崔清洋，王夢(mèng)斌，曹銀利，唐成和

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 兒科，河南 衛(wèi)輝 453100)

原發(fā)性免疫缺陷病(primary immunodeficiency diseases, PIDs)為一類(lèi)和遺傳緊密關(guān)聯(lián)的異質(zhì)性疾病， 患兒易患反復(fù)感染、腫瘤、過(guò)敏或自身免疫性疾病等。最新版的PIDs分類(lèi)已在2020年1月17日由國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)專(zhuān)家委員會(huì)發(fā)表，分為10大類(lèi)，包括430種PIDs。其中同時(shí)影響細(xì)胞和體液免疫缺陷的第2亞類(lèi)T-B-NK+SCID的原RAG1缺陷和RAG2 缺陷現(xiàn)在統(tǒng)稱(chēng)為RAG缺陷。

重癥聯(lián)合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency, SCID)是一類(lèi)細(xì)胞免疫的缺陷、同時(shí)累及體液免疫的PID，SCID發(fā)生率約為1/100 000活產(chǎn)新生兒[1]，而一項(xiàng)使用美國(guó)11個(gè)州的新生兒SCID篩查數(shù)據(jù)的研究發(fā)現(xiàn)，SCID發(fā)病率為1/58 000活產(chǎn)新生兒，包括典型SCID、泄漏型SCID和Omenn綜合征[2]。此疾病一般具有明確的致病機(jī)制及干預(yù)治療靶點(diǎn)，其遺傳方式為常染色體隱性遺傳，其中IL2RG基因變異所致 X 連鎖聯(lián)合免疫缺陷(X-linked severe combined immunodeficiency, SCID -XL)占 50%～60%(其中共用受體 γ 鏈基因缺陷是導(dǎo)致 SCID -XL最主要的形式，約占所有 SCID50%)，重組激活基因(recombinase activating gene，RAG)變異(包括RAG1和RAG2)所致的聯(lián)合免疫缺陷病占10%。SCID發(fā)病所涉及的基因有ADA、AK2、LIG4、NHEJ1、PRKDC、DCLRE1CRAG2、RAG1、CORO1A、LAT、CD247、CD3E、CD3D、PTPRC、IL7R、IL2RA、JAK3及IL2RG(其中IL2RG基因變異為X連鎖，其余為常染色體隱性遺傳)。

大部分SCID患兒出生時(shí)無(wú)明顯異常，但隨胎傳抗體的消耗，患兒很容易在出生的第3～6月齡發(fā)生嚴(yán)重的反復(fù)感染，包括遷延性腹瀉、口腔念珠菌感染、嚴(yán)重中耳炎、間質(zhì)性肺炎及條件致病微生物如肺孢子蟲(chóng)和巨細(xì)胞病毒等感染，絕大部分患兒伴有生長(zhǎng)發(fā)育遲緩[3]。若不及時(shí)糾正免疫缺陷，大部分患者在2歲以?xún)?nèi)因重癥感染而死亡[4]，為兒科醫(yī)生必須面對(duì)的臨床急癥。

SCID通常基于缺陷的淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分類(lèi)，可分為以下4類(lèi)：T-B+NK+、T-B+NK-、T-B-NK+、T-B-NK-等，其中85%～90%的SCID患兒伴有已知的分子缺陷[5-6]。與T-B-NK+免疫表型有關(guān)的基因有DCLRE1C，LIG4，NHEJ1，PRKDC，XRCC4，RAG1，RAG2等，而T-B-NK+SCID約占SCID所有病例的25%。

本文回顧性分析1例嬰兒SCID患兒的臨床資料及基因檢測(cè)結(jié)果，且RAG1基因的c.2428A>G雜合錯(cuò)義變異為國(guó)際首次報(bào)道及c.1229G>A雜合錯(cuò)義變異為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道，以期加強(qiáng)對(duì)本病的認(rèn)識(shí)。

1 臨床資料

女性患兒，1個(gè)月6天，因發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量不增半月余于2020年1月26日入院。半月余前發(fā)現(xiàn)患兒體質(zhì)量不增，進(jìn)乳可，大便4～5次/d，呈黃色糊狀。G1P1，胎齡42周時(shí)因“胎兒宮內(nèi)窘迫”剖宮產(chǎn)出生，出生體質(zhì)量3 500 g，出生時(shí)有重度窒息史，羊水Ⅲ度污染，但無(wú)產(chǎn)傷史。出生1小時(shí)后因呼吸困難轉(zhuǎn)入我院新生兒科，入院時(shí)血常規(guī)(2020-01-26)未見(jiàn)異常，見(jiàn)表1。予抗感染、營(yíng)養(yǎng)腦細(xì)胞、靜脈營(yíng)養(yǎng)及合理喂養(yǎng)等治療15天后好轉(zhuǎn)出院。父母體健，非近親結(jié)婚。入院體格檢查：體質(zhì)量3 500 g，一般情況尚可，發(fā)育不良，營(yíng)養(yǎng)不良，體型偏瘦，心肺腹未見(jiàn)異常，四肢肌張力增高，四肢肌力正常。專(zhuān)科檢查：語(yǔ)言及智能評(píng)估：會(huì)哭；仰臥位：頭可居于中線，追視追聽(tīng)欠佳，雙手不可居于中線位活動(dòng)，雙下肢屈曲，非對(duì)稱(chēng)型緊張性頸反射(ATNR)姿勢(shì)存在；俯臥位：被動(dòng)肘支撐，不可瞬間抬頭；坐位：全前傾坐位；立位：踏步反射存在，雙下肢可支撐體質(zhì)量；手抓位：拇指內(nèi)收；肌張力：四肢肌張力增高；關(guān)節(jié)活動(dòng)度：股角60度，腘窩角120度，足背屈角30度，圍巾征不過(guò)中線，跟耳征陰性。入院診斷：蛋白質(zhì)-能量營(yíng)養(yǎng)不良。輔助檢查：甲狀腺功能三項(xiàng)未見(jiàn)異常；血常規(guī)(2020-03-05)示粒細(xì)胞缺乏，見(jiàn)表1；大便常規(guī)潛血陽(yáng)性；入院第2天患兒出現(xiàn)發(fā)熱，超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)22.31 mg/L；胸片示支氣管肺炎；復(fù)查hs-CRP 43.05 mg/L，白細(xì)胞介素6(IL-6)48.67 pg/ml，降鈣素原(PCT)0.90 ng/ml，連續(xù)復(fù)查2次血常規(guī)(2020-03-06和2020-03-09)均提示粒細(xì)胞缺乏或減少，見(jiàn)表1。予康復(fù)、先后予頭孢替安及頭孢他啶抗感染及降溫對(duì)癥治療后患兒仍反復(fù)發(fā)熱，升級(jí)抗生素為美羅培南加強(qiáng)抗感染后發(fā)熱緩解，奶量可，但監(jiān)測(cè)體質(zhì)量有下降趨勢(shì)，復(fù)查hs-CRP仍無(wú)明顯下降，予丙種球蛋白(IVIG)增強(qiáng)機(jī)體免疫力，因不排除血液系統(tǒng)惡性疾病，進(jìn)一步檢查：自身抗體14項(xiàng)陰性，人微小病毒B19-DNA、EBV-DNA及人巨細(xì)胞病毒DNA均陰性。血培養(yǎng)及骨髓培養(yǎng)均陰性；網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)76.81×109/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比0.03；骨髓穿刺結(jié)果示：①骨髓有核細(xì)胞增生活躍，粒系占66%，紅系占22%，粒:紅=3.0；②粒系增生活躍，比值增高，部分細(xì)胞胞體脹大，漿內(nèi)顆粒增多增粗，中性分葉核粒細(xì)胞缺如；③紅系增生活躍，比值及形態(tài)可；④淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例增高；⑤血小板易見(jiàn)。乳酸2.9 mmo/L；血氨34.8 mmo/L；血串聯(lián)質(zhì)譜及尿有機(jī)酸分析未見(jiàn)異常；復(fù)查肝功能：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)365 U/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)302 U/L，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶150 U/L，總膽汁酸(TBA)17.16 μmol/L；淋巴細(xì)胞亞群示：淋巴細(xì)胞3.66%(40%～60%)，總T淋巴細(xì)胞(CD3+)56.07%(60%～84%)，CD3+CD8+19.53%(20%～35%)，CD3+CD4+36.26%(36%～55%)，CD3+CD4+CD8+0.31%(0～5%)，CD3+CD4+/CD3+CD8+1.86%(0.8%～2.6%)，CD19+B淋巴細(xì)胞41.48%(8%～28%)，CD3+CD56+T-NK細(xì)胞1.96%，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)430×106/L，總T淋巴細(xì)胞(CD3+)241×106/L，CD3+CD8+84×106/L，CD3+CD4+156×106/L，CD19+B淋巴細(xì)胞13×106/L ，CD3+CD56+T-NK細(xì)胞178×106/L，符合T-B-NK+免疫表型。排除白血病及再障和遺傳代謝病，予調(diào)整抗生素、保肝及粒細(xì)胞刺激因子升高粒細(xì)胞治療后患兒未再發(fā)熱，體質(zhì)量緩慢增加，白細(xì)胞升高(但容易再次下降)，住院期間患兒出現(xiàn)腹脹，腹部X線立臥位平片示腹部部分腸管擴(kuò)張并積氣；予生理鹽水回流灌腸腹脹減輕后鋇劑灌腸提示直腸痙攣狹窄，建議隔期復(fù)查除外先天性巨結(jié)腸。住院38天后患兒家屬要求出院轉(zhuǎn)上級(jí)醫(yī)院進(jìn)一步治療。出院診斷：①重度熱能營(yíng)養(yǎng)不良；②支氣管肺炎；③肝損傷；④不完全性腸梗阻；⑤重度貧血；⑥膿毒血癥；⑦中毒性腸麻痹；⑧先天性巨結(jié)腸？⑨直腸狹窄。

表1 血常規(guī)變化情況

因患兒多次血常規(guī)提示粒細(xì)胞減少甚至缺乏，考慮先天性中性粒細(xì)胞缺乏癥可能，在獲得家長(zhǎng)知情同意后，采集患兒及父母的外周血行基因檢測(cè)。RAG基因exon2引物為：正向引物序列 CCTGGAGAGTC CAG TG AAG TCC； TGCCAGGCTACC AC C ACTTT；反向引物序列 AGCCAG CAGG AACA AGGTCA； GAGAATGCCT CCC A GCTCAA。擴(kuò)增條件為：①預(yù)變性:95 ℃，10 min；②變性(35個(gè)循環(huán)):95 ℃，30 s；③退火(35個(gè)循環(huán)):60 ℃，30 s；④延伸(35個(gè)循環(huán)):72 ℃，45 s；⑤徹底延伸(35個(gè)循環(huán)):72 ℃，5 min。

測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)患兒RAG1基因第2外顯子分別為存在c.1229G>A(p.Arg410Gln)、c.2428A>G(p.Ile810Val)錯(cuò)義變異(母源性)和c.2005G>A(p.Glu669Lys)的錯(cuò)義變異(父源性)，見(jiàn)圖1～3。上述變異可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能受到影響，c.1229G>A及c.2005G>A變異的致病性已有文獻(xiàn)報(bào)道，但c.2428A>G變異的致病性未見(jiàn)報(bào)道(所參考數(shù)據(jù)庫(kù)： HGMD Pro、 PubMed及ClinVar)，且c.1229G>A雜合變異為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。上述的變異不屬于多態(tài)性變化，在人群中發(fā)生頻率極低(所參考數(shù)據(jù)庫(kù) 1000Genomes及dbSNP)。家系驗(yàn)證結(jié)果顯示，患兒c.1229 G>A和c.2428A>G來(lái)自母親，c.2005G>A來(lái)自父親，為復(fù)合雜合變異，符合常染色體隱性遺傳規(guī)律。

圖1 RAG基因c.1229G>A變異測(cè)序峰圖 a、b及c分別為患兒和父母，箭頭示突變位點(diǎn)

圖2 RAG基因c.2428A>G變異測(cè)序峰圖 a、b及c分別為患兒和父母，箭頭示突變位點(diǎn)

圖3 RAG基因c.2005G>A變異測(cè)序峰圖 a、b及c分別為患兒和父母，箭頭示突變位點(diǎn)

根據(jù)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行致病性分析：①RAG1基因 c.1229G>A變異的證據(jù)強(qiáng)度為“PS1+PM1+PM2+PM3+PP3”，判斷為致病性的變異；②RAG1基因c.2005G>A變異的證據(jù)強(qiáng)度為“PS1+PM2+PM3+PP3+PP5”，判斷為致病性的變異；③RAG1基因c.2428A>G變異的證據(jù)強(qiáng)度為“PM2+PM3+PP3”，判斷為臨床意義不明的變異，但亦未有無(wú)致病性的定論，需待日后進(jìn)一步行相關(guān)驗(yàn)證。

RAG1基因序列全長(zhǎng)為1 043個(gè)氨基酸，包括478個(gè)alpha-helix，121個(gè)extended strand，56個(gè)beta-turn，388個(gè)Random coil。各種二級(jí)結(jié)構(gòu)所占的百分比為alpha-helix占45.83%，extended strand占11.6%， beta turn占5.37%，random coil占37.2%。c.1229G>A(p.Arg410Gln)，導(dǎo)致第410號(hào)氨基酸由精氨酸變成了谷氨酰胺；c.2428A>G(p.Ile810Val)，導(dǎo)致第810號(hào)氨基酸由異亮氨酸變成了纈氨酸；c.2005 G>A(p.Glu669Lys)，導(dǎo)致第669號(hào)氨基酸由谷氨酸變成了賴(lài)氨酸。該3個(gè)變異均發(fā)生在RAG1蛋白家族結(jié)構(gòu)域中，RAG1蛋白家族是RAG1-RAG2 V(D)J復(fù)合酶復(fù)合物的兩個(gè)不同組分之一。RAG復(fù)合物由RAG1蛋白和RAG2蛋白組成，是一種多蛋白復(fù)合體，在V(D)J重組過(guò)程中介導(dǎo)DNA裂解，其中RAG1介導(dǎo)DNA-binding結(jié)合到保守重組信號(hào)序列(RSS)上，氨基酸的改變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能受到影響，見(jiàn)圖4～5。

圖4 c.1229G>A、c.2428A>G及c.2005 G>A變異位點(diǎn)(b)及變異前的位置(a)

圖5 c.1229G>A、c.2428A>G及c.2005 G>A變異位點(diǎn)(b、d及f)及變異前的位置(a、c及e)

結(jié)合患兒臨床表現(xiàn)及基因檢測(cè)分析診斷RAG1基因c.2005G>A、c.1229G>A及c.2428A>G所致的SCID基本明確，告知患兒家屬目前該病最有效的治療措施為造血干細(xì)胞移植，家屬考慮中，隨訪患兒一般情況暫時(shí)尚可。

2 討 論

RAG1基因定位于11p12，基因組全長(zhǎng)約11.73 kb，包含2個(gè)外顯子，外顯子長(zhǎng)度約6 564 bp，編碼1 043個(gè)氨基酸。目前RAG1基因變異類(lèi)型多為錯(cuò)義變異，其次為無(wú)義變異、堿基缺失和插入變異，尚無(wú)變異類(lèi)型與臨床類(lèi)型關(guān)系報(bào)道，但臨床上純合變異較復(fù)合雜合變異癥狀重，本例患兒RAG1基因3個(gè)變異位點(diǎn)均為錯(cuò)義變異，且予以升級(jí)抗生素及IVIG和粒細(xì)胞刺激因子治療后癥狀改善，支持文獻(xiàn)報(bào)道。RAG1基因氨基末端區(qū)域有核定位的信號(hào)，尤其是4個(gè)堿性區(qū)域BI、BIIa、BIIb及BIII，是核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SRPI的靶點(diǎn)。另外2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域C3HC4及C2H2參與RAG1蛋白二聚體的形成。RAG1蛋白的中心區(qū)域有2個(gè)顯著保守的功能域，1個(gè)氨基酸殘基區(qū)域，識(shí)別重組信號(hào)序列(RSSs)，將RAG1-RAG2的蛋白復(fù)合體錨定在RSSs區(qū)。另一個(gè)氨基酸的殘基區(qū)域是重組酶活性區(qū)域，與RAG2蛋白相互作用的功能域定位于其他氨基酸殘基區(qū)域，包括活性中心和羧基末端區(qū)域。

RAG為Ig及TCR基因片段重排所必需，RAG1基因變異造成其編碼的重組酶活性完全或部分喪失，V(D)J重組失衡，T及B淋巴細(xì)胞發(fā)育在早期為阻斷而致PID發(fā)病。RAG1蛋白核心的氨基酸區(qū)域是387-1008，其編碼產(chǎn)物Rag1蛋白所形成的復(fù)合物為最重要的重組酶之一。該基因完全變異造成功能喪失，阻斷V(D)J重組，致成熟的B及T細(xì)胞功能完全喪失。

V(D)J基因片段的重組為RAG1或RAG2所誘發(fā)，其核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。由非同源的末端連接蛋白對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，該過(guò)程 至少包括5個(gè)蛋白，即Artemis、LIG4、XRCC4、DNA-PKcs和Ku70/80[8]，這些分子的缺陷均可導(dǎo)致 T-B-NK+SCID發(fā)生。

如果不是新生兒篩查發(fā)現(xiàn)，T-B-NK+SCID患兒在生命的早期會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重到危及生命的感染、發(fā)育不良、T和B細(xì)胞數(shù)量和功能低下或缺失、NK細(xì)胞數(shù)量和功能正常。T-B-NK+SCID可由編碼抗原受體基因V(D)J重組蛋白的任何一個(gè)基因的常染色體隱性缺陷引起。重組過(guò)程隨機(jī)組合可變的、多樣性的和連接的基因片段，這些片段分別編碼TCR和免疫球蛋白基因。這些基因編碼的一些蛋白質(zhì)也參與了人體所有細(xì)胞的DNA修復(fù)。這些基因的缺陷與額外的免疫表型有關(guān)，包括生長(zhǎng)發(fā)育異常以及對(duì)電離輻射和化療的敏感性增高。

與V(D)J重組相關(guān)的T-B-NK+SCID主要有兩種類(lèi)型：有或無(wú)放療/化療敏感性的患者。其類(lèi)型取決于缺陷基因是否同時(shí)參與V(D)J重組和DNA修復(fù)或重組。RAG1或RAG2基因的嚴(yán)重變異可致無(wú)輻射敏感性的T-B-NK+SCID，因RAG1和RAG2基因只參與V(D)J重組，而不參與DNA修復(fù)；某些RAG基因變異導(dǎo)致部分蛋白表達(dá)和T、B細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)量受限但臨床表現(xiàn)較為明顯，稱(chēng)為Omenn綜合征。Omenn綜合征也為一種T-B-NK+SCID，盡管它是一種產(chǎn)生無(wú)功能T和B細(xì)胞的泄漏型SCID，因此可能表現(xiàn)為T(mén)+B+NK+SCID或輕度聯(lián)合免疫缺陷。B-NK+SCID另一類(lèi)型是輻射敏感性的SCID(RS-SCID)，其中包括阿薩巴斯卡SCID(SCID-A)，在講阿薩巴斯卡語(yǔ)的美洲土著人中發(fā)現(xiàn)。RS-SCID主要由DCLRE1C基因變異引起，但也可以在涉及基因PRKDC、LIG4、NHEJ1和NBS1變異中發(fā)現(xiàn)，所有這些都是NHEJDNA修復(fù)所必需的。

SCID臨床上可分為典型SCID，如果不太嚴(yán)重，則根據(jù)T細(xì)胞定性和定量缺陷的嚴(yán)重程度分為泄漏型SCID。新生兒篩查或家族史診斷為SCID的嬰兒在出生時(shí)和嬰兒早期表現(xiàn)正常。新生兒期未確診的SCID患者的典型癥狀是反復(fù)嚴(yán)重感染、慢性腹瀉和發(fā)育不良。在缺乏以人群為基礎(chǔ)的新生兒SCID篩查的情況下，通常直到嬰兒出現(xiàn)一種或多種嚴(yán)重感染才會(huì)做出診斷。大多數(shù)SCID患兒的胸片上沒(méi)有胸腺陰影，淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)通常很低。典型SCID定義為自體T細(xì)胞計(jì)數(shù)<300×106/L，體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(PHA)反應(yīng)<正常的10%，泄漏型SCID是指淋巴細(xì)胞減少(2歲以下的自體T細(xì)胞計(jì)數(shù)<1 000×106/L，2～4歲<800×106/L，或4歲以上<600×106/L)，PHA反應(yīng)<30%正常。該患兒自體T淋巴計(jì)數(shù)241×106/L，小于300×106/L，符合典型SCID定義，其在第1次住院時(shí)(即新生兒期)一般抗感染治療有效，白細(xì)胞明顯降低，考慮為一過(guò)性。第2次因發(fā)育不良住院，且在新生兒期之后出現(xiàn)不易控制的感染，支持上述文獻(xiàn)報(bào)道。但該患兒胸片可見(jiàn)胸腺影，與上述文獻(xiàn)略有不同。

對(duì)于SCID家庭及高危孕婦應(yīng)加強(qiáng)遺傳咨詢(xún)，更重要的是進(jìn)行必要的產(chǎn)前診斷，其一可早期采取措施減少SCID患兒的出生，其二也有利于醫(yī)護(hù)人員為有缺陷患兒出生后提供及時(shí)而有效的診治做好必要的準(zhǔn)備。

SCID的初始管理為預(yù)防感染，包括與潛在的疾病接觸者隔離、免疫球蛋白替代療法、開(kāi)始抗菌預(yù)防和避免使用活病毒疫苗。而大多數(shù)SCID最常見(jiàn)、最普遍及最有效的治療方法是來(lái)自匹配良好的健康異基因供體的造血細(xì)胞移植。這種治療有很好的整體生存率，重建T細(xì)胞免疫，在許多情況下，B細(xì)胞免疫及腺苷脫氨酶(ADA)缺乏可采用酶替代療法。如果沒(méi)有人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)相同的供體，基因治療在某些形式的SCID中是一種越來(lái)越有效和成功的替代方案。但遺憾的是，相當(dāng)一部分患兒因經(jīng)濟(jì)和配型困難等原因，往往在造血細(xì)胞移植前死亡。

盡管依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)和美國(guó)分子病理學(xué)會(huì)(AMP)“基因序列變異的解釋標(biāo)準(zhǔn)和指南”進(jìn)行致病性分析顯示尚無(wú)法明確c.2428A>G變異位點(diǎn)的致病性，但c.2428A>G不屬于多態(tài)性變化，在人群中發(fā)生的頻率極低(所參考的數(shù)據(jù)庫(kù) dbSNP及1000Genomes)，為進(jìn)一步明確RAG1基因c.2428A>G變異位點(diǎn)的致病性，需要進(jìn)一步大樣本回歸分析并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型驗(yàn)證。患兒有SCID典型的臨床表現(xiàn)，故綜合考慮基因結(jié)果及患者癥狀和家族史等信息，可確認(rèn)c.2005G>A及c.1229G>A變異位點(diǎn)為患兒的致病性變異，擴(kuò)充了SCID國(guó)際上的基因變異譜。