曹 斌,姚林華,馮 昕

曹斌,湖州市第一人民醫(yī)院藥劑科 浙江省湖州市 313000

姚林華,湖州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省湖州市 313000

馮昕,湖州市第三人民醫(yī)院院感科 浙江省湖州市 313000

0 引言

胃癌是臨床消化科常見的惡性腫瘤,受飲食習(xí)慣、工作方式等影響,導(dǎo)致胃癌患者傾向年輕化趨勢發(fā)展,給人類社會帶來不利的影響.目前,關(guān)于胃癌治療方式以外科手術(shù),輔以結(jié)合放療、化療,胃癌患者的5年生存期限雖然得到延長,但是患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等問題未得到解決.最近研究表明,中國傳統(tǒng)醫(yī)藥用于治療癌癥的研究包括胃癌在內(nèi)的人類癌癥取得了進步.蒺藜是蒺藜科植物蒺藜屬植物,藥用價值較高,蒺藜皂苷是從蒺藜內(nèi)提取的主要活性成分,具有抗癌、治療心腦血管疾病、調(diào)節(jié)免疫、保護視神經(jīng)等藥理活性.最近的研究發(fā)現(xiàn),蒺藜皂苷通過降低細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增加活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(activated

cysteine-containing aspartate proteolytic enzyme 3,cleaved caspase 3)蛋白表達抑制胃癌細胞增殖和阻滯細胞周期,并誘導(dǎo)細胞的凋亡,但是胃癌細胞遷移、侵襲的研究機制尚不清楚.Wnt/β-catenin通路與多種人類癌癥發(fā)展密切相關(guān),能參與癌細胞生長分化、遷移和侵襲等過程影響癌癥進展.關(guān)于蒺藜皂苷與Wnt/β-catenin通路的調(diào)控作用在胃癌研究中尚不清楚,因此,本研究通過探討蒺藜皂苷對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的研究及其可能相關(guān)的Wnt/β-catenin信號通路.

1 材料和方法

1.1 材料 胃癌細胞HGC-27購于中國科學(xué)院上海細胞庫;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于美國HyClone公司;蒺藜皂苷購于上海同田生物技術(shù)股份有限公司;siRNA NC序列、siRNA Wnt3a序列由上海吉瑪公司設(shè)計合成;Lipofectamine 2000試劑盒購于上海研卉生物科技有限公司;MTT試劑盒購于碧云天生物;Transwell小室、Matrigel膠購于美國Corning;p21抗體、Ki67抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體、Wnt3a抗體、β-catenin抗體購于自美國Santa Cruz Biotechnology公司;二抗購于北京中杉金橋公司;BCA試劑盒購于上海吉至生化科技有限公司;電化學(xué)發(fā)光液購于北京索萊寶科技有限公司.

1.2 方法 將胃癌細胞HGC-27培養(yǎng)至含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi),并放置37 ℃、5% CO恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵育,觀察細胞生長情況,細胞融合率為85%時,加入胰酶消化培養(yǎng),每2 d換一次培養(yǎng)液.取對數(shù)期胃癌細胞HGC-27,用蒺藜皂苷濃度為0、20 mg/L、40 mg/L處理細胞,記為Control組、蒺藜皂苷 20 mg/L組、蒺藜皂苷40 mg/L組;將siRNA NC序列、siRNA Wnt3a序列轉(zhuǎn)染胃癌細胞HGC-27中,用40 mg/L蒺藜皂苷進行處理,記為蒺藜皂苷+siRNA NC組、蒺藜皂苷+siRNA Wnt3a組.

1.3 MTT檢測細胞活性 取各組胃癌細胞HGC-27,然后以2×10/孔接種至96孔板中,固定培養(yǎng)48 h、72 h后,每孔內(nèi)添加MTT溶液20 μL,培養(yǎng)4 h以每孔內(nèi)150 μL添加DMSO溶液,觀察結(jié)晶是否溶解,溶解后置于酶標(biāo)儀490 nm處檢測細胞吸光度值(Absorbance,A),細胞活性(%)=實驗組A值/對照組A值×100%.

1.4 傷口愈合實驗檢測細胞遷移 取培養(yǎng)48 h各組胃癌細胞HGC-27并接種在6孔板中,然后采用無菌槍頭垂直劃線,倒置顯微鏡下拍照,放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h并拍照,觀察傷口愈合情況,即為細胞遷移情況.

1.5 Transwell小室檢測細胞侵襲 實驗開始前將Matrigel膠解凍.取各組胃癌細胞HGC-27用不含血清的培養(yǎng)基重懸細胞,Transwell小室上室內(nèi)加入Matrigel膠50 μL,下室加入含有血清的培養(yǎng)基500 μL,放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出小室擦去未進行侵襲的細胞,采用甲醛、結(jié)晶紫固定及染色,顯微鏡下觀察視野明亮區(qū)域,并計數(shù).

1.6 Western blot檢測p21、Ki67、E-cadherin、Ncadherin、Vimentin、Wnt3a、β-catenin蛋白表達 取培養(yǎng)48 h各組胃癌細胞HGC-27,與蛋白裂解液在冰上裂解20 min,使用BCA法檢測蛋白濃度.將蛋白樣品加至SDSPAGE上樣孔中,80 V電泳30 min,110 V電泳2 h,轉(zhuǎn)膜,封閉培養(yǎng)2 h,將PVDF膜與一抗(稀釋濃度1:800)4 ℃過夜孵育,室溫下與二抗(稀釋濃度1:2000)孵育2 h,用電化學(xué)發(fā)光液顯色.采用Image J分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH作為內(nèi)參.

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù),計量結(jié)果以(mean±SD)表示,單因素方差分析用于多組間比較,檢驗用于兩組間比較.＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 蒺藜皂苷對胃癌細胞增殖的影響 與Control組比較,蒺藜皂苷 20 mg/L組、蒺藜皂苷40 mg/L組胃癌細胞活性在48 h、72 h明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),表1.

表1 蒺藜皂苷對胃癌細胞增殖的影響

2.2 蒺藜皂苷對胃癌細胞侵襲、遷移的影響 與Control組比較,蒺藜皂苷 20 mg/L組、蒺藜皂苷 40 mg/L組胃癌細胞遷移率、侵襲細胞數(shù)目明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),表2.

表2 蒺藜皂苷對胃癌細胞侵襲、遷移的影響

2.3 蒺藜皂苷對胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白表達的影響 與Control組比較,蒺藜皂苷20 mg/L組、蒺藜皂苷40 mg/L組胃癌細胞p21、E-cadherin蛋白表達明顯增加,Ki67、N-cadherin、Vimentin蛋白表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),圖1和表3.

圖1 Western blot檢測增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達.

表3 蒺藜皂苷對胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白表達的影響

2.4 蒺藜皂苷對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 與Control組比較,蒺藜皂苷 20 mg/L組、蒺藜皂苷 40 mg/L組、蒺藜皂苷40 mg/L+抑制劑組胃癌細胞Wnt3a、β-catenin蛋白表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),圖2和表4.

圖2 Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達.

表4 蒺藜皂苷對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

2.5 干擾Wnt3a對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 與蒺藜皂苷+siRNA NC組比較,蒺藜皂苷+siRNA Wnt3a組胃癌細胞Wnt3a、β-catenin蛋白表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),圖3和表5.

圖3 Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達.

表5 蒺藜皂苷對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

2.6 蒺藜皂苷通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與蒺藜皂苷+siRNA NC組相比,蒺藜皂苷+siRNA Wnt3a組胃癌細胞活性在48 h、72 h明顯降低,遷移率、侵襲細胞數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),表6.

表6 蒺藜皂苷通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.7 藜皂苷通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白表達的影響 與蒺藜皂苷+siRNA NC組相比,蒺藜皂苷+siRNA Wnt3a組胃癌細胞p21、E-cadherin蛋白表達明顯增加,Ki67、N-cadherin、Vimentin蛋白表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),圖4和表7.

圖4 Western blot檢測增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達.

表7 藜皂苷通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白表達的影響

3 討論

蒺藜作為蒺藜屬植物,種植廣泛,含有豐富的化學(xué)成分,包括黃酮類、皂苷類、生物堿類化合物、醌類等,其中皂苷類化合物較為豐富,國內(nèi)外研究表明蒺藜皂苷具有降血糖、抗癌、治療心血管疾病等藥理作用.陳志偉等研究結(jié)果顯示,蒺藜皂苷能抑制卵巢癌細胞增殖,阻滯細胞周期發(fā)展,并誘導(dǎo)細胞凋亡.肺癌研究中發(fā)現(xiàn),蒺藜皂苷通過降低Cyclin D1蛋白表達,增加p27、cleaved caspase 3蛋白表達,以起到抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用.之前的研究結(jié)果顯示,蒺藜皂苷能抑制胃癌細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡,但是胃癌細胞的遷移、侵襲作用機制尚不清楚.本研究通過不同濃度蒺藜皂苷處理胃癌細胞,觀察蒺藜皂苷對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用.研究結(jié)果顯示,蒺藜皂苷 20 mg/L組、蒺藜皂苷40 mg/L組能降低胃癌細胞增殖活性,減少細胞侵襲數(shù),抑制細胞遷移率.p21蛋白是近年發(fā)現(xiàn)的細胞周期蛋白抑制基因,Ki67是細胞增殖抗原,與細胞有絲分裂相關(guān),p21、Ki67與細胞增殖密不可分.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化主要是上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,是獲得癌細胞遷移、侵襲重要過程;E-cadherin、N-cadherin、Vimentin是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相關(guān)標(biāo)志物,與癌細胞轉(zhuǎn)移有關(guān).本研究結(jié)果顯示,蒺藜皂苷增加了胃癌細胞p21、E-cadherin蛋白表達,降低Ki67、N-cadherin、Vimentin蛋白表達,提示蒺藜皂苷能抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化.

Wnt/β-catenin信號通路在胃癌細胞生長、遷移侵襲等生物學(xué)過程有關(guān),也是EMT重要的調(diào)控途徑,Wnt轉(zhuǎn)錄因子激活時,與跨膜受體蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,β-catenin產(chǎn)生磷酸化,調(diào)節(jié)下游基因的表達.研究結(jié)果顯示,姜黃素抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲,并下調(diào)胃癌細胞中N-cadherin、snail1、Wnt3a、β-catenin,上調(diào)E-cadherin蛋白表達,說明其作用機制可能與Wnt3a/β-catenin/EMT通路有關(guān).趙鵬等研究結(jié)果顯示,RBMS3通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而抑制胃癌細胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化.本研究結(jié)果顯示,不同濃度蒺藜皂苷處理胃癌細胞后,Wnt3a、β-catenin蛋白表達下調(diào),提示蒺藜皂苷抑制胃癌增殖、遷移和侵襲可能與Wnt3a/β-catenin有關(guān).將siRNA Wnt3a轉(zhuǎn)染胃癌細胞后,使用蒺藜皂苷處理胃癌細胞內(nèi),結(jié)果顯示,Wnt3a、β-catenin蛋白表達,細胞活性、遷移率降低,侵襲細胞數(shù)目減少,p21、E-cadherin蛋白表達上調(diào),Ki67、N-cadherin、Vimentin蛋白表達下調(diào),提示蒺藜皂苷可能通過抑制Wnt3a/β-catenin信號通路影響胃癌細胞增殖、遷移侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化.

4 結(jié)論

綜上所述,蒺藜皂苷能抑制胃癌細胞增殖、遷移侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,其作用機制可能與抑制Wnt3a/β-catenin信號通路有關(guān).

蒺藜皂苷能抑制胃癌細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡,并阻滯胃癌細胞周期進展,而Wnt3a/β-catenin信號通路研究與胃癌密不可分,對胃癌細胞生長、轉(zhuǎn)移有抑制作用.

本研究主要探究蒺藜皂苷與Wnt3a/β-catenin信號通路調(diào)控作用對胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響,擬解決蒺藜皂苷對胃癌細胞遷移、侵襲的影響,及其相關(guān)的Wnt3a/β-catenin信號通路,為胃癌研究提供新的研究方向.

本研究主要探究蒺藜皂苷對胃癌有抑制作用,且可能與Wnt3a/β-catenin信號通路有關(guān),本研究證明了蒺藜皂苷可能通過Wnt3a/β-catenin信號通路抑制胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移,為胃癌研究提供合理的數(shù)據(jù)支撐.

以胃癌細胞HGC-27為體外研究對象,用濃度0、20 mg/L、40 mg/L蒺藜皂苷進行處理,記為對照組(Control)、蒺藜皂苷 20 mg/L組、蒺藜皂苷40 mg/L組;將siRNA NC、siRNA Wnt3a轉(zhuǎn)染胃癌細胞中,用40 mg/L蒺藜皂苷處理.MTT檢測細胞增殖活性;傷口愈合、Transwell小室實驗檢測細胞遷移與侵襲能力;Western blot檢測p21、Ki67、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Wnt3a、β-catenin蛋白表達.

蒺藜皂苷呈濃度依賴性降低胃癌細胞活性、遷移率、侵襲細胞數(shù),增加p21、E-cadherin蛋白表達,降低Ki67、N-cadherin、Vimentin、Wnt3a、β-catenin蛋白表達.與蒺藜皂苷+siRNA NC組組相比,蒺藜皂苷+siRNA Wnt3a組胃癌細胞活性、遷移率、侵襲細胞數(shù)顯著降低,Wnt3a、β-catenin、Ki67、N-cadherin、Vimentin蛋白表達降低,p21、E-cadherin蛋白表達增加.

蒺藜皂苷抑制胃癌細胞增殖、遷移侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,并與抑制Wnt3a/β-catenin信號通路有關(guān).

本研究發(fā)現(xiàn),蒺藜皂苷與Wnt3a/β-catenin信號通路調(diào)控作用對胃癌細胞生長、轉(zhuǎn)移有抑制作用,為胃癌的臨床治療可能提供了幫助.但是本研究只注重體外實驗研究,關(guān)于體內(nèi)動物實驗需要進一步開展實驗證明.