陳曉晨，白曼利，陳昭華*，杜希萍，2，3，4

（1. 集美大學海洋食品與生物工程學院，廈門 361021；2. 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，廈門361021；3. 廈門市食品與生物工程技術研究中心，廈門 361021；4. 廈門南方海洋研究中心海藻資源化利用與深加工重點實驗室，廈門 361021）

由于環(huán)境污染造成臭氧層破壞，地表紫外線強度大大增加，強烈的紫外輻射給人類造成了炎癥、光氧化損傷、癌癥等多種損傷［1］，起到主要作用的是長波長紫外線（Ultraviolet A，UVA）和中波長紫外線（Ultraviolet B，UVB）輻射。其中，UVA具有很強的穿透力，能夠達到皮膚真皮層，對真皮層的成纖維細胞造成氧化損傷［2］。有研究表明，具有共軛雙鍵結構的有機分子可以吸收短波紫外線，較長波長的紫外線則被具有線性重復結構或環(huán)狀結構的有機分子吸收［3］。

類胡蘿卜素是由植物和微生物合成的最常見的天然色素之一，也是重要的抗氧化劑，可以通過抵消自由基的作用來減少炎癥和防止氧化損傷［4］，具有抗炎［5］、抗粥樣動脈硬化［6］、抗糖尿?。?］、預防心血管疾?。?］等生物活性，被廣泛應用于食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)。如圖1～3所示，蝦青素（astaxanthin）、β-胡蘿卜素（β-carotene）和海膽酮（echinenoneon）均是酮式類胡蘿卜素，具有共軛雙鍵結構。其中，蝦青素與β-胡蘿卜素屬于胡蘿卜素類，天然存在于許多甲殼類動物、藻類和微生物中［9］，海膽酮則屬于葉黃素類，主要存在于海膽中［10］。蝦青素骨架中共軛雙鍵及α-羥基酮的存在使其具有更強的抗氧化性以及其他重要的生物活性［11］，被稱為“超級抗氧化劑”。

圖1 蝦青素的分子結構式Fig. 1 The molecular structure of astaxanthin

在我們實驗室之前的研究中，以法夫酵母（Phaffia rhodozyma）為原材料制備出蝦青素、β-胡蘿卜素、海膽酮［12］，但它們對紫外輻射導致的皮膚損傷是否具有保護作用還未知。本文擬通過單一類胡蘿卜素蝦青素、β-胡蘿卜素、海膽酮及三者按一定質量濃度組合作用于UVA氧化損傷的人皮膚成纖維（human skin fibroblasts，HSF）細胞，研究HSF細胞的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的變化，闡明類胡蘿卜素對UVA氧化損傷的保護作用，為應用類胡蘿卜素開發(fā)對UVA輻射氧化損傷具有保護作用的化妝品和保健品提供理論依據(jù)和支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

P. rhodozyma菌體由廈門匯盛生物有限公司提供；蝦青素、β-胡蘿卜素和海膽酮由本實驗室從P.rhodozyma菌體中制備［12］；甲基噻唑藍［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT］購于美國Sigma公司；高糖培養(yǎng)（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）基購于美國HyClone公司；胎牛血清購于以色列Biological Industries；100×抗生素（10 000 IU/mL氨芐青霉素和10 mg/mL硫酸鏈霉素）溶液購于Sigma-Aldrich中國上海公司；LDH活性檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒購于北京索萊寶（Solarbio）科學技術有限公司。

圖2 β-胡蘿卜素的分子結構式Fig. 2 The molecular structure of β-carotene

圖3 海膽酮的分子結構式Fig. 3 The molecular structure of echinenone

1.2 主要儀器與設備

UVA燈管（320～420 nm），Philips；臺灣先馳紫外線輻照計ST513，Krevor；AL104分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HERACELL Vois 160i型CO2培養(yǎng)箱，德國賽默飛世爾科技公司；TS-100倒置顯微鏡，日本尼康（Nikon）公司；BioTek Cytation-5酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HSF細胞的培養(yǎng)與傳代

將HSF細胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞達到80%～90%融合時，吸棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗2次，之后用0.25%胰酶消化2～3 min，吸棄消化液，加入DMEM培養(yǎng)基，制成細胞懸液，按1∶4傳代至培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 UVA輻照劑量對細胞的影響

6根平行的8 W紫外燈管為UVA光源，燈管距試驗臺7.5 cm，預熱10 min，將紫外輻照強度穩(wěn)定在13.5 mW/cm2，通過改變輻照時間改變UVA的輻照劑量。即UVA輻照劑量（J/cm2）= UVA輻照強度（W/cm2）× 輻照時間（s）［13］。

設置輻照時間分別為0、10、16、20、24、28 min，即輻照劑量分別為8.10、12.96、16.20、19.44、22.68 J/cm2。吸棄待輻照細胞的原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細胞，加少量PBS覆蓋細胞后進行輻照試驗。輻照結束后，吸棄PBS，加入DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，基于MTT法［14］測定細胞存活率，確定細胞半致死輻照劑量，每組設置4個平行試驗。

1.3.3 細胞形態(tài)分析

將HSF細胞以1.5×105個/mL接種于6孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合為80%～90%時用不同輻照劑量的UVA輻照細胞。輻照結束后，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用倒置顯微鏡（200×）觀察細胞形態(tài)。

1.3.4 單一類胡蘿卜素對HSF細胞的影響

將HSF細胞以1.5×105個/mL接種于96孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，當細胞融合為80%～90%時，加入不同質量濃度（0、0.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL）的樣品，繼續(xù)孵育2 h后，吸棄溶液，加入DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。應用MTT法測定細胞存活率。根據(jù)細胞存活率，選擇單一類胡蘿卜素的低質量濃度、中質量濃度和高質量濃度，進一步將低質量濃度、中質量濃度和高質量濃度進行不同組合，用于后續(xù)研究類胡蘿卜素對UVA誘導HSF細胞氧化損傷的保護作用。

1.3.5 不同胡蘿卜素組合對UVA誘導HSF細胞氧化損傷的保護作用

將HSF細胞以1.5×105個/mL接種于96孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，當細胞融合為80%～90%時，加入不同質量濃度組合的類胡蘿卜素樣品，繼續(xù)孵育2 h后，吸棄溶液，用PBS緩沖液洗2次，之后96孔板底部用少量PBS緩沖液覆蓋，用1.3.2中得到的細胞半致死輻照劑量輻照細胞，輻照結束后棄PBS，加入DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。應用MTT法測定細胞存活率?？瞻捉M不加樣品、無UVA輻照，對照組不加樣品、進行UVA輻照，試驗組為加樣品、進行UVA輻照，每組設置6個平行試驗。

1.3.6 類胡蘿卜素對UVA輻照HSF細胞中LDH活性和MDA含量的影響

將HSF細胞以3.0×105個/mL接種于6孔板中，2 mL/孔，當細胞融合為80%～90%時，加入樣品溶液，孵育2 h，吸棄溶液，用PBS緩沖液洗2次，之后加少量PBS覆蓋6孔板底部，用1.3.2中得到的細胞半致死輻照劑量輻照細胞，輻照結束后，吸棄PBS，加入DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)LDH活性檢測試劑盒和MDA含量檢測試劑盒的步驟分別測定LDH活性和MDA含量。空白組不加樣品、無UVA輻照，對照組不加樣品、進行UVA輻照，試驗組加樣品、進行UVA輻照，每組設置3個平行試驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Microsoft Excel 2013進行繪圖，用平均值±標準差表示試驗數(shù)值。

2 結果與分析

2.1 UVA輻照劑量對HSF細胞存活率的影響

如圖4所示，在輻照劑量范圍內，隨著UVA輻照劑量的增加，細胞存活率降低，表明輻照對HSF細胞的增殖具有抑制作用，并且呈劑量依賴性。當輻照劑量分別為12.96 J/cm2和16.20 J/cm2時，細胞存活率分別為56.05%和51.23%，兩者沒有顯著性差異（P＞0.05），因輻照劑量為16.20 J/cm2時細胞存活率更接近半致死率，故選擇16.20 J/cm2為后續(xù)試驗的輻照劑量。

圖4 UVA輻照劑量對HSF細胞存活率的影響Fig. 4 The effect of UVA irradiation dose on HSF cell survival rate

2.2 UVA輻照劑量對HSF細胞形態(tài)的影響

如圖5a所示，正常的HSF細胞多為長梭狀，細胞密集。當UVA輻照劑量為8.10 J/cm2，如圖5b所示，細胞開始皺縮變圓且密度減少，出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象。當輻照劑量進一步增加到16.20 J/cm2（圖5c）和24.30 J/cm2（圖5d）時，細胞密度進一步減少，且與正常細胞相比，細胞間隙增大更明顯。此觀察結果與張永祥等［15］研究中經(jīng)UVA輻照后的HSF細胞的形態(tài)一致，與MTT法測定HSF細胞活力的結果相對應，即隨著輻照劑量的增加，細胞的存活率逐漸減小。

圖5 UVA輻照劑量對HSF細胞形態(tài)的影響（200×）Fig. 5 The effects of UVA irradiation dose on morphology of HSF cell（200×）

2.3 單一類胡蘿卜素對HSF細胞的影響

圖6～8分別表示不同質量濃度的蝦青素、β-胡蘿卜素和海膽酮對HSF細胞存活率的影響。可以看出，蝦青素、β-胡蘿卜素和海膽酮單一地作用于HSF細胞時，細胞存活率的整體趨勢表現(xiàn)為先增加后減少。圖6中，當蝦青素的質量濃度為15.0 μg/mL時，HSF細胞的存活率達到最大且與對照組存在顯著性差異（P＜0.05），因此選15.0 μg/mL作為中質量濃度；蝦青素質量濃度為5.0 μg/mL時的細胞存活率較高，且與15.0 μg/mL的存活率有顯著性差異（P＜0.05），故選此質量濃度作為低質量濃度；此外蝦青素為20.0 μg/mL時的細胞存活率較高，因此選擇20.0 μg/mL為高質量濃度，從而得到蝦青素的低、中、高質量濃度。圖7和圖8中，選擇細胞存活率最大的質量濃度為中質量濃度，在其質量濃度前后分別選擇細胞存活率較大的濃度為低質量濃度和高質量濃度，從而得到β-胡蘿卜素的低質量濃度、中質量濃度和高質量濃度分別為0.5、5.0和10.0 μg/mL；海膽酮的低質量濃度、中質量濃度和高質量濃度分別是0.5、10.0和15.0 μg/mL。

圖6 蝦青素對HSF細胞存活率的影響Fig. 6 The effects of astaxanthin concentration on HSF cell survival rate

圖7 β-胡蘿卜素對HSF細胞存活率的影響Fig. 7 The effects of β-carotene concentration on HSF cell survival rate

圖8 海膽酮對HSF細胞存活率的影響Fig. 8 The effects of echinenone concentration on HSF cell survival rate

2.4 不同類胡蘿卜素組合對UVA誘導HSF細胞氧化損傷的保護作用

將2.3中所得的蝦青素、β-胡蘿卜素和海膽酮三種類胡蘿卜素的低質量濃度、中質量濃度和高質量濃度進行排列組合，作用于UVA輻照后的HSF細胞，研究不同類胡蘿卜素組合對UVA誘導HSF細胞氧化損傷的保護作用。結果如表1所示。

由表1可以看出，經(jīng)UVA輻照后對照組HSF細胞的存活率降低至（49.30±1.48）%，接近細胞半致死率，與空白組相比顯著下降（P＜0.05），表明UVA輻照對HSF細胞有較嚴重的氧化損傷作用。不同類胡蘿卜素組合作用于UVA損傷的HSF細胞后，其細胞存活率不同。當組合中的蝦青素、β-胡蘿卜素和海膽酮分別為20.0 μg/mL、0.5 μg/mL和0.5 μg/mL時，HSF細胞存活率達到最大為（59.07±3.04）%，顯著大于對照組（P＜0.05），表明該組合對輻照損傷的細胞具有最強的保護作用，故選擇此樣品質量濃度組合用于后續(xù)研究。當蝦青素、β-胡蘿卜素和海膽酮分別為20.0 μg/mL、5.0 μg/mL和10.0 μg/mL時，細胞存活率最小，為（40.00±2.00）%，顯著小于對照組（P＜0.05）。除該組合外，還有4組排列組合的細胞存活率低于對照組，表明對輻照損傷后的HSF細胞沒有保護作用，其余22組類胡蘿卜素組合均可顯著增加細胞存活率，表明對UVA誘導HSF細胞氧化損傷的具有較強的保護作用。

表1 不同類胡蘿卜素組合對HSF細胞存活率的影響Tab. 1 The effects of different carotenoids groups on HSF cell survival rate

此外，當蝦青素為5.0、15.0 μg/mL，β-胡蘿卜素為0.5、5.0 μg/mL時或蝦青素為15.0 μg/mL，β-胡蘿卜素為10.0 μg/mL時，不同類胡蘿卜素組合的細胞存活率基本隨海膽酮質量濃度的增加呈上升趨勢；當蝦青素為5.0 μg/mL，β-胡蘿卜素為10.0 μg/mL時，不同類胡蘿卜素組合的細胞存活率隨海膽酮質量濃度的增加呈下降的趨勢；當蝦青素為20.0 μg/mL，β-胡蘿卜素為0.5 μg/mL時，不同類胡蘿卜素組合的細胞存活率隨海膽酮質量濃度的增加而下降；當蝦青素為20.0 μg/mL，β-胡蘿卜素為5.0 μg/mL或10.0 μg/mL時，不同類胡蘿卜素組合的細胞存活率隨海膽酮質量濃度的增加均先降低后增加。

2.5 類胡蘿卜素對UVA輻照HSF細胞中LDH活性和MDA含量的影響

類胡蘿卜素對UVA輻照HSF細胞中LDH活性和MDA含量的影響如圖9和圖10所示。與空白組相比，經(jīng)UVA輻照的對照組的LDH活性、MDA含量均顯著增加（P＜0.05），分別為（0.142 0±0.016 7）U/104cell和（0.083 5±0.013 6）nmol/104cell，表明輻照誘導HSF細胞產生氧化損傷。與對照組相比，單一類胡蘿卜素蝦青素、β-胡蘿卜素、海膽酮和三者組合的類胡蘿卜素分別作用于UVA氧化損傷的HSF細胞，均可使LDH活性和MDA含量顯著降低（P＜0.05），說明類胡蘿卜素均可減輕UVA輻照對HSF細胞的氧化損傷，對HSF細胞具有一定的保護作用。

由圖9可知：在單一類胡蘿卜素試驗組中，當蝦青素、β-胡蘿卜素均為5.0 μg/mL時，其LDH活性分別為（0.042 3±0.004 9）U/104cell和（0.061 2±0.013 2）U/104cell，表明蝦青素對損傷細胞的保護作用強于β-胡蘿卜素；當蝦青素、海膽酮均為15.0 μg/mL時，其LDH活性分別為（0.039 8±0.004 5）U/104cell、（0.059 3±0.010 1）U/104cell，表明蝦青素對損傷細胞的保護作用強于海膽酮；當β-胡蘿卜素和海膽酮均為0.5、10.0 μg/mL時，β-胡蘿卜素的LDH活性均顯著高于海膽酮（P＜0.05），表明海膽酮對損傷細胞的保護作用強于β-胡蘿卜素。因此，蝦青素對UVA輻照引起HSF細胞氧化損傷具有最強的保護作用，β-胡蘿卜素對HSF細胞氧化損傷的保護作用最弱。β-胡蘿卜素和海膽酮均在中質量濃度時LDH活性最低，而不同質量濃度蝦青素作用后的LDH活性沒有顯著性差異（P＞0.05）。20.0 μg/mL蝦青素、0.5 μg/mL β-胡蘿卜素和0.5 μg/mL海膽酮組合作用后的LDH活性為（0.052 8±0.018 9）U/104cell（試驗組10），20.0 μg/mL蝦青素的LDH活性為（0.041 3±0.004 5）U/104cell，顯著低于組合組（P＜0.05），而0.5 μg/mL β-胡蘿卜素和海膽酮的LDH活性分別為（0.072 4±0.007 0）U/104cell、（0.058 9±0.005 9）U/104cell，顯著高于組合組（P＜0.05），表明20.0 μg/mL蝦青素對損傷細胞的保護作用高于組合組，而0.5 μg/mL β-胡蘿卜素和海膽酮對損傷細胞的保護作用均低于組合組。

圖9 不同樣品對HSF細胞中LDH活性的影響Fig. 9 The effects of different sample on LDH activity in HSF cells

由圖10可知：在單一類胡蘿卜素試驗組中，當蝦青素、β-胡蘿卜素均為5.0 μg/mL時，其MDA含量分別為（0.049 7±0.003 9）nmol/104cell、（0.047 4±0.003 2）nmol/104cell，兩者無顯著性差異（P＞0.05）；當蝦青素、海膽酮均為15.0 μg/mL時，其MDA含量分別為（0.039 3±0.002 9）nmol/104cell、（0.049 7±0.001 3）nmol/104cell，兩者無顯著性差異（P＞0.05）；當β-胡蘿卜素和海膽酮均為0.5 μg/mL和10.0 μg/mL時，雖然β-胡蘿卜素的MDA含量均高于海膽酮，但無顯著性差異（P＞0.05）。因此，蝦青素、β-胡蘿卜素和海膽酮三者對UVA輻照引起HSF細胞氧化損傷的MDA含量均沒有顯著性差異（P＞0.05）。此外，蝦青素、β-胡蘿卜素和海膽酮均在中質量濃度時MDA含量最低，但不同質量濃度類胡蘿卜素作用后的MDA含量沒有顯著性差異（P＞0.05）。20.0 μg/mL蝦青素、0.5 μg/mL β-胡蘿卜素和0.5 μg/mL海膽酮組合作用后的MDA含量為（0.045 5±0.001 3）nmol/104cell（試驗組10），20.0 μg/mL蝦青素作用后的MDA含量為（0.044 8±0.001 9）nmol/104cell，0.5 μg/mL β-胡蘿卜素和海膽酮作用后的MDA含量分別為（0.052 7±0.003 2）nmol/104cell、（0.051 3±0.004 8）nmol/104cell，均與組合組沒有顯著性差異（P＞0.05），但20.0 μg/mL蝦青素對損傷細胞的保護作用高于組合組，而0.5 μg/mL β-胡蘿卜素和海膽酮對損傷細胞的保護作用均低于組合組。

圖10 不同樣品對HSF細胞中MDA含量的影響Fig. 10 The effect of different sample on MDA content in HSF cells

綜上所述，各組分均可減少UVA輻射對細胞的毒性，對細胞損傷具有一定的保護作用。所有試驗組中，15.0 μg/mL蝦青素的LDH活性和MDA含量均最低，對UVA輻照引起HSF細胞氧化損傷的保護作用最強；10.0 μg/mL β-胡蘿卜素的LDH活性和MDA含量均最高，對UVA輻照引起HSF細胞氧化損傷的保護作用最弱。并且，相對于β-胡蘿卜素和海膽酮來說，三種類胡蘿卜素組合對細胞損傷的保護具有協(xié)調作用，但對于蝦青素來說，類胡蘿卜素組合組對細胞的保護作用小于其單獨作用，具有負協(xié)調作用。

3 討論

紫外線主要通過誘導皮膚產生氫氧根離子、過氧化氫、單線態(tài)氧和超氧陰離子等導致HSF細胞的氧化損傷［15］。類胡蘿卜素是由碳碳共軛鍵鏈組成的多烯堿，可以通過促進電子的自由移動并與未配對的電子組合，淬滅自由基和單線態(tài)活性氧，發(fā)揮抗氧化作用，達到保護和阻遏HSF細胞氧化性損傷的作用［16］。

LDH是人體能量代謝過程中重要的酶，可以通過檢測LDH活性判斷細胞的損傷程度。LDH活性越大，細胞破壞損傷的程度越大，通透性越大。MDA是氧自由基攻擊細胞后產生的脂過氧化物，具有一定的細胞毒性，能破壞細胞的結構和功能，MDA含量越高，表明體內脂質過氧化的程度越大［17］。本文將蝦青素、β-胡蘿卜素、海膽酮和三者以一定質量濃度組合后作用于經(jīng)UVA輻照氧化損傷的HSF細胞，通過測定LDH活性和MDA含量，研究類胡蘿卜素對UVA氧化損傷HSF細胞的保護作用。結果表明，單一類胡蘿卜素蝦青素、β-胡蘿卜素、海膽酮和三者組合的類胡蘿卜素均顯著降低UVA輻照的HSF細胞的LDH活性和MDA含量（P＜0.05），說明類胡蘿卜素可減輕UVA輻照對HSF細胞的氧化損傷，對HSF細胞具有保護作用，這與Lyons等［18］的研究結果一致。據(jù)文獻報道，具有抗氧化作用的蝦青素、β-胡蘿卜素、海膽酮主要通過直接清除自由基，阻止自由基反應對細胞膜的損傷，從而降低LDH活性和MDA含量［19-21］。蝦青素、β-胡蘿卜素、海膽酮按一定質量濃度組合后的LDH活性低于同等質量濃度的β-胡蘿卜素和海膽酮，說明不同類胡蘿卜素具有協(xié)同作用。已有研究表明，類胡蘿卜素蝦青素和β-胡蘿卜素具有協(xié)同抗氧化作用［21］；另外，蝦青素與維生素C對過氧化氫和UVB照射建立的氧化應激模型同樣具有協(xié)同抗氧化作用［22］。相同質量濃度下，蝦青素降低LDH活性優(yōu)于β-胡蘿卜素，表明蝦青素對細胞氧化損傷的保護效果較好，這可能是因為蝦青素的抗氧化能力高于β-胡蘿卜素［21］。此外，Komatsu等［23］報道，食用蝦青素可以抑制由UVA輻射引起的皮膚屏障功能受損和皺紋等光老化現(xiàn)象，而且所食用的蝦青素會在皮膚中積累，可預防UVA照射對表皮和真皮中聚絲蛋白代謝和脫屑的影響。

綜上可知，蝦青素、β-胡蘿卜素、海膽酮可減輕UVA對HSF細胞的氧化損傷。本文的研究結果為應用類胡蘿卜素開發(fā)對UVA輻射氧化損傷具有保護作用的化妝品和保健品提供了理論依據(jù)和支持。