常軍帥，張琪，程露露，屈勇剛，梁晏，李娜，張小玉，李彥芳

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832003；2.動物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實驗室，石河子 832003）

乳房炎在全球奶牛場中最為常見且治療成本也最高，臨床型乳房炎所導(dǎo)致的乳區(qū)疼痛嚴(yán)重?fù)p害了奶牛的衛(wèi)生福利[1,2]。乳房炎主要是由病原菌感染引起的，最常見的病原菌為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、化膿性鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和巴氏桿菌等[3,4]。其中金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是最常見的分離菌之一，也是造成乳制品行業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的主要病原體[5]。研究發(fā)現(xiàn)，致病性金黃色葡萄球菌通常含多種毒力基因、耐藥基因，這些基因的存在導(dǎo)致了乳房炎易發(fā)、頻發(fā)、久治不愈[6,7]。噬菌體是一種細(xì)菌病毒，根據(jù)其侵染宿主菌的生命周期不同，分為烈性噬菌體和溶原性噬菌體。烈性噬菌體只能通過裂解性循環(huán)方式進(jìn)行基因組的復(fù)制和子代噬菌體的釋放，在短時間內(nèi)就可導(dǎo)致宿主菌裂解；溫和噬菌體在紫外線、電離輻射等干擾因素的影響下則可以進(jìn)行溶原性循環(huán)，受影響后則開始裂解性循環(huán)。前噬菌體(prophage)為溶原性噬菌體整合入溶原菌體內(nèi)的基因，廣泛存在于細(xì)菌體內(nèi)，可通過轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式增強(qiáng)其宿主溶原菌的毒力基因與耐藥基因[8～10]。部分金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體可編碼腸毒素A、腸毒素P、表皮剝脫毒素A、潘頓-瓦倫丁殺白細(xì)胞毒素等毒力基因，使其宿主菌產(chǎn)毒[8,11]；金黃色葡萄球菌的耐藥性轉(zhuǎn)導(dǎo)較為常見，溶原性噬菌體φ11、φ80和φ80α可對攜帶mecA基因的I型SCCmec遺傳元件進(jìn)行包裝，從而導(dǎo)致mecA基因在金黃色葡萄球菌中廣泛傳播，噬菌體φ80α在促進(jìn)金黃色葡萄球菌流行株USA300獲得青霉素、四環(huán)素類耐藥基因中也起著積極作用[12,13]。溶原性噬菌體也可通過上調(diào)其寄主細(xì)菌的應(yīng)激相關(guān)基因、細(xì)胞壁合成等基因，來增強(qiáng)溶原菌對不同環(huán)境的抵抗力，提高了溶原菌在環(huán)境中的豐度，防止自身過快滅絕，從而達(dá)到互惠互利的關(guān)系[14]。

綜上所述，奶牛乳房中溶原性噬菌體的出現(xiàn)將可能導(dǎo)致乳房炎的發(fā)生，研究金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體對防治乳房炎具有重要意義。因此，對乳房炎奶樣中金黃色葡萄球菌使用不同方法誘導(dǎo)溶原性噬菌體產(chǎn)生，可為揭示該地區(qū)金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體存在情況提供參考，也可為進(jìn)一步研究臨床型乳房炎微生態(tài)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)的機(jī)制提供幫助。

1 材料

1.1 樣品

經(jīng)臨床檢查乳房是否紅、腫、熱、痛及乳汁顏色、質(zhì)地等檢測結(jié)果為臨床型乳房炎的45份奶牛乳樣。

1.2 菌株

本試驗所用的鏈球菌菌株（L2、L3）、大腸桿菌菌株（G5、G37）及金黃色葡萄球菌陽性對照菌株（PC2）均由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院傳染病實驗室分離鑒定。

1.3 儀器與試劑

全自動酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技公司；恒溫培養(yǎng)箱、恒溫震蕩培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；生物顯微鏡購自O(shè)lympus有限公司；細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基購自海博生物技術(shù)有限公司；甘露醇氯化鈉瓊脂購自杭州濱和微生物試劑有限公司；酶標(biāo)板購自杭州主諾生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液（快速法）購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；絲裂霉素C購自北京百奧萊博科技有限公司。

2 方法

2.1 菌株分離純化

無菌操作，用滅菌棉簽蘸取奶樣劃線于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，倒置放于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)顏色。挑取金黃色的單菌菌落，再次四區(qū)劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上。反復(fù)操作3次以上，直到單個菌落區(qū)上的每個菌落大小、形狀、顏色一致，按照革蘭氏染色方法完成染色后，油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)、純度及染色特征；通過接觸酶試驗檢測疑似金黃色葡萄球菌的菌株是否有氣泡產(chǎn)生。

2.2 金黃色葡萄球菌的PCR鑒定

參考細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒的說明書對接觸酶試驗有氣泡產(chǎn)生的疑似金黃色葡萄球菌的菌株進(jìn)行提取總DNA。參考文獻(xiàn)[15]，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成金黃色葡萄球菌的特異性基因nuc。引物序列為F：5′-AGGGATGGCTATCAGTAATGTTTC-3′；R：5′-CATCAGCATAAATATACGCTAAGCCAC-3′。PCR反應(yīng)體系的設(shè)計（20μL）：2×Taq PCR Master Mix10μL，菌液模板2μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 6μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，設(shè)置為30個循環(huán)；72℃延伸6min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取7μL進(jìn)行1%的瓊脂糖電泳，預(yù)期產(chǎn)物大小為464bp。

2.3 金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體的誘導(dǎo)

金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體的誘導(dǎo)方法參考文獻(xiàn)[16]，略有改動。將純化好的金黃色葡萄球菌活化，接種至含2mL的LB培養(yǎng)基的試管內(nèi)，在37℃恒溫振蕩器內(nèi)培養(yǎng)至OD600值約0.2后再加入8mL的的LB培養(yǎng)基。加入MMC（絲裂霉素C），終濃度為0.5μg/mL，在37℃環(huán)境下，220r/min培養(yǎng)12h，觀察試驗組與對照組（不加MMC，其他條件完全相同）試管菌液濃度。當(dāng)同一株菌的試驗組與對照組OD600值差值大于0.3時，初步判定該株金黃色葡萄球菌為溶原性菌株，取試驗組液體12 000r/min離心3min，上清液過濾膜，得到的液體為噬菌體原液。

2.4 金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體的裂解

使用點(diǎn)滴法來檢測金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體的裂解能力[17]。取無菌棉簽蘸取純化好的菌株后，均勻涂布于LB瓊脂平板上固定區(qū)域，稍微干燥后，在不同位置點(diǎn)滴不同的噬菌體原液，并做好標(biāo)記。置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h后，觀察裂解效果（是否出現(xiàn)空斑），做好記錄。找到宿主菌后，使用雙層瓊脂平板法純化噬菌體，觀察噬菌斑形態(tài)。

3 結(jié)果

3.1 菌株分離純化

從45份樣品中共分離出16株在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上為金黃色的菌落，分離率為35.56%(16/45)。疑似金黃色葡萄球菌的菌株在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上為邊緣光滑整齊、濕潤、凸起的金黃色圓形菌落（圖1A），與陽性對照菌PC2顏色、形態(tài)一致（圖1B）。經(jīng)純化后的疑似金黃色葡萄球菌的菌株經(jīng)革蘭氏染色后，油鏡下為紫色球形，呈不規(guī)則堆狀排列、典型的葡萄串狀（圖1C）。通過接觸酶試驗檢測鏡檢疑似金黃色葡萄球菌的菌株，有大量氣泡產(chǎn)生，與陽性對照菌株P(guān)C2一致，而陰性對照無氣泡出現(xiàn)（圖1D）。

圖1 金黃色葡萄球菌的分離鑒定

3.2 金黃色葡萄球菌的PCR鑒定

電泳結(jié)果顯示，PCR試驗中16株疑似金黃色葡萄球菌的菌株與預(yù)期大小及陽性對照菌株P(guān)C2一致，均為464bp（圖2）。

圖2 部分疑似金黃色葡萄球菌的RCR鑒定

3.3 溶原性噬菌體的誘導(dǎo)及裂解性試驗

經(jīng)過MMC誘導(dǎo)8h后，對試驗組及對照組OD600值進(jìn)行測量記錄，發(fā)現(xiàn)有7株菌的OD600值與對照組OD600值差值超過了0.3（表1、圖3A）。對分離出的溶原性噬菌體通過點(diǎn)滴法進(jìn)行裂解試驗，發(fā)現(xiàn)5株噬菌體可裂解金黃色葡萄球菌（表2），誘導(dǎo)率為31.25%，對金黃色葡萄球菌裂解率最高的為P65a，裂解率為58.82%（10/17），最低的為P27a，裂解率為11.76%（2/17），結(jié)果見表2、圖3B。使用雙層瓊脂平板法純化噬菌體，噬菌斑表現(xiàn)為中心透亮、邊緣模糊的圓形空斑（圖3C）。

表1 MMC誘導(dǎo)后OD600值對比結(jié)果

圖3 溶原性噬菌體的分離及裂解試驗

表2 溶原性噬菌體的裂解能力

4 討論

金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致奶?；技?、慢性乳房炎的最常見病原菌之一。本次試驗分離出了16株金黃色葡萄球菌,分離率為35.56%（16/45），明顯低于陳明杰等[18]得出的新疆某牧場臨床型乳房炎樣品中金黃色葡萄球菌70.00%（28/40）的分離率；但高于陳婷婷等[19]得出的甘肅部分地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌30.11%（28/93）的分離率，這可能是由于各地、各牧場環(huán)境衛(wèi)生及消毒、用藥等方面的不同造成的。本次試驗對奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體的誘導(dǎo)率為31.25%（5/16），Schicklmaier等[20]研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌含前噬菌體率為77.57%（83/107），與之相比誘導(dǎo)率較低，可能受菌株來源所影響。在7份誘導(dǎo)后的清亮液中，只發(fā)現(xiàn)了5株噬菌體，推測原因有兩種，一是在未發(fā)現(xiàn)噬菌體的2份誘導(dǎo)液中也可能存在2株溶原性噬菌體，但其裂解譜窄，在測試的16株金黃色葡萄球菌中未有其宿主菌株，才導(dǎo)致無空斑出現(xiàn)，后期可增加菌株的試驗數(shù)量；二是絲裂霉素C抑制了菌株生長，所以出現(xiàn)試驗組明顯低于對照組OD600值。針對這種情況，后期可嘗試不同誘導(dǎo)方法，如紫外誘導(dǎo)，也可通過基因測序工作，檢測誘導(dǎo)后清亮液體是否含噬菌體。溶原性噬菌體轉(zhuǎn)為烈性噬菌體后，對細(xì)菌具有了裂解能力，但溫和噬菌體中的“仲裁”系統(tǒng)在裂解性循環(huán)和溶原性循環(huán)兩者之間選擇了后者，溶原性噬菌體基因則轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入溶原菌基因內(nèi)，很大概率將增強(qiáng)溶原菌的毒力和耐藥，這將導(dǎo)致生產(chǎn)中乳房炎更易發(fā)生、更難治療。

隨著噬菌體對乳房炎治療效果的深入研究，溶原性噬菌體也受到了越來越多的關(guān)注。對溫和噬菌體的進(jìn)一步研究，對了解乳房炎的發(fā)生、發(fā)展過程更為全面，也為了解微生態(tài)系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。