晉秀娟，孫麗麗，趙 鍇，ISLAM Md Ashraful ，盧 娟，王曙光，孫黛珍*

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801；2. 省部共建有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌），太原 030031）

葉綠素（chlorophyll，Chl）是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，其合成與降解在植株整個(gè)生育期內(nèi)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。據(jù)報(bào)道，全球每年約有1012kg葉綠素在植物體內(nèi)被降解［1］，其中水分虧缺［2］、溫度降低［3］、病蟲(chóng)害侵襲［4］等都會(huì)加速葉綠素降解。葉綠素降解是一個(gè)多種酶共同參與調(diào)節(jié)的代謝過(guò)程，主要包括葉綠素酶（chlorophyllase，CLH）、脫鎂葉綠素酶（pheophytin pheophorbide hydrolyase，PPH）、脫鎂螯合酶（stay-green，SGR）、脫鎂葉綠酸a氧化酶（pheide a oxidase，PAO）和葉綠素紅色降解物還原酶（red chlorophyll catabolite reductase，RCCR）等［5-6］。其中CLH是葉綠素降解過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，能將葉綠素水解成羧酸的脫植基葉綠素和植醇［7］。

不同植物的CLH在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演的角色有明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)，菜豆（Phaseolus vulgaris）中的CLH活性在新鮮葉片中最高，而在衰老的過(guò)程中其活性不斷下降［8］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中發(fā)現(xiàn)2個(gè)AtCLHs在幼葉中的基因表達(dá)和酶活均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成熟和衰老期的葉片［9］，且敲除這2個(gè)AtCLHs后并不會(huì)影響衰老過(guò)程中葉綠素的正常降解［10］，表明CLH主要在生長(zhǎng)發(fā)育前期起作用。然而也有大量的研究表明，CLH參與了衰老過(guò)程中的葉綠素降解。例如：在婁葉（Piper betle）衰老的過(guò)程中，葉片葉綠素含量降低，CLH活性升高，說(shuō)明婁葉的CLH參與了葉綠素降解［11］；在青花菜（Brassica oleracea）采后衰老的過(guò)程中，葉綠素降解速率增快的同時(shí)BoCLH2表達(dá)量快速升高，葉綠素降解速率減慢的同時(shí)BoCLH2的表達(dá)量也會(huì)變低，表明BoCLH2在儲(chǔ)藏過(guò)程中的葉綠素降解途徑中起重要作用［12］；張?zhí)m等［13］分析了不同時(shí)期草地早熟禾（Poa pratensis）葉片中CLH基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)衰老葉中PpCLH1的表達(dá)量是幼嫩葉片的27.80倍，表明CLH在衰老過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。此外，前人在柑橘（Citrus reticulataBlanco）［5］、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）［14］、銀杏（Ginkgo biloba）［15］和藜（Chenopodium album）［16］等植物中相繼分離到CLH基因，并對(duì)其進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)不同物種的CLH基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有不同的表達(dá)模式和功能。

小麥（Triticum aestivum）是世界上分布最為廣泛的禾本科作物之一，其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對(duì)于國(guó)家的糧食安全具有重要意義。小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的實(shí)現(xiàn)需要從源頭抓起，即提高光合作用能力，確?！霸础贝?、“流”暢、“庫(kù)”足。葉綠素是小麥進(jìn)行光合作用的主要色素，葉綠素降解的加快會(huì)使葉片發(fā)黃、灌漿時(shí)間縮短、籽粒不飽滿，最終導(dǎo)致小麥減產(chǎn)［17］。迄今為止，小麥CLH基因家族成員尚未被鑒定，而且CLH家族成員如何在小麥的葉綠素降解過(guò)程中發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。

鑒于此，本研究利用生物信息學(xué)分析方法明確小麥CLH基因家族成員，并對(duì)其進(jìn)行染色體定位、理化性質(zhì)、保守基序（motif）、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及啟動(dòng)子順式作用元件分析，然后根據(jù)CLH基因家族成員在不同組織和不同脅迫處理下的表達(dá)模式，初步鑒定TaCLHs在葉綠素降解過(guò)程中發(fā)揮的作用，為后續(xù)基因功能鑒定奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 自然衰老材料

試驗(yàn)所用的花后自然衰老的冬小麥品種為煙農(nóng)19，于2019年種植在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站基地（北緯37°25′，東經(jīng)112°25′），次年記錄開(kāi)花期。隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，分別取花后0、7、10、16、19、22、25和30 d的小麥植株旗葉用于時(shí)空表達(dá)模式分析。

1.1.2 脅迫處理材料

經(jīng)次氯酸鈉（2.6%）消毒的小麥種子在蒸餾水中浸泡12 h至露白后放置在光照培養(yǎng)箱內(nèi)水培，待小麥幼苗長(zhǎng)至兩葉一心期進(jìn)行非生物脅迫處理。

黑暗脅迫：分別置于光強(qiáng)為0 Lux的光照培養(yǎng)箱中處理0、6、12、24、48和72 h。

激素脅迫：分別置于添加了50 μmol/L脫落酸（abscisic acid，ABA）、50 μmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）的溶液中處理0、6、12、24、48和72 h。

取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小麥葉片迅速保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)表達(dá)驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)所需小麥全基因組序列、蛋白序列和GTF文件等均從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)（https://plants.ensembl.org/info/data/ftp/index.html）中下載。

1.2.1 小麥CLH基因家族成員的鑒定

從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）中下載CLH基因家族的隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）文件（PF07224），利用TBtools軟件［18］的Simple HMM Seach功能檢索小麥蛋白序列，將獲得的蛋白作為CLH基因家族的候選成員。然后，將候選成員上傳至Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行二次篩選，剔除掉不含有CLH結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，剩余蛋白即為小麥CLH基因家族的成員。

1.2.2 小麥CLH基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)中下載小麥、藜麥、谷子、玉米和擬南芥的蛋白質(zhì)序列，使用同1.2.1的方法確定各作物CLH基因家族成員。利用MEGA-X軟件中的鄰接法（neighbor-joining， NJ）對(duì)這五個(gè)物種的CLH家族基因的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

使用MEME網(wǎng)站（https://meme-suite.org/meme/index.html）對(duì)CLH基因家族的保守motif進(jìn)行分析。從小麥基因信息GTF文件中提取TaCLHs的基因結(jié)構(gòu)信息，并通過(guò)TBtools將motif和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。利用Expasy網(wǎng)站（https://web.expasy.org/protparam/）分析TaCLHs的分子量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定指數(shù)和疏水性等相關(guān)理化性質(zhì)。利用cropPAL網(wǎng)站（https://croppal.org/）對(duì)家族成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用SOPMA網(wǎng)站（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)CLH家族成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)TBtools軟件從小麥全基因組序列中快速提取小麥CLH基因家族成員啟動(dòng)子區(qū)域（上游2 kb）。利用PlantCARE網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析與生物和非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件。

1.2.4 小麥CLH基因家族的表達(dá)模式分析

為研究CLH家族成員在不同組織器官中的表達(dá)情況，將TaCLHs序列提交到ExpVIP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.wheat-expression.com/）中進(jìn)行組織特異性分析，主要對(duì)4個(gè)組織（根、葉/嫩枝、穗和種子）的3個(gè)時(shí)期（幼苗期、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期）進(jìn)行了分析。

1.2.5 植物總RNA提取與引物設(shè)計(jì)

利用Trizol法提取RNA。使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。根據(jù)小麥數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的序列設(shè)計(jì)部分TaCLHs的熒光定量引物（表1），引物由北京擎科生物技術(shù)公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列Tab. 1 qRT-PCR primer sequence

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用TaKaRa公司的熒光定量試劑盒檢測(cè)Ta-CLHs的表達(dá)模式。每個(gè)樣本均設(shè)置3個(gè)平行樣，內(nèi)參基因Actin和TaCLHs均做3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaCLHs的染色體定位

通過(guò)小麥全基因組水平掃描共鑒定到13個(gè)TaCLHs，根據(jù)它們?cè)谌旧w上的分布位置將13個(gè)成員分別命名為T(mén)aCLH1～TaCLH13。13個(gè)家族成員主要分布在9條染色體上（圖1），分別是3A、3B、3D、4B、5A、5D、6A、6B和6D染色體。其中在6B染色體上分布著3個(gè)基因，分別是TaCLH10、Ta-CLH11和TaCLH12；在5D和6A染色體上分別分布著2個(gè)基因，其余6條染色體上均只有1個(gè)家族基因。

圖1 TaCLHs基因在染色體上的分布Fig. 1 Chromosomal localization of TaCLHs gene

2.2 TaCLHs蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步研究CLH基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將小麥中的13個(gè)CLHs與藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）、谷子（Setaria italica）、擬南芥和玉米（Zea maysL.）中的CLH蛋白進(jìn)行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明（圖2），五個(gè)物種的CLH基因家族成員共分為四大組（Group Ⅰ～Ⅳ），Group Ⅰ中只有藜麥和谷子的部分CLHs成員，而小麥的13個(gè)CLHs全部分布在其他三組中，其中Group Ⅱ中包含6個(gè)成員，Group Ⅲ中包含4個(gè)成員，Group Ⅳ中包含3個(gè)成員。通過(guò)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，TaCLHs與單子葉植物玉米和谷子的親緣關(guān)系較近，而與雙子葉植物擬南芥和藜麥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 CLHs蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of CLHs proteins

2.3 TaCLHs的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

分析13個(gè)TaCLHs的理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)（表2）：Ta-CLHs編碼的氨基酸個(gè)數(shù)介于290（TaCLH11）～329（TaCLH12）之間；相對(duì)分子量在30 968.82（Ta-CLH11）～35 668.10（TaCLH12）Da之間；理論等電點(diǎn)介于4.83（TaCLH4）～7.15（TaCLH3）之間，大部分屬于弱酸性蛋白；總平均疏水指數(shù)均大于0，表明都是疏水性蛋白；除TaCLH4和TaCLH11的穩(wěn)定指數(shù)大于40表現(xiàn)出不穩(wěn)定外，其余11個(gè)成員的蛋白性質(zhì)均穩(wěn)定；此外，除了TaCLH12定位在質(zhì)體內(nèi)，其余12個(gè)TaCLHs均定位在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。

表2 TaCLHs 的理化性質(zhì)Tab. 2 Physicochemical parameters of TaCLHs

2.4 TaCLHs基因家族的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步查找小麥中CLH家族成員所包含的保守序列，使用MEME網(wǎng)站預(yù)測(cè)保守基序（motifs），結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3）：13個(gè)TaCLHs中最多出現(xiàn)了21個(gè)motifs，其中TaCLH1、TaCLH2和TaCLH3均含有13個(gè)相同的motifs；TaCLH8、TaCLH9、TaCLH10和TaCLH13同樣含有12個(gè)相同的motifs。此外，13個(gè)TaCLHs基因中均包含motif 8、1、6、3、4、2、9，這7個(gè)motifs出現(xiàn)頻率最高，為100%；而motif 20和21均只在一個(gè)基因中出現(xiàn)，頻率最低，為7.69%。對(duì)比motif序列發(fā)現(xiàn)，motif 3中含有一個(gè)以絲氨酸殘基為中心的“GHSRGG”的脂肪酶保守區(qū)域。

圖3 TaCLHs基因家族的保守基序與基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 3 Conserved motif and gene structures analysis of TaCLHs

分析TaCLHs的基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子和外顯子數(shù)量差異較小，主要分為三大類，其中只含有一個(gè)外顯子的基因是TaCLH4，占總數(shù)的7.69%；含有兩個(gè)外顯子的基因有9個(gè)，占總數(shù)的69.23%；含有三個(gè)外顯子的基因有3個(gè)，分別是TaCLH1、Ta-CLH2和TaCLH3，占總數(shù)的23.08%。

2.5 TaCLHs蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是連接一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的中心樞紐。使用網(wǎng)站對(duì)小麥CLH家族成員進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)（表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13個(gè)成員間的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組成類似，均包括α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲4種成分，且無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中占比較多，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則相對(duì)占比較少。其中，無(wú)規(guī)則卷曲占二級(jí)結(jié)構(gòu)總量的44.38% ~ 50.32%；α-螺旋占二級(jí)結(jié)構(gòu)總量的25.64% ~ 33.43%；延伸鏈占二級(jí)結(jié)構(gòu)總量的16.10% ~ 19.20%；β-轉(zhuǎn)角占二級(jí)結(jié)構(gòu)總量的4.02% ~ 8.28%。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋是構(gòu)成TaCLHs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件。

表3 TaCLHs 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Tab. 3 Predicted secondary structure of TaCLHs proteins

2.6 TaCLHs的啟動(dòng)子順式作用元件分析

對(duì)CLHs編碼區(qū)上游2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行順式作用調(diào)控元件分析（圖4和圖5），發(fā)現(xiàn)其含有豐富的順式作用元件，主要分為植物激素響應(yīng)元件、環(huán)境脅迫響應(yīng)元件和植物生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件三大類。植物激素響應(yīng)元件主要有脫落酸響應(yīng)元件［A-box和ABA responsive element（ABRE）］、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif和TGACGmotif）、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件［auxein responsive element（AuxRE）、AuxRR-core和TGA-element］、赤霉素響應(yīng)元件（F-box和P-box）、水楊酸響應(yīng)元件（salicylic acid response element，TCA）和乙烯響應(yīng)元件（ethylene responsive element，ERE），其中脫落酸和茉莉酸甲酯的響應(yīng)元件最多。環(huán)境脅迫響應(yīng)元件包括光響應(yīng)元件（Box 4、GATA-motif、G-box、GT1-motif、I-box、TCCC-motif等）、缺氧響應(yīng)元件（GC-motif）、厭氧響應(yīng)元件［antioxidant response element（ARE）和O2-site］、干旱響應(yīng)元件（MYB binding sites，MBS）、低溫響應(yīng)元件（low temperature respone，LTR）和其他相關(guān)逆境響應(yīng)元件［stress response element（STRE）和wound response element（WRE3）］等，光響應(yīng)元件所占比例最多。植物生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件主要包括CCGTCC motif分生組織表達(dá)元件。其中，13個(gè)TaCLHs基因的啟動(dòng)子區(qū)域均含有光響應(yīng)元件和脫落酸響應(yīng)元件。此外，除了TaCLH5和TaCLH12中沒(méi)有MeJA響應(yīng)元件外，其余11個(gè)基因均含有該調(diào)控元件。由于葉綠素是光合作用中捕獲光的主要成分，因此，光響應(yīng)元件在13個(gè)TaCLHs啟動(dòng)子中出現(xiàn)的次數(shù)最多。此外，ABA和MeJA響應(yīng)元件在13個(gè)家族成員中的數(shù)目?jī)H次于光響應(yīng)元件，因此，試驗(yàn)后期對(duì)它們進(jìn)行了激素脅迫處理。

圖4 TaCLHs啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件熱圖Fig. 4 Heatmap of cis-acting elements in the promoter region of TaCLHs

圖5 TaCLHs啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件分布Fig. 5 Distribution of cis-acting elements in promoter region of TaCLHs

2.7 TaCLHs的表達(dá)模式分析

2.7.1TaCLHs的組織表達(dá)模式分析

利用ExpVIP數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)TaCLHs在不同時(shí)期（幼苗期、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期）和不同部位（根、葉/嫩枝、穗和種子）的表達(dá)模式進(jìn)行分析。

TaCLHs基因在不同組織中的表達(dá)模式有明顯差異（圖6）。TaCLH4主要在種子和穗中表達(dá)，而其余12個(gè)TaCLHs主要在葉/嫩枝和穗中表達(dá)，說(shuō)明CLH基因家族成員均具有組織特異性，可能在植物葉片和穗部發(fā)育等方面起著重要作用。

圖6 TaCLHs基因在不同組織中的表達(dá)熱圖Fig. 6 Heatmap of TaCLHs gene expression in different tissues of wheat

相同基因在同一組織的不同發(fā)育階段表達(dá)量差異明顯。13個(gè)TaCLHs在生殖生長(zhǎng)階段的穗中表達(dá)量均要高于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段。TaCLH1、TaCLH2、TaCLH3、TaCLH5和TaCLH7在生殖生長(zhǎng)階段中的葉/嫩枝表達(dá)量要高于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和幼苗生長(zhǎng)階段。這些結(jié)果表明，同一基因在不同發(fā)育時(shí)期起著不同作用，可能受某些生長(zhǎng)發(fā)育的因素誘導(dǎo)。

2.7.2 脅迫處理下TaCLHs的表達(dá)模式分析

13個(gè)TaCLHs的組織表達(dá)模式數(shù)據(jù)顯示，Ta-CLH4、TaCLH7、TaCLH9、TaCLH10、TaCLH11和TaCLH12整體上均處于一個(gè)低水平表達(dá)，因此，本研究分析其余7個(gè)TaCLHs在自然衰老、黑暗、ABA和MeJA處理下的表達(dá)模式。

對(duì)自然衰老過(guò)程下的表達(dá)趨勢(shì)進(jìn)行分析（圖7a），發(fā)現(xiàn)TaCLHs在自然衰老過(guò)程中的表達(dá)量變化波動(dòng)較大，但是達(dá)到表達(dá)量最大值的時(shí)間點(diǎn)有差異。其中TaCLH1、TaCLH2、TaCLH13在花后10 d表達(dá)量最大；TaCLH3在花后22 d表達(dá)量最大；TaCLH5在花后25 d表達(dá)量最大；TaCLH6在花后7 d表達(dá)量最大；TaCLH8在花后16 d表達(dá)量最大。這表明TaCLHs在葉片衰老過(guò)程中錯(cuò)峰表達(dá)。

在黑暗處理過(guò)程中，TaCLHs表達(dá)量達(dá)到最大值的時(shí)間點(diǎn)有差異（圖7b）。其中TaCLH5、TaCLH6和TaCLH13在黑暗處理后的6 h達(dá)到表達(dá)量的最大值，分別為處理前的21.57、147.49和5.39倍；Ta-CLH1、TaCLH2和TaCLH3的表達(dá)量最大值出現(xiàn)在處理24 h時(shí)；TaCLH8則在處理72 h達(dá)到峰值。在ABA脅迫下的TaCLH5、TaCLH6、TaCLH8和Ta-CLH13在整個(gè)處理過(guò)程中低水平表達(dá)（圖7c）；Ta-CLH1、TaCLH2和TaCLH3的表達(dá)模式較為相近，均呈現(xiàn)出一個(gè)下降-上升-下降的過(guò)程，且峰值都出現(xiàn)在48 h。在MeJA處理過(guò)程中，TaCLHs的表達(dá)模式有明顯的差異（圖7d）。其中TaCLH2和TaCLH6在處理后的表達(dá)量都沒(méi)有超過(guò)處理前的表達(dá)量，處于一個(gè)低水平表達(dá)；TaCLH5和TaCLH8在整個(gè)處理過(guò)程中呈現(xiàn)出一個(gè)下降-上升-下降-上升的過(guò)程，但是表達(dá)量最大值出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)不一樣，TaCLH5最大值出現(xiàn)在12 h，TaCLH8出現(xiàn)在72 h。從結(jié)果看出，TaCLHs的表達(dá)受不同脅迫處理誘導(dǎo)，表明Ta-CLHs在非生物脅迫中發(fā)揮了一定的作用。

圖7 TaCLHs基因在不同脅迫下的表達(dá)熱圖Fig. 7 Heatmap of TaCLHs gene expression under different stresses

3 討論

植物在長(zhǎng)期的自然選擇過(guò)程中形成了一套復(fù)雜的脅迫應(yīng)答響應(yīng)機(jī)制來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化，也因此產(chǎn)生了一系列植物特有的基因家族，分析這些基因家族的特性有利于了解植物的生理機(jī)制［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥CLH基因家族包含13個(gè)成員，較擬南芥、玉米、谷子、藜麥物種多，可能是因?yàn)樾←準(zhǔn)钱愒戳扼w作物，在A、B、D三個(gè)基因組上存在同源基因［20］，或者是因?yàn)镃LH基因家族內(nèi)部發(fā)生了基因復(fù)制現(xiàn)象，如TaCLH6和TaCLH7在5D染色體上緊密排列呈串聯(lián)分布，這種串聯(lián)重復(fù)基因在功能上可能相似或存在協(xié)同作用［21］?；蚪?jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯生成蛋白質(zhì)來(lái)行使生物學(xué)功能，因此，了解蛋白質(zhì)在細(xì)胞中發(fā)揮作用的位置將有助于研究基因的功能［22］。本研究中除了TaCLH12的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)在質(zhì)體內(nèi)，其余12個(gè)CLHs均預(yù)測(cè)在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，表明TaCLHs在植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中主要集中在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，與擬南芥中的定位結(jié)果一致。同時(shí)每個(gè)基因共有的motif 3中都含有一個(gè)以絲氨酸殘基為中心的“GHSRGG”脂肪酶保守區(qū)域，與前人研究一致［14-15］。

不同發(fā)育時(shí)期以及不同組織部位的表達(dá)模式在一定程度上可以預(yù)測(cè)基因參與的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和分子功能［23］。CLHs在植物中表現(xiàn)出明顯的組織特異性，主要在葉片中高表達(dá)，而在根中幾乎不表達(dá)［13］。小麥CLH基因家族也具有相同的結(jié)果，但是TaCLHs除了在葉片中高表達(dá)外，也在生殖生長(zhǎng)階段的穗中有表達(dá)，推測(cè)TaCLHs可能主要在葉片生長(zhǎng)發(fā)育階段和穗發(fā)育后期發(fā)揮作用。

此前很多研究已經(jīng)證實(shí)，自然衰老、光和植物激素等都可以誘導(dǎo)CLHs表達(dá)，例如：CLH1表達(dá)量隨著草地早熟禾葉片不斷發(fā)育逐漸增加，且在黑暗處理中期呈現(xiàn)出一個(gè)驟增的過(guò)程，此外ABA也能誘導(dǎo)草地早熟禾葉片中CHL1基因的表達(dá)來(lái)加速葉綠素降解［13］；在擬南芥中過(guò)表達(dá)CLH1能提高幼苗對(duì)光的耐受性，從而起到光保護(hù)作用，并且MeJA能強(qiáng)烈誘導(dǎo)CLH1的表達(dá)，從而降低植物體內(nèi)葉綠素的含量［24］。順式作用元件預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，13個(gè)TaCLHs的啟動(dòng)子區(qū)含有大量與光響應(yīng)和植物激素響應(yīng)等密切相關(guān)的順式作用元件，且通過(guò)熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，TaCLHs均響應(yīng)不同脅迫處理。根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)，CLHs基因可能通過(guò)與植物激素和環(huán)境脅迫相關(guān)基因互相作用來(lái)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)脅迫環(huán)境的抵御能力。

CLH是葉綠素降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著不同的角色。目前研究表明，擬南芥的CLH在幼葉階段的葉綠素降解過(guò)程中發(fā)揮光保護(hù)功能［9］，草地早熟禾的CLH在衰老時(shí)期的葉綠素降解過(guò)程中發(fā)揮作用［11-13］。研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件可以通過(guò)結(jié)合上游轉(zhuǎn)錄因子來(lái)精確調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的起始和效率，而順式作用元件的種類和數(shù)目則可導(dǎo)致基因的表達(dá)量有差異［25］。分析CLH基因家族的啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件，發(fā)現(xiàn)其含有不同種類和數(shù)量的元件，因此，推測(cè)造成基因家族功能分化的原因可能是順式作用元件的差異性。本研究結(jié)果表明，小麥CLH家族成員在葉綠素降解過(guò)程中發(fā)揮的作用主要分為三類，第一類是幼苗階段受光誘導(dǎo)的基因，如TaCLH6在黑暗處理下誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量最大值可達(dá)到處理前的147.49倍，而在自然衰老過(guò)程中的表達(dá)量相對(duì)較低，最大值為衰老起始前的2.39倍，結(jié)合前人研究成果推測(cè)TaCLH6可能主要在幼苗階段受光的誘導(dǎo)表達(dá)［9］；第二類是在衰老階段參與葉綠素降解的基因，如TaCLH1、TaCLH2和TaCLH3在生殖生長(zhǎng)階段的表達(dá)量均要高于幼苗和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，且在自然衰老過(guò)程、黑暗處理和ABA脅迫下均被誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)模式大致相同，推測(cè)這3個(gè)基因可能主要在生長(zhǎng)發(fā)育后期發(fā)揮作用，與草地早熟禾中的CLH1基因的研究結(jié)果一致［13］，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因均含有3個(gè)外顯子，且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中被聚在單獨(dú)的一類中，基于此推測(cè)插入的內(nèi)含子可能在一定程度上加大了轉(zhuǎn)錄水平可變剪切的復(fù)雜性，導(dǎo)致TaCLH1、TaCLH2和TaCLH3的進(jìn)化和功能的分化［26］；第三類是在兩個(gè)發(fā)育時(shí)期均發(fā)揮作用的基因，如TaCLH5在苗期黑暗和MeJA處理下都被不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，且該基因在在幼苗、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段的表達(dá)量都很高，但是生殖生長(zhǎng)的表達(dá)量相對(duì)是最高的，基于此推測(cè)TaCLH5在幼苗和衰老時(shí)期均發(fā)揮作用。這些研究結(jié)果均表明，基因結(jié)構(gòu)和順式作用元件的多樣性可能導(dǎo)致TaCLHs在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中參與葉綠素降解的階段有差異。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析方法鑒定小麥CLH基因家族成員，初步分析了家族成員的基因結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)等方面，并發(fā)現(xiàn)TaCLHs在葉綠素降解過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用，這些結(jié)果為今后研究TaCLHs的基因功能提供了參考依據(jù)。