郭冬云，萬(wàn) 娜,3*，吳 意，林瑞華，唐 欣，曹 嵐，伍振峰,2*，楊 明,2

1江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2江西中醫(yī)藥大學(xué) 創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 3江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院；4江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源與民族藥研究中心，南昌 330004

迷迭香(RosmarinusofficinalisL．)為唇形科迷迭香屬亞灌木，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，現(xiàn)在世界各地均有種植，含有豐富的芳香油成分[1]。迷迭香香氣濃郁，常用于烹飪香料、食品工業(yè)的天然防腐劑，以及觀(guān)賞和藥用植物[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在廣泛的草藥和香料中，迷迭香等具有較好的抗氧化活性[3]。

精油是植物新陳代謝過(guò)程中形成的次生產(chǎn)物，是一種具有高濃度芳香和揮發(fā)性的物質(zhì)，存在于植物體內(nèi)某些特殊器官，發(fā)揮各種生態(tài)功能[4,5]。由于精油具有多種生物活性，因而在食品工業(yè)、化妝品工業(yè)、植物療法、醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域的應(yīng)用不斷增長(zhǎng)[6]。雖然合成的抗氧化劑和防腐劑已在食品工業(yè)中等領(lǐng)域被廣泛使用，但其長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)人體健康造成一定危害。因此，近期許多研究都在尋找天然活性成分[7]。植物精油作為一種天然提取物，被提出作為合成抗氧化劑的潛在替代品。迷迭香精油是從其莖、葉、花等中經(jīng)提取所得的是一種無(wú)色或淡黃色液體，具有植物特有的氣味，主要含有α-蒎烯、1,8-桉葉素、莰烯、樟腦、龍腦、石竹烯等萜類(lèi)成分[8]。迷迭香精油具有抗氧化、抑菌及防腐等作用，在醫(yī)藥、食品工業(yè)和芳香療法等方面具有廣泛的使用價(jià)值[9-11]。本研究用水蒸氣蒸餾法提取江西產(chǎn)迷迭香葉精油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)對(duì)迷迭香精油成分進(jìn)行分析，并對(duì)精油的抗氧化、抑菌活性進(jìn)行研究，為綜合開(kāi)發(fā)利用迷迭香精油資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)新鮮葉植物材料于2020年6月采自江西迭香果農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)楊明教授鑒定為唇形科植物迷迭香RosmarinusofficinalisL.的新鮮葉。標(biāo)本(20200615)現(xiàn)存于江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)(上海源葉生物科技有限公司)；鐵粉、30%過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無(wú)水乙醇、無(wú)水硫酸鈉等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；硫酸慶大霉素(美倫生物科技有限公司)；刃天青(北京夢(mèng)怡美生物科技有限公司)。

菌種：金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、大腸桿菌(ATCC 25922)、枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)均購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

島津UV-2550紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(日本島津公司)；揮發(fā)油提取器(四川蜀牛玻璃儀器有限公司)；BT25S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；H2050R型大容量高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)有限公司)；HH-S恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng))；7890A/5975C型氣相-色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫科技有限公司)；LDZM-80KCS立式蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng))；SPX-150F型生化培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 迷迭香精油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取精油，準(zhǔn)確稱(chēng)取100 g迷迭香鮮葉，置于5 000 mL圓底燒瓶中，加入2 000 mL雙蒸水，振搖混合后，浸泡30 min，置于電熱套中加熱并保持微沸狀態(tài)，加熱回流提取2 h，靜置分層后讀取精油的體積并收集精油。100 g迷迭香樣品提取得到精油的得率為1.12%。所得精油，加入無(wú)水硫酸鈉干燥后置于棕色玻璃瓶中，于4 ℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GC-MS分析條件

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)迷迭香精油進(jìn)行定性定量分析。氣相色譜條件：HP-5MS石英毛細(xì)管(30 m×320 μm×1.8 μm)色譜柱；采用程序升溫：起始溫度45 ℃，保持4 min，后運(yùn)行70 ℃，再以4 ℃/min升溫至150 ℃，保持1 min，再以6 ℃/min升溫至250 ℃，于250 ℃保持4 min。載氣為高純氦氣，流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；分流比80∶1；溶劑延遲4 min；進(jìn)樣量為1.0 μL。

質(zhì)譜條件：四極桿溫度150 °C；電離源為標(biāo)準(zhǔn)EI源，離子源溫度230 °C；電子倍增管電壓2 447.06 V；質(zhì)量掃描范圍m/z為29～650。

采用峰面積歸一化法確定組分的相對(duì)含量；通過(guò)檢索NIST11化學(xué)工作站標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)，參閱有關(guān)文獻(xiàn)，鑒定組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.3 迷迭香精油抗氧化活性的測(cè)定

1.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考Liu等[12]的方法，并稍做修改。用無(wú)水乙醇配置1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。將精油樣品稀釋至不同濃度。取2 mL不同濃度的樣品與4 mL的DPPH溶液置于試管中，充分混勻，室溫暗處?kù)o置30 min后，在517 nm處測(cè)定不同濃度樣品溶液的吸光度(A1)，同時(shí)測(cè)定2 mL樣品溶液與4 mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度(A2)，以及4 mL DPPH溶液與2 mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度(A0)。實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，取平均值，DPPH自由基清除能力按公式(1)進(jìn)行計(jì)算。

DPPH自由基清除能力=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(1)

1.3.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定

羥基自由基清除能力的測(cè)定采用水楊酸法。取1 mL不同濃度的樣品，依次加入1 mL 10 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1 mL 10 mmol/L的FeSO4，最后加入1 mL 8.8 mmol/L的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃下水浴30 min，用蒸餾水調(diào)零，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(A1)。以蒸餾水代替樣品作為空白組測(cè)吸光度(A0)；以蒸餾水代替H2O2作為對(duì)照組測(cè)吸光度(A2)。實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，取平均值，羥基自由基清除能力按公式(2)進(jìn)行計(jì)算。

羥基自由基清除能力=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

1.3.3 還原能力的測(cè)定

還原能力的測(cè)定采用普魯士藍(lán)還原法。取1 mL不同濃度的樣品，加pH 6.6的磷酸緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻于50 ℃反應(yīng)20 min，冷卻至室溫后加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻后以4 000 rpm的速度離心10 min，取上清液2.5 mL 與蒸餾水2.5 mL、0.1% 三氯化鐵溶液0.5 mL混勻，靜置室溫下反應(yīng)10 min，于700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 迷迭香精油抑菌試驗(yàn)

1.4.1 菌種的活化和菌懸液配制

將菌粉用自帶的復(fù)溶培養(yǎng)基制備成混合液體，用接種環(huán)蘸取混合液體，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上劃線(xiàn)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待長(zhǎng)出菌落，進(jìn)行菌懸液制備。用接種環(huán)挑取單菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中在37 ℃培養(yǎng)24 h，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成1.5×108CFU/mL的菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 抑菌活性的測(cè)定

采用濾紙片法，通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑的大小來(lái)判斷迷迭香精油的抑菌效果。在超凈工作臺(tái)用移液槍吸取200 μL各種菌懸液，將其均勻地涂布于平板培養(yǎng)基表面，制成含菌平板。用無(wú)菌鑷子夾取6 mm的圓形濾紙片，用移液槍吸取10 μL精油滴加到濾紙片上，滴入的一面朝下貼于平板，三片一個(gè)板，正置20 min，以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，慶大霉素藥敏紙片(10 μg/片)作為陽(yáng)性對(duì)照。將所有平板倒置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈的直徑，實(shí)驗(yàn)平行3次取平均值。

1.4.3 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用微量稀釋法與刃天青顯色法[13]測(cè)定迷迭香精油的最低抑菌濃度(MIC)。在96孔無(wú)菌平板中，用2%吐溫-80的液體培養(yǎng)基將精油進(jìn)行連續(xù)雙倍稀釋后，加入100 μL菌懸液混勻，最后加入20 μL 0.01%的刃天青溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀(guān)察顯色結(jié)果，顏色從藍(lán)色變?yōu)榉凵搭A(yù)示細(xì)菌生長(zhǎng)。以保持藍(lán)色的最低濃度為MIC。第一行每孔加含2%吐溫-80的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯200 μL作為培養(yǎng)基對(duì)照；第二行每孔加2%吐溫-80的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯100 μL和菌懸液100 μL作為含菌陰性對(duì)照，每孔中菌數(shù)為5×104個(gè)；樣品行中每孔加入含2%吐溫-80的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯100 μL，分別往第三行到第五行的1號(hào)孔加入100 μL的精油肉湯溶液(320 μL/mL),第六行的1號(hào)孔加入100 μL的硫酸慶大霉素母液(1 mg/mL),依次對(duì)第三行到第六行的1～12孔進(jìn)行梯度稀釋后，在每孔中加入100 μL的菌懸液，在1～12孔的精油樣品最終濃度為160、80.0、40.0、20.0、10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078 0 μL/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 迷迭香精油的化學(xué)成分分析

按上述GC-MS條件對(duì)迷迭香精油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，得到迷迭香精油的總離子流色譜圖(見(jiàn)圖1)。

圖1 迷迭香精油的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from R.officinalis

經(jīng)GC-MS計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)檢索，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖經(jīng)NIST11質(zhì)譜庫(kù)檢索及人工輔助分析，鑒定確認(rèn)了40種化學(xué)成分，用面積歸一化法計(jì)算出其相對(duì)含量。由表1可見(jiàn)，已鑒定成分的相對(duì)含量占精油總量的99.46%。其中含量較高的為α-蒎烯(39.05%)和1,8-桉葉素(16.86%)，其次是莰烯(4.22%)、D-檸檬烯(3.87%)、龍腦(3.74%)、β-石竹烯(3.11%)、香葉醇(2.92%)、β-蒎烯(2.23%)、樟腦(2.16%)、乙酸龍腦酯(2.01%)、芳樟醇(1.81%)、γ-松油烯(1.74%)等，為迷迭香精油的主要成分,相對(duì)含量高于1%的成分占91.41%。根據(jù)ISO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)[14]，迷迭香精油可分為突尼斯/摩洛哥型(Tunisian and Moroccan type)和西班牙型(Spanish type)兩大類(lèi)，其中α-蒎烯的含量超過(guò)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最高含量，β-蒎烯、1,8-桉葉素、D-檸檬烯、龍腦的含量均符合西班牙型標(biāo)準(zhǔn)，樟腦含量低于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最低含量，因此從GC-MS分析結(jié)果，江西迷迭香精油屬于西班牙型。

表1 迷迭香精油化學(xué)成分Table 1 The chemical composition of the essential oil from R.officinalis

續(xù)表1(Continued Tab.1)

將江西迷迭香與國(guó)內(nèi)其他產(chǎn)地迷迭香精油的化學(xué)成分進(jìn)行比較[15-18]，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地迷迭香精油主要成分相對(duì)含量的比較Table 2 Comparision of chemical composition of the essential oil from different regions of R.officinalis

從表2可以看出，不同產(chǎn)地的迷迭香精油的相對(duì)含量存在較大差異，江西、河南、貴州、山東、廣西產(chǎn)地的迷迭香精油中均有α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、1,8-桉葉素、芳樟醇和樟腦等物質(zhì)。其中江西產(chǎn)迷迭香精油中的α-蒎烯和芳樟醇的相對(duì)含量高于國(guó)內(nèi)其他產(chǎn)地，1,8-桉葉素、β-蒎烯、乙酸龍腦酯和β-石竹烯的相對(duì)含量較高；河南產(chǎn)迷迭香精油中莰烯的相對(duì)含量最高，貴州產(chǎn)迷迭香精油中β-石竹烯含量最高，山東產(chǎn)迷迭香精油中1,8-桉葉素、樟腦、龍腦含量最高，廣西產(chǎn)迷迭香精油中β-蒎烯、乙酸龍腦酯含量最高。Verma等[19]采用GC-FID和GC-MS技術(shù)分析印度北部亞熱帶地區(qū)不同生長(zhǎng)階段的迷迭香精油，發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)階段其主要成分相同，均為樟腦(23.9%～33.2%)、桉葉油素(20.4%～23.9%)、α-蒎烯(8.5%～14.4%)，但其相對(duì)含量存在明顯差異。研究表明，精油成分受植物生長(zhǎng)地、土壤、提取方法、植物品種等諸多因素的影響[20]。

2.2 迷迭香精油抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果

2.2.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH自由基有個(gè)單電子，其乙醇溶液呈深紫色，在517 nm處有強(qiáng)吸收?？寡趸瘎┑拇嬖诳梢允沟肈PPH溶液的顏色從深紫色變?yōu)榈S色，從而具有清除DPPH自由基的能力[21]；褪色越明顯表明抗氧化能力越強(qiáng)。

如圖2所示，不同濃度的迷迭香精油對(duì)DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)明顯的量效應(yīng)關(guān)系，隨著樣品濃度的增大，對(duì)DPPH自由基的清除效果增強(qiáng)；迷迭香精油對(duì)DPPH自由基的IC50值為76.42 μL/mL，表明迷迭香精油對(duì)DPPH自由基有較好的清除活性。

圖2 迷迭香精油的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging rate of the essential oil from R.officinalis

2.2.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定

Fe2+和H2O2混合后反應(yīng)產(chǎn)生高活性的羥基自由基，然后由體系中的水楊酸-乙醇捕捉羥基自由基產(chǎn)生有色物質(zhì)且在510 nm處有吸收。如果在反應(yīng)體系中加入有清除羥自由基能力的物質(zhì)，與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)羥自由基，會(huì)使有色物質(zhì)生成量減少并降低吸光值。

如圖3，不同濃度的迷迭香精油對(duì)羥基自由基清除能力呈現(xiàn)較好的量效應(yīng)關(guān)系，隨著樣品濃度的增大，對(duì)羥基自由基的清除效果增強(qiáng)；迷迭香精油對(duì)羥基自由基的IC50值為51.40 μL/mL，表明對(duì)羥基自由基有較好的清除效果。

圖3 迷迭香精油的羥基自由基清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging rate of the essential oil from R.officinalis

2.2.3 還原能力的測(cè)定

多數(shù)情況下，多數(shù)非酶類(lèi)抗氧化劑的活性都是通過(guò)還原反應(yīng)終止氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的，化合物的還原能力是顯示其是否具有抗氧化潛能的一個(gè)至關(guān)重要的因素。吸光值越大，物質(zhì)的還原力越強(qiáng)，其抗氧化活性也越高。

如圖4，還原力與質(zhì)量濃度具有一定的量效關(guān)系，隨著樣品濃度的增大，還原力增強(qiáng)；迷迭香精油具有較強(qiáng)的還原力，IC50值為49.15 μL/mL。

圖4 迷迭香精油的還原力Fig.4 The reducing power of the essential oil from R.officinalis

2.3 迷迭香精油抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 抑菌活性的測(cè)定

采用濾紙片法測(cè)定了迷迭香精油的抑菌圈直徑，結(jié)果如表3所示，迷迭香精油對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有良好的抑制作用，其中對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為14.40±0.66 mm，抑制作用最強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為11.70±0.27 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為11.41±0.19 mm，抑菌作用稍弱。

表3 迷迭香精油抑菌圈直徑Table 3 The antimicrobial diameter of the essential oil from

2.3.2 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用微量稀釋法與刃天青顯色法測(cè)定了迷迭香揮發(fā)油的MIC，MIC值是測(cè)定抗菌物質(zhì)抗菌活性大小的一個(gè)指標(biāo)。結(jié)果如表4所示，迷迭香精油對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為2.50、10.00、10.00 μL/mL。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，迷迭香精油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最強(qiáng)，明顯優(yōu)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果。這一點(diǎn)與抑菌圈直徑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表4 迷迭香精油的最低抑菌濃度Table 4 MIC of the essential oil from R.officinalis

3 討論與結(jié)論

采用水蒸氣蒸餾法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜連用法(GC-MS)鑒定了迷迭香精油的化學(xué)成分，迷迭香精油中含量較高的成分為α-蒎烯(39.05%)和1,8-桉葉素(16.86%)，其次是莰烯(4.22%)、D-檸檬烯(3.87%)、龍腦(3.74%)、β-石竹烯(3.11%)、香葉醇(2.92%)、β-蒎烯(2.23%)、樟腦(2.16%)等，根據(jù)ISO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，江西迷迭香精油屬于西班牙型。迷迭香是西餐中經(jīng)常使用的香料，其特征是具有龍腦、龍腦酯、樟腦等成分的混合香氣[22]，同時(shí)具有清甜帶松木香的氣味和風(fēng)味，香味濃郁[23]。推測(cè)這可能與迷迭香中的4種主要成分α-蒎烯、1,8-桉葉素、龍腦、樟腦有關(guān)，這4種成分的相對(duì)含量占總成分含量的61.80%。其中樟腦具有濃郁的辛香，1,8-桉葉素與莰烯具有類(lèi)似樟腦香氣，龍腦味辛苦，微寒；有樟腦和松木香氣，α-蒎烯有松木、針葉及樹(shù)脂樣的氣息，因此迷迭香呈現(xiàn)出濃郁的松木香氣味。