、小麥蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；1#大豆蛋白胨、2#大豆蛋白胨（均為生化試劑）：北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）：天津市江天化工股份有限公司；普通凝膠脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）回收試劑盒：北京天根生化試劑公司；牛骨蛋白胨（生化試劑）、革蘭氏染色試劑盒、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸、絲氨酸、纈氨酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基[12]：1%1#YE，1%葡萄糖，2%瓊脂粉，2%CaCO3，0.01%硫酸鎂，自然pH，121 ℃滅菌20 min，使用前加入4%（V/V）無(wú)水乙醇。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[12]：1%不同種類(lèi)氮源，1%葡萄糖，0.01%硫酸鎂，自然pH，121 ℃滅菌20 min，使用前加入4%（V/V）無(wú)水乙醇。

斜面保藏培養(yǎng)基[12]：1%1#YE，1%葡萄糖，2%瓊脂粉，2%CaCO3，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DY04-13-44-00高壓蒸汽滅菌鍋：上海東亞壓力容器有限公司；MTZ18H009離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；ZHJH-C1115C超凈工作臺(tái)：上海智城儀器有限公司；FE28-Standard pH計(jì)：梅特勒-托利多有限公司；ZWY-100H恒溫培養(yǎng)箱：上海智城儀器有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Y-600電泳儀：美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；1260 infinityⅡ高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫公司；Kjeltec 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀：丹麥FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌的分離與篩選

在無(wú)菌環(huán)境下稱(chēng)取25 mL大紅浙醋樣品加入225.0 mL無(wú)菌生理鹽水中，常溫下振蕩混勻，梯度稀釋?zhuān)〔煌♂尪鹊臉悠?00 μL涂布于分離純化培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取培養(yǎng)基內(nèi)的單個(gè)菌落進(jìn)行三區(qū)劃線，純化至無(wú)雜菌時(shí)采用斜面保藏培養(yǎng)基保藏備用[13]。挑取純化好的菌落在載玻片上革蘭氏染色，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察[14]。

從固體培養(yǎng)基內(nèi)挑選透明圈較大的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基（氮源為1#YE），30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h。取5 mL菌液，4 ℃、8 000 r/min條件下離心，取上清，用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)上清液pH為7.0，滴加幾滴5%FeCl3搖勻，隨后在酒精燈火焰上將試管加熱至沸騰，觀察試管內(nèi)是否生成紅褐色沉淀，如產(chǎn)生紅褐色沉淀即為產(chǎn)醋酸菌株[12]。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

采用DNA提取試劑盒提取醋酸菌基因組DNA，以其為模板，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)分離菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性45 s、55 ℃復(fù)性50 s、72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃修復(fù)延伸10 min，于4 ℃終止反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系：引物27F、1492R各2 μL，模板2 μL，反應(yīng)混合物20 μL，重蒸水（ddH2O）14 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格后委托金唯智生物科技公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）與已知序列進(jìn)行同源比對(duì)，利用MEGA 6軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[15-16]。

1.3.3 最佳氮源濃度的確定

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、5.0%的1#YE作為氮源，按3%（V/V）的接種量接入分離菌株，檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間的生物量（OD600nm值）和產(chǎn)酸量[17]。

1.3.4 不同氮源總氮含量和組成成分分析

采用凱氏定氮法測(cè)定10種氮源的總氮含量[18]。采用高效液相色譜法對(duì)氮源游離氨基酸和非游離氨基酸進(jìn)行定性和定量測(cè)定[19-20]。

1.3.5 不同氮源對(duì)分離菌株生物量和產(chǎn)酸量的影響

為了保持不同氮源總氮量恒定，液體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)按1%1#YE的總氮量分別添加其他9種氮源，按3%（V/V）的接種量接入分離菌株，檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間的生物量（OD600nm值）和產(chǎn)酸量[17]。

1.3.6 氨基酸缺失實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單氨基酸缺失實(shí)驗(yàn)，確定醋酸菌在酒精醋酸化過(guò)程中的必需營(yíng)養(yǎng)氨基酸。具體步驟如下：設(shè)置包含10種氨基酸的培養(yǎng)基為空白組，再將10種氨基酸分別減少1種（包含9種氨基酸）的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，比較空白組和實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)酸量[2]。

1.3.7 數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每組實(shí)驗(yàn)平行做3次平行后取平均值，最終結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的分離與篩選

采用分離純化培養(yǎng)基從大紅浙醋中分離得到20株有鈣透明圈的菌株，其中菌株SHQ-A發(fā)酵液產(chǎn)生紅褐色沉淀，初步判定其為產(chǎn)醋酸菌株[17，21]，該菌株在分離純化培養(yǎng)基上的菌落及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 菌株SHQ-A的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain SHQ-A

由圖1可知，菌株SHQ-A的菌落呈圓形，表面呈光滑油脂狀，邊緣整齊且具有透明圈；菌株SHQ-A革蘭氏染色后呈紅色短桿狀，為革蘭氏陰性菌，符合醋酸菌的產(chǎn)酸和革蘭氏陰性特性[22-23]。

2.2 菌株SHQ-A的分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA基因序列，采用MEGA 6軟件構(gòu)建菌株SHQ-A的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株SHQ-A的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain SHQ-A based on 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株SHQ-A與Acetobacter pasteurianus（HF947008.1）聚于一支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)觀察，鑒定該菌株為巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurium）。

2.3 提升醋酸菌SHQ-A發(fā)酵產(chǎn)酸性能的研究

2.3.1 總氮添加量的確定

氮源提供必要氨基酸使醋酸菌生長(zhǎng)并進(jìn)行產(chǎn)酸代謝，當(dāng)總氮含量過(guò)高引起氨基酸濃度過(guò)高時(shí)不但不會(huì)促進(jìn)醋酸菌生長(zhǎng)，更可能抑制它的代謝活動(dòng)。因此，選擇適宜的總氮添加量是提升巴氏醋酸桿菌產(chǎn)酸的基礎(chǔ)[24]。1#YE添加量對(duì)巴氏醋酸桿菌SHQ-A生長(zhǎng)和產(chǎn)酸量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同1#YE添加量對(duì)巴氏醋酸桿菌SHQ-A生長(zhǎng)（a）和產(chǎn)酸量（b）的影響Fig.3 Effects of different 1#YE addition on the growth (a) and acid production (b) of Acetobacter pasteurianus SHQ-A

由圖3可知，當(dāng)1#YE含量＜1.0%時(shí)，巴氏醋酸桿菌SHQ-A的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸量極低。但當(dāng)1#YE含量＞1.0%之后，巴氏醋酸桿菌SHQ-A的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸量也并無(wú)優(yōu)勢(shì)?；诟咝г瓌t，確定1#YE的最優(yōu)添加量為1.0%。為了確保不同氮源的可比性，根據(jù)表1所測(cè)定的不同氮源的總氮含量，將1%1#YE定義為參考培養(yǎng)基，因此，每種培養(yǎng)基總氮添加量都應(yīng)保持為0.11%后添加不同種類(lèi)氮源。

表1 添加不同氮源對(duì)總氮含量的影響Table 1 Effect of different nitrogen sources addition on total nitrogen content

2.3.2 不同氮源對(duì)菌株SHQ-A生長(zhǎng)及總酸含量的影響

不同氮源對(duì)巴氏醋酸桿菌SHQ-A生長(zhǎng)及產(chǎn)酸代謝的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同氮源對(duì)巴氏醋酸桿菌SHQ-A生物量（a）和產(chǎn)酸量（b）的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on biomass (a) and acid production (b) of Acetobacter pasteurianus SHQ-A

由圖4可知，相比于蛋白胨，YE明顯對(duì)巴氏醋酸桿菌SHQ-A的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸代謝更具優(yōu)勢(shì)。在發(fā)酵終點(diǎn)，以5#YE為氮源時(shí)，巴氏醋酸桿菌SHQ-A的OD600nm值最高，為1.7；小麥蛋白胨和牛骨蛋白胨為氮源時(shí)，OD600nm值相同且為最低，為0.8。以1#YE為氮源時(shí)，巴氏醋酸桿菌SHQ-A的產(chǎn)酸量最高，為34.5 g/L；動(dòng)物蛋白胨為氮源時(shí)，產(chǎn)酸量最低，為8.8 g/L。

2.3.3 不同氮源組成成分分析

為分析不同氮源導(dǎo)致巴氏醋酸桿菌SHQ-A生物量及產(chǎn)酸量差異的原因，進(jìn)一步對(duì)不同氮源的組成成分進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，整體來(lái)看YE組中的游離氨基酸的數(shù)量高于蛋白胨組。游離氨基酸和小肽比大肽和蛋白質(zhì)更容易轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中[25-26]。此外，氨基酸可增強(qiáng)醋酸菌三磷酸合成和氨基酸脫氨，最終提高細(xì)胞內(nèi)氨濃度以維持細(xì)胞內(nèi)pH的穩(wěn)定性和DNA的修復(fù)，促進(jìn)不飽和脂肪酸的合成和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高細(xì)胞膜硬度、穩(wěn)定性和完整性[6]。

圖5 不同氮源游離氨基酸（a）和非游離氨基酸（b）含量分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of free amino acid (a) and non-free amino acid (b) contents of different nitrogen sources

由圖5亦可知，1#大豆蛋白胨、2#大豆蛋白胨游離氨基酸總量與YE相似，但其對(duì)巴氏醋酸桿菌SHQ-A的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸量較YE低，推測(cè)可能是游離氨基酸和非游離氨基酸組分的差異導(dǎo)致。YE與蛋白胨組成最大的區(qū)別在于前者含有較高濃度的丙氨酸和游離脯氨酸，后者則含有更多的精氨酸。其中，5#YE中的游離丙氨酸含量最高為5.38 g/100 g，1#大豆蛋白胨中的游離丙氨酸含量最低為0.12 g/100 g。4#YE中的游離脯氨酸含量最高為0.53 g/100 g，2#大豆蛋白胨中的游離脯氨酸含量最低為0.07 g/100 g。動(dòng)物蛋白胨中的游離精氨酸含量最高為2.98 g/100 g，2#YE中的游離精氨酸含量最低為0.76 g/100 g。1#大豆蛋白胨中含6.78 g/100 g的游離甘氨酸，是5#YE的40.65倍。因此，丙氨酸和脯氨酸很可能是促進(jìn)產(chǎn)酸代謝的關(guān)鍵積極氨基酸；而甘氨酸和精氨酸可能是抑制產(chǎn)酸代謝的關(guān)鍵消極氨基酸。研究報(bào)道，谷氨酰胺、丙氨酸和色氨酸在草莓醋發(fā)酵中呈顯著下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)樗鼈儽淮姿峒?xì)菌消耗，是醋酸細(xì)菌和酵母等微生物的良好氮來(lái)源。相反，精氨酸和脯氨酸，在發(fā)酵過(guò)程中顯著增加。精氨酸顯著增加的可能原因是該氨基酸在亞硝基條件下儲(chǔ)存在微生物液泡中，自溶解后留在培養(yǎng)基中[3]。

2.3.4 氨基酸缺失實(shí)驗(yàn)

為了闡明巴氏醋酸桿菌SHQ-A的具體營(yíng)養(yǎng)需求，根據(jù)上述推測(cè)結(jié)果和巴氏醋酸桿菌中心氨基酸代謝網(wǎng)絡(luò)[5]（圖6）找出10種關(guān)鍵氨基酸以作具體研究，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖6 巴氏醋酸桿菌SHQ-A的中心氨基酸代謝網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Central amino acid metabolic network of Acetobacter pasteurianus SHQ-A

圖7 缺少單一氨基酸時(shí)巴氏醋酸桿菌SHQ-A的產(chǎn)酸量Fig.7 Acid production of Acetobacter pasteurianus SHQ-A without single amino acid

由圖7可知，在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，空白組中總酸含量為48.0 g/L。當(dāng)缺少丙氨酸和精氨酸時(shí)總酸含量顯著降低，分別為18.0 g/L和19.2 g/L，比空白組低62.5%和60%。因此，可以確定丙氨酸和精氨酸是巴氏醋酸桿菌SHQ-A代謝產(chǎn)酸的關(guān)鍵積極氨基酸?？赡苁且?yàn)榘褪洗姿釛U菌SHQ-A的產(chǎn)酸只需要少量的精氨酸，所以蛋白胨中精氨酸高于YE中精氨酸的含量沒(méi)有產(chǎn)生實(shí)際作用。在氨基酸脫羧逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白反應(yīng)中，氨基酸被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)并被相關(guān)酶脫羧，然后脫羧基通過(guò)反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞中輸出，同時(shí)消耗一個(gè)質(zhì)子[27]。精氨酸去氨酸酶途徑，通過(guò)堿性物質(zhì)增加了細(xì)胞內(nèi)的pH，可能有助于修復(fù)由酸應(yīng)激引起的損傷或其他應(yīng)激引起的脫氧核糖核酸（DNA）的損傷[27-28]。因此，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)源中缺乏精氨酸便會(huì)直接導(dǎo)致產(chǎn)酸受到限制。有趣的是，當(dāng)發(fā)酵體系中缺乏脯氨酸時(shí)，不但不會(huì)抑制巴氏醋酸桿菌SHQ-A產(chǎn)酸代謝，產(chǎn)酸量反而比空白組高27.1%，推測(cè)脯氨酸可能是產(chǎn)酸代謝的關(guān)鍵消極氨基酸。但是在植物學(xué)研究中，脯氨酸可以穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞酸度，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜氧化還原電位[5]。

為了更好的表明空白組與實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)酸量的差異分布，分為I和II發(fā)酵階段。由圖7亦可知，在Ⅰ區(qū)內(nèi)，谷氨酸、賴(lài)氨酸、天冬氨酸和色氨酸缺失后產(chǎn)酸量相較于空白組低，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)（Ⅱ區(qū)）其限制影響消失。氨基酸主要在指數(shù)生長(zhǎng)階段被使用，因此Ⅰ區(qū)內(nèi)一些氨基酸缺乏導(dǎo)致了產(chǎn)酸代謝受到限制。但是考慮到氨基酸之間可以相互轉(zhuǎn)化，所以某些氨基酸的單一缺乏在發(fā)酵后期可能不足以導(dǎo)致產(chǎn)酸量降低。如在巴氏醋酸桿菌的中心氨基酸代謝中天冬氨酸可轉(zhuǎn)化為谷氨酸和丙氨酸，由此可以降低谷氨酸和丙氨酸缺失時(shí)產(chǎn)生的不良影響[5]。根據(jù)其他研究報(bào)道，在蘋(píng)果酒中加入谷氨酸或天冬氨酸可明顯促進(jìn)菌生長(zhǎng)，這可能是由于三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）周期的增強(qiáng)，但最終酸度較低。色氨酸有利于在發(fā)酵過(guò)程中穩(wěn)定乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）的活性，這可能會(huì)導(dǎo)致最終的酸度增加。根據(jù)京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)可知，色氨酸參與了泛素的合成，這是醋酸細(xì)菌中酒精呼吸鏈中唯一的一個(gè)自由電子轉(zhuǎn)運(yùn)體，色氨酸可能會(huì)加強(qiáng)酒精呼吸鏈中的電子轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增強(qiáng)腺嘌呤核苷三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP）的合成，促進(jìn)酒精酰化過(guò)程中乙酸的細(xì)胞應(yīng)激性[29]。但在本研究中，缺乏色氨酸時(shí)并未對(duì)巴氏醋酸桿菌SHQ-A產(chǎn)酸代謝產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論

本研究首先采用鈣透明圈法從大紅浙醋中分離篩選得到一株產(chǎn)酸菌株，編號(hào)為SHQ-A，經(jīng)形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定為巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）。該菌株利用10種氮源發(fā)酵的產(chǎn)酸量在8.8～34.5 g/L范圍內(nèi)，且以酵母抽提物為氮源的產(chǎn)酸量明顯高于蛋白胨。當(dāng)缺少纈氨酸、組氨酸、色氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酸時(shí)，產(chǎn)酸量與空白組無(wú)明顯差異。然而，當(dāng)缺少丙氨酸和精氨酸時(shí)，產(chǎn)酸量?jī)H為18.0 g/L和19.2 g/L，分別低于空白組62.5%和60%，表明丙氨酸和精氨酸是產(chǎn)酸代謝的關(guān)鍵積極氨基酸；當(dāng)缺少脯氨酸時(shí)，產(chǎn)酸量為61.2 g/L，高于空白組27.1%，表明脯氨酸是產(chǎn)酸代謝的關(guān)鍵消極氨基酸。