黎曉菊，庹呈杰，黃之鐠，張曉梅，趙 慶

云南中醫(yī)藥大學中藥學院，昆明 650500

抗生素的過度使用導致了越來越嚴重的病原微生物耐藥性問題。細菌的耐藥性一旦產(chǎn)生，不但可通過基因傳遞給子代，而且還可以通過細菌結(jié)合的方式將耐藥性傳遞給其他細菌[1]。有專家擔憂，耐藥性可能成為全球性災難，且沒有緩解的跡象[2]。開發(fā)新型的抗菌藥物是全世界所共同面臨的緊迫任務(wù)，從植物藥中尋找抗菌成分是抗菌藥物研發(fā)的一個重要方向。姜科植物是抗菌成分的重要來源之一，近十余年來，已從姜科植物中發(fā)現(xiàn)多個具有優(yōu)良抗菌活性的化學成分[3-6]。

生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)是傳統(tǒng)的食藥同源植物，為姜科姜屬植物[7]。生姜具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、促進消化、改善血液循環(huán)、健胃止痛等藥理作用[8-10]。姜辣素類是生姜中辣味成分，也是生姜中主要活性成分。姜辣素類成分因具有抗腫瘤[11-14]、抗菌[15-18]等生物活性而受到關(guān)注。[6]-姜酚和[6]-姜烯酚對外排型MRSA菌株SA1199B(NorA)、XU212(TetK)和RN4220(MSRA)具有良好的廣譜抗菌活性，并且對R-質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移具有較強抑制作用[15]。Lee等[18]研究發(fā)現(xiàn)[6]-姜酚、[8]-姜酚和[6]-姜烯酚能抑制白色念珠菌生物膜的形成，但與他們結(jié)構(gòu)相似的[10]-姜酚、[8]-姜烯酚和[10]-姜烯酚在濃度為100 μg/mL時未顯示抑制活性。雖然有學者推測姜辣素類成分的鏈長縮短可能導致抗菌活性降低[15]，但從Lee[18]的研究結(jié)果來看，姜酚與姜烯酚的碳鏈延長似乎導致抗白色念珠菌的活性降低。

本課題組發(fā)現(xiàn)生姜提取物對二十余種病原菌具有明顯的抗菌活性，且提取物經(jīng)光化學反應后抗菌活性明顯增強[19]。本課題組在研究生姜抗菌活性成分的過程中分離得到了6個姜辣素類成分，為了進一步探究該類成分的抗菌活性與脂肪鏈長度的關(guān)系，我們開展了這6個姜辣素類成分對15個病原菌株的抗菌活性研究，以期尋找其中的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 藥材與菌種

市售的云南羅平生姜經(jīng)云南中醫(yī)藥大學馬偉光教授鑒定。標本(標本編號：ZO-LP-202103)保存于云南中醫(yī)藥大學實用中藥學重點學科中藥水提工藝實驗室。生姜洗凈、切成薄片，晾干，粉碎后備用。

革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 29213)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、肺炎鏈球菌(StreptococcuspneumoniaeATCC 49619)、糞腸球菌(EnterococcusfaecalisATCC 29212)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)：1505、2024、1957、1591、28299、I-20。革蘭氏陰性菌：流感嗜血桿菌(HaemophilusinfluenzaeATCC 49247)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)、鮑曼不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiATCC 19606)、克雷伯氏菌(KlebsiellapneumoniaeATCC 13883)、銅綠假單胞菌(PseudomonasAeruginosaPAO1)。以上供試菌株均由課題組前期研究保存。

培養(yǎng)基：病原細菌培養(yǎng)基LB：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，水定容至1 L，pH7.2～7.6。

1.2 儀器與試劑

儀器：打粉機、研缽、超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；Precisa電子天平；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋(TOMY公司)；恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(AIRTECH公司)；培養(yǎng)基配料等常用試劑、耗材均購自雅云生物科技有限公司。核磁共振氫譜、碳譜由Bruker AM-500超導核磁共振儀測定。柱色譜硅膠(300～400目，青島海洋化工廠)。薄層色譜硅膠G板(青島海洋化工廠)，薄層顯色的常規(guī)方法為：5%硫酸-乙醇溶液在150 ℃下烘烤至顯色明顯。

有機溶劑：丙酮、乙酸乙酯、石油醚等均為分析純。

1.3 提取、分離及鑒定

取粉碎的生姜1.0 kg，按料液比1∶3加入甲醇∶丙酮(1∶1，V/V)浸泡7日，超聲2 h，過濾。殘渣再用甲醇∶丙酮(1∶1，V/V)超聲提取2次。合并提取液，濃縮得浸膏90 g。

取15 g浸膏以500 mL氯仿溶解，用600 mL 2.5%氫氧化鈉水溶液萃取。水層用氯仿萃取兩次(每次250 mL)。水層滴加10%鹽酸至中性，用700 mL乙酸乙酯萃??；水層再用200 mL乙酸乙酯萃取。合并乙酸乙酯萃取液，水洗至中性，減壓濃縮得酸性浸膏1.183 g。上述酸性浸膏以硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(10∶1、5∶1、2∶1、1∶2，V/V)梯度洗脫，得到8個餾分(Fr.1～8)。Fr.1經(jīng)ODS柱色譜分離，甲醇-水(25%→85%)梯度洗脫，得到化合物1(44.1 mg)、2(45.5 mg)、3(21.7 mg)。

取75 g浸膏以硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯(1∶0、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1，V/V)梯度洗脫，得到9個餾分(Fr.1～9)。Fr.7經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(3∶1、2∶1、1∶1，V/V)梯度洗脫，再經(jīng)ODS柱色譜分離，甲醇-水(25%→90%)梯度洗脫，得到化合物4(549.6 mg)、5(72.6 mg)、6(110.0 mg)。

采用1H NMR、13C NMR、DEPT及ESI(+)-MS波譜法，并參照文獻數(shù)據(jù)，對上述6個化合物進行鑒定。

1.4 生姜化合物抗菌活性測定

精密稱定化合物1(9.000 0 mg)，以相等的摩爾數(shù)精密稱定化合物2(9.862 4 mg)、3(10.725 4 mg)、4(9.061 1 mg)、5(9.924 0 mg)、6(10.787 0 mg)。分別加入600 μL甲醇溶解至摩爾濃度為0.051 3 mol/L。

病原菌接種至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 rpm黑暗培養(yǎng)12 h。用液體培養(yǎng)基將各菌液分別稀釋至1×106～1×107CFU/mL備用。采用抗菌紙片擴散法，對6個化合物進行抗菌活性測試。

將稀釋后的指示菌菌液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，分別取溶解完全的6個化合物10 μL溶液于直徑6 mm的圓形濾紙片上，直至濾紙片將提取液完全吸收后貼于接種好指示菌的固體培養(yǎng)基上，每個化合物做3組平行實驗。以10 μL甲醇做空白對照，以抗生素做陽性對照(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌以芐基青霉素為陽性對照，MRSA以萬古霉素為陽性對照，革蘭氏陰性菌以卡那霉素為陽性對照，每個濾紙片上的抗生素質(zhì)量為50 μg)。病原細菌于37 ℃培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)12 h后測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的鑒定

化合物1無色油狀;分子式C17H24O4；ESI-MS：m/z315 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.82(1H，m，H-5′)，6.68(2H，m，H-2′，6′)，5.51(1H，s，H-4)，3.86(3H，m，OCH3)，2.84(2H，m，H-1)，2.56(2H，t，J=8.1 Hz，H-2)，2.25(2H，t，J=7.8 Hz，H-6)，1.57(2H，m，H-7)，1.29(4H，m，H-8，9)，0.88(3H，m，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：194.4(C-5)，193.5(C-3)，146.4(C-3′)，143.9(C-4)，132.7(C-1′)，120.8(C-6′)，114.3(C-5′)，111.0(C-2′)，99.5(C-4)，55.9(OCH3)，40.6(C-2)，38.3(C-6)，31.4(C-8)，31.4(C-1)，25.5(C-7)，22.4(C-9)，14.0(C-10)。上述數(shù)據(jù)與文獻[20]報道已知化合物一致，鑒定為5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-decen-3-one(結(jié)構(gòu)見圖1)。

圖1 化合物1～6的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-6

化合物2無色油狀;分子式C19H28O4；ESI-MS：m/z343 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.82(1H，dd，J=8.1,4.9 Hz，H-5′)，6.68(2H，m，H-2′，6′)，5.50(1H，s，H-4)，3.86(3H，m，OCH3)，2.84(2H，m，H-1)，2.56(2H，t，J=8.3 Hz，H-2)，2.25(2H，t，J=7.6 Hz，H-6)，1.57(2H，m，H-7)，1.28(8H，m，H-8，9，10，11)，0.87(3H，m，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：194.4(C-5)，193.6(C-3)，146.4(C-3′)，143.9(C-4′)，132.7(C-1′)，120.8(C-6′)，114.3(C-5′)，111.0(C-2′)，99.5(C-4)，55.9(OCH3)，40.6(C-2)，38.3(C-6)，31.7(C-10)，31.6(C-1)，29.2(C-9)，29.0(C-8)，25.8(C-7)，22.7(C-11)，14.0(C-12)。上述數(shù)據(jù)與文獻[20]報道已知化合物一致，鑒定為5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-dodecen-3-one。

化合物3白色固體;分子式C21H32O4；ESI-MS：m/z371 [M+Na]；+1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.82(1H，dd，J=8.1,5.1 Hz，H-5′)，6.68(2H，m，H-2′，6′)，5.40(1H，d，J=14.2 Hz，H-4)，3.87(3H，d，J=5.2 Hz，OCH3)，2.84(2H，m，H-1)，2.56(2H，t，J=8.4 Hz，H-2)，2.25(2H，t，J=7.5 Hz，H-6)，1.57(2H，s，H-7)，1.26(12H，m，H-8，9，10，11，12，13)，0.87(3H，t，J=7.0 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：194.4(C-5)，193.6(C-3)，146.4(C-3′)，143.9(C-4′)，132.7(C-1′)，120.8(C-6′)，114.3(C-5′)，110.9(C-2′)，99.5(C-4)，55.9(OCH3)，40.6(C-2)，38.3(C-6)，31.9(C-12)，31.4(C-1)，29.5(C-11)，29.4(C-10)，29.3(C-9)，29.2(C-8)，25.8(C-7)，22.7(C-13)，14.2(C-14)。上述數(shù)據(jù)與文獻[20]報道已知化合物一致，鑒定為5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-tetradecane-3-one。

化合物4白色固體;分子式C17H26O4；ESI-MS：m/z317 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：6.81(1H，d，J=1.9 Hz，H-5′)，6.70(1H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′)，6.63(1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6′)，3.99(1H，m，H-5)，3.86(3H，s，OCH3)，2.75(4H，m，H-1，2)，2.51(2H，m，H-4)，1.22-1.40(8H，m，H-6，7，8，9)，0.87(3H，m，H-10)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：210.0(C-3)，148.1(C-3′)，145.6(C-4′)，133.6(C-1′)，121.4(C-6′)，115.6(C-5′)，112.6(C-2′)，68.3(C-5)，56.1(OCH3)，50.9(C-4)，45.9(C-2)，38.1(C-6)，32.5(C-1)，25.9(C-8)，23.3(C-9)，14.3(C-10)。上述數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的已知化合物一致，鑒定為[6]-姜酚。

化合物5無色油狀;分子式C19H30O4；ESI-MS：m/z345 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.82(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.66(2H，m，H-2′，6′)，4.02(1H，br s，H-5)，3.86(3H，s，OCH3)，2.83(2H，m，H-1)，2.73(2H，m，H-2，)2.48～2.55(2H，m，H-4)，1.33(12H，m，H-6，7，8，9，10，11)，0.87(3H，m，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：211.6(C-3)，146.4(C-3′)，143.9(C-4′)，132.7(C-1′)，120.7(C-6′)，114.4(C-5′)，110.9(C-2′)，67.7(C-5)，55.9(OCH3)，49.4(C-4)，45.5(C-2)，36.4(C-6)，31.8(C-1)，29.6(C-7)，29.3(C-8)，29.3(C-9)，25.5(C-10)，22.7(C-11)，14.1(C-12)。上述數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的已知化合物一致，鑒定為[8]-姜酚。

化合物6白色固體;分子式C21H34O4；ESI-MS：m/z373 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.82(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.66(2H，m，H-2′，6′)，4.02(1H，br s，H-5)，3.83(3H，s，OCH3)，2.83(2H，t，J=7.4 Hz，H-1)，2.73(2H，t，J=7.7 Hz，H-2，)2.48～2.55(2H，m，H-4)，1.33(16H，m，H-6，7，8，9，10，11，12，13)，0.87(3H，t，J=6.9 Hz，H-14)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：211.6(C-3)，146.4(C-3′)，143.9(C-4′)，132.7(C-1′)，120.7(C-6′)，114.4(C-5′)，110.9(C-2′)，67.6(C-5)，55.9(OCH3)，49.3(C-4)，45.5(C-2)，36.4(C-6)，31.9(C-1)，29.6(C-7)，29.6(C-8)，29.6(C-9)，29.3(C-10)，29.3(C-11)，25.5(C-12)，22.7(C-13)，14.1(C-14)。上述數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的已知化合物一致，鑒定為[10]-姜酚。

2.2 生姜化學成分的抗菌活性測定

采用紙片擴散法[22]，對化合物1～6進抗菌活性測試，共采用了15株病原菌，結(jié)果見表1。測試結(jié)果表明：與姜酚型化合物4、5、6相比，烯醇型化合物1、2、3對更多的革蘭氏陽性菌具有抑制活性。姜酚型化合物4和5對四種革蘭氏陰性菌具有抗菌活性，僅對銅綠假單胞菌無抗菌活性。烯醇型化合物只有化合物1對五種革蘭氏陰性菌都具有抗菌活性。就烯醇型化合物而言，化合物1對絕大多數(shù)菌株的抗菌活性大于化合物2和3。就姜酚型化合物而言，化合物4的抗菌活性大于化合物5，而化合物6對所有15種菌株均無抗菌活性。上述6個化合物的脂肪鏈長順序為：1<2<3；4<5<6。由此初步推測：脂肪鏈的長度增加，將導致抗菌活性降低。

表1 化合物1～6的抑菌圈直徑Table 1 Diameter of inhibition zone of compound 1-6

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3 討論與結(jié)論

我們從生姜中分離鑒定了6個姜辣素類成分，并對這6個化合物進行抗菌活性測試，在此基礎(chǔ)上對構(gòu)效關(guān)系進行初步探討?？偟膩碚f，與姜酚型化合物4、5、6相比，烯醇型化合物1、2、3對更多的革蘭氏陽性菌具有抑制活性；姜酚型化合物4和5對革蘭氏陰性菌的抗菌活性優(yōu)于烯醇型化合物。根據(jù)我們的抗菌測試數(shù)據(jù)，并結(jié)合Lee等[18]的研究結(jié)果來看，姜辣素類成分脂肪鏈的長度增加，可能導致抗菌活性降低。我們和Lee等[18]的抗菌活性測試都只是針對脂肪鏈長為5、7、9個碳原子的姜辣素類成分；至于碳原子數(shù)少于5個或多于9個的脂肪鏈，上述規(guī)律是否還適用，尚需要進一步探討。

姜辣素類成分是生姜中的一類重要的抗菌成分，從此類成分中挖掘有苗頭的抗菌活性成分或先導化合物是值得進一步探索的。本項研究可以為具有抗菌活性的姜辣素類成分研究與開發(fā)及其抗菌機制研究打下基礎(chǔ)。