黃穎，史耀琪，胡佳明，倪新雨，朱華

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325015

宮頸癌為全世界女性中第四大常見癌癥，嚴(yán)重危害著當(dāng)代女性的健康[1]。宮頸癌的主要致病因素是高危型乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus,HR-HPV）的感染[2]。雖然商業(yè)化應(yīng)用的HPV疫苗可以預(yù)防宮頸癌，但是已感染HPV的患者數(shù)量眾多，而不發(fā)達(dá)國(guó)家HPV疫苗接種率偏低，因此宮頸癌的發(fā)病率仍然高居不下。臨床上對(duì)宮頸癌的治療主要依賴手術(shù)、放療、化療等方法，不良反應(yīng)較強(qiáng)。

中藥以其天然、不良反應(yīng)小的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)被越來越多地應(yīng)用到抗腫瘤領(lǐng)域中，部分中藥已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)[3]。姜黃素是從姜科植物的根莖中提取的酚類色素，呈橙黃色結(jié)晶粉末狀，氣香特異，味微苦、辛，在傳統(tǒng)中醫(yī)中有很大的藥用價(jià)值，主治胸脅刺痛，胸痹心痛，痛經(jīng)經(jīng)閉，癥瘕，風(fēng)濕肩臂疼痛，跌撲腫痛等疾病。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)了姜黃素的抗腫瘤作用，包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯腫瘤細(xì)胞周期、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等[4-6]。

本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素對(duì)HPV陽性宮頸癌細(xì)胞具有殺傷作用，并且姜黃素可以上調(diào)HPV陽性宮頸癌細(xì)胞中LncRNA MEG3的表達(dá)水平。研究表明，LncRNA MEG3能夠抑制多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[7-10]，而且LncRNA MEG3能夠抑制miR-21的表達(dá)[7，11]。本研究旨在探討姜黃素殺傷HPV陽性宮頸癌細(xì)胞與LncRNA MEG3的上調(diào)表達(dá)的相關(guān)性以及具體的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株、載體與主要試劑：HPV16陽性宮頸癌SiHa細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；姜黃素（純度＞98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；Lipofectamine 2000、TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；LncRNA MEG3 siRNA委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒及引物的設(shè)計(jì)和合成委托大連TaKaRa公司完成；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒、Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PTEN單克隆抗體和活化的caspase3 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；其他常用試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 主要儀器：Real time PCR分析儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Backman公司；電泳儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及姜黃素處理：SiHa細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測(cè)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞接種于96孔板上，5×103個(gè)/孔。接種24 h后，以50 μmol/L[12]姜黃素處理細(xì)胞24、36、48、72 h后，用CCK-8法檢測(cè)姜黃素對(duì)SiHa細(xì)胞活性的影響，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于37 ℃繼續(xù)孵育2 h，再用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度。以二甲基亞砜（DMSO）處理相同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞接種于6孔板，2×103個(gè)/孔。接種24 h后，更換含有終濃度為50 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h，然后將細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化并收集，冷的PBS洗滌2遍后，用Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒染色30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式檢測(cè)的結(jié)果用FlowJo10.6.2軟件進(jìn)行分析。以DMSO處理相同時(shí)間的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.4 SiRNA干擾LncRNA MEG3基因的表達(dá)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞接種于6孔板，1×106/孔。接種24 h后，利用Lipofectamine 2000按照標(biāo)準(zhǔn)步驟將LncRNA MEG3轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染NC siRNA的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞接種于6孔板，1×106/孔。接種24 h后，更換含有終濃度為50 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、36、48、72 h后，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，每樣品取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用cDNA作為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，采用GAPDH作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。LncRNA MEG3基因的上游引物序列為：5’-GCTATGCTCATACTTTGACT C-3’；下游引物序列為5’-CATCATAAGGGTGATGACAG-3’。miR-21上游引物序列為：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTAA ACATCCTACACTCT-3’；下游引物序列為5’-CTCAACTGG TGTCGTGGA-3’。以DMSO處理相同時(shí)間的細(xì)胞樣品作為對(duì)照組。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞接種于6孔板，1×106個(gè)/孔。接種24 h后，更換含有終濃度為50 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，裂解細(xì)胞提取總蛋白，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，將PVDF膜用5%的脫脂牛奶于4 ℃封閉過夜，一抗于37 ℃ 孵育1.5 h后，TBST洗滌5次后，HRP標(biāo)記的二抗于37 ℃繼續(xù)孵育1 h。TBST洗滌5次后，用ECL發(fā)光試劑曝光膜上的條帶。以DMSO處理相同時(shí)間的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素顯著促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比，隨著姜黃素處理時(shí)間增加，SiHa細(xì)胞的活力逐漸下降，并且從36 h開始，姜黃素組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），隨著處理時(shí)間 延長(zhǎng)細(xì)胞活力不斷降低，到72 h達(dá)到最低。見圖1。

圖1 姜黃素顯著降低宮頸癌SiHa細(xì)胞活力

用50 μmol/L的姜黃素處理宮頸癌SiHa細(xì)胞 72 h后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。與對(duì)照組相比，姜黃素組的細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），見圖2。

圖2 姜黃素顯著促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡

2.2 姜黃素促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的相關(guān)因子檢測(cè) 用50 μmol/L的姜黃素處理宮頸癌SiHa細(xì)胞72 h后，與對(duì)照組相比，姜黃素組lncRNA MEG3的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），見圖3A。與對(duì)照相 比，經(jīng)姜黃素處理的細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），見圖3B。

用50 μmol/L的姜黃素處理宮頸癌SiHa細(xì)胞 72 h后，與對(duì)照組相比，姜黃素組細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，姜黃素組細(xì)胞中Cleaved caspase3的水平顯著升高（P＜ 0.01）。見圖3C。

圖3 姜黃素促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的相關(guān)因子檢測(cè)

2.3 敲低表達(dá)LncRNA MEG3抑制了姜黃素對(duì)SiHa細(xì)胞的促凋亡作用 將SiHa細(xì)胞利用siRNA進(jìn)行LncRNA MEG3敲低表達(dá)，見圖4A。用50 μmol/L的姜黃素處理宮頸癌SiHa細(xì)胞72 h后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。轉(zhuǎn)染LncRNA MEG3 siRNA后，對(duì)照組和姜黃素組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而轉(zhuǎn)染NC siRNA后，姜黃素組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。見圖4B。

圖4 敲低表達(dá)LncRNA MEG3抑制了姜黃素對(duì)SiHa細(xì)胞的促凋亡

2.4 敲低表達(dá)LncRNA MEG3逆轉(zhuǎn)了姜黃素對(duì)miR-21和PTEN的影響 將SiHa細(xì)胞利用siRNA進(jìn)行LncRNA MEG3敲低表達(dá)后用50 μmol/L的姜黃素處理宮頸癌SiHa細(xì)胞72 h，提取總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-21表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染LncRNA MEG3 siRNA后，姜黃素組與對(duì)照組之間miR-21表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），而轉(zhuǎn)染NC siRNA后，姜黃素組miR-21表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著下降（P＜0.01）。見圖5A。轉(zhuǎn)染LncRNA MEG3 siRNA后，姜黃素組和對(duì)照組之間PTEN和Cleaved caspase3的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而轉(zhuǎn)染NC siRNA后，姜黃素組PTEN和活化的Cleaved caspase3表達(dá)水平與對(duì)照組相比都顯著升高（P＜0.01）。見圖5B。

圖5 敲低表達(dá)LncRNA MEG3能夠逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)miR-21、PTEN和Cleaved caspase3的調(diào)控

3 討論

宮頸癌作為世界女性第四大癌癥[1]，其發(fā)病的主要原因是HR-HPV的持續(xù)感染[2]。然而，HPV感染自身不足以引起宮頸癌前病變和宮頸癌，宿主因素也是必不可少的[13-14]。

近年來很多研究表明，姜黃素具有抗多種腫瘤的效果[15]。此外有研究[16]發(fā)現(xiàn)，LncRNA作為一種不編碼蛋白的RNA分子，具有潛在的復(fù)雜多樣的生物功能，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過程，而且與多種藥物的抗癌機(jī)制密切聯(lián)系。筆者前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素能夠殺傷HPV陽性宮頸癌細(xì)胞，并且能上調(diào)LncRNA MEG3的表達(dá)水平。本研究繼續(xù)探索了姜黃素殺傷HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的機(jī)制以及上調(diào)表達(dá)的LncRNA MEG3在該殺傷過程中的作用。

與筆者之前的結(jié)果相一致，細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素能夠顯著促進(jìn)HPV16陽性宮頸癌SiHa細(xì)胞的凋亡，而且姜黃素能夠顯著上調(diào)LncRNA MEG3的表達(dá)。LncRNA MEG3在多種癌癥中作為抑癌因子發(fā)揮作用[7-10]，而且過表達(dá)的LncRNA MEG3能夠抑制miR-21的表達(dá)[7，11]。本研究結(jié)果也表明，姜黃素能夠顯著下調(diào)HPV16 陽性宮頸癌SiHa細(xì)胞中miR-21的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，miR-21能夠與PTEN的3’-UTR結(jié)合，抑制PTEN的表達(dá)[17-18]，而PTEN能夠調(diào)節(jié)PI3K/Akt等信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。本結(jié)果顯示，姜黃素顯著上調(diào)了PTEN和活化的caspase3的表達(dá)。據(jù)此，筆者推測(cè)姜黃素有可能通過上調(diào)LncRNA MEG3而降低miR-21的表達(dá)，從而上調(diào)PTEN和活化的caspase3的表達(dá)，最終促進(jìn)HPV16陽性宮頸癌細(xì)胞的凋亡。筆者通過LncRNA MEG3表達(dá)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這種假設(shè)。干擾宮頸癌細(xì)胞中LncRNA MEG3的表達(dá)抑制了姜黃素引起的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，逆轉(zhuǎn)了姜黃素引起的miR-21、PTEN和活化的caspase3等表達(dá)水平變化。

本研究發(fā)現(xiàn)了姜黃素能夠激活LncRNA MEG3/miRNA-21/PTEN信號(hào)通路，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，對(duì)于姜黃素治療宮頸癌具有重要理論意義。