武文一，白永愉，莊曉鵬，蔡一奇，周珠哈，阮小蛟

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015

環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)反式剪接使3’端和5’端共價(jià)結(jié)合形成閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有高度穩(wěn)定性、生物進(jìn)化保守性和組織表達(dá)特異性[1-2]。許多研究表明，circRNA不僅在轉(zhuǎn)錄翻譯等生物學(xué)進(jìn)程中扮演重要角色[3-4]，且與腫瘤等多種疾病相關(guān)，影響癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移[5-10]。circRNA通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮作用，目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為circRNA的主要功能是通過(guò)作為微小RNA（microRNA,miRNA）的分子海綿來(lái)實(shí)現(xiàn)，通過(guò)影響miRNA的表達(dá)，導(dǎo)致miRNA靶基因的變化[5，11]。胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，是世界第三大癌癥死亡原因[12]，有易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)，而circRNAs在胃癌的進(jìn)展中起到了重要調(diào)節(jié)作用。hsa_circ_0001322由EIF4E3基因的外顯子3-8反向剪接形成，我們前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001322在胃癌組織中表達(dá)明顯降低，但其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）對(duì)54例胃癌組織及配對(duì)癌旁正常胃黏膜組織hsa_circ_0001322的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器 TRIzol試劑和RNase-free water購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；5×Prime Script RT Master Mix和SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自日本Takara公司；RT-qPCR儀購(gòu)自德國(guó) Analytikjena公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集：選取2019年10月至2020年4月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科行手術(shù)治療的胃癌患者54例，年齡44～82（72.0±4.7）歲。再選取2020年2月至2020年5月我院胃癌患者24例作為驗(yàn)證集，年齡54～76（69.4±3.1）歲。所有患者術(shù)前未行放、化療等治療，組織病理類型及分期的判斷由本院病理科醫(yī)師按世界衛(wèi)生組織胃癌的組織學(xué)分型國(guó)際分類法（1979年）和美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)第八版標(biāo)準(zhǔn)出具病理報(bào)告。每例標(biāo)本留取腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的距腫瘤6 cm以上的癌旁正常胃黏膜組織，離體后10 min內(nèi)置于液氮保存待做后續(xù)分析。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 總RNA提?。喝∵m量組織進(jìn)行液氮研磨（研缽先高壓高溫滅菌處理），將粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有1 mL TRIzol的EP管中，充分震蕩混勻。取0.2 mL氯仿于上述EP管中，充分震蕩3 min，冰上靜置 5 min，4 ℃離心12 000 r/min，15 min。吸取上層水相至新的RNase-free EP管中，加入0.6 mL異丙醇，混勻，-20 ℃放置30 min。置入離心機(jī)，12 000 r/min， 4 ℃離心30 min，棄上清液，觀察是否有沉淀。沿管壁加入1 mL預(yù)冷的75% DEPC水配制乙醇，輕輕上下顛倒，洗滌離心管。再次置入離心機(jī)4 ℃， 7 500 r/min，離心5 min，棄去液體（盡量吸干）。室溫干燥5 min，加入40 μL RNase-free水溶解，230 nm處檢測(cè)RNA濃度，-80℃保存。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)：采用RT-qPCR方法，以GAPDH 作為內(nèi)參，分析hsa_circ_ 0001322表達(dá)，相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。2 μg總RNA分別以hsa_circ_0001322及GAPDH引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min， 85 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保存。以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR。檢測(cè)反應(yīng)體系包括：10 μL SYBR qPCR Master Mix，0.5 μL circRNA特異前向引物、0.5μL特異反向引物，1 μL cDNA，8 μL ddH2O。RT-qPCR條件為：在95 ℃下預(yù)變性5 min，然后在 95 ℃下30 次變性30 個(gè)循環(huán)，60 ℃退火30 s，在 72 ℃延伸30 s，最后延伸在72 ℃下放置7 min。所有樣品做兩個(gè)復(fù)孔。記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參照，采用RT-qPCR中的相對(duì)定量法，以2-ΔΔCt表示腫瘤組織目的基因的表達(dá)相對(duì)于配對(duì)的癌旁正常胃黏膜組織的變化倍數(shù)，其中ΔΔCt= （Cthsa_circ_0001322-CtGAPDH）腫瘤-（Cthsa_circ_000132-CtGAPDH）正常。癌旁正常胃黏膜組織的基因表達(dá)值為1。

表1 circRNA RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行分析。hsa_circ_0001322相對(duì)表達(dá)值不符合正態(tài)分布，以M（P25，P75）表示，胃癌及配對(duì)癌旁正常胃黏膜組織間比較采用配對(duì)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)比較，兩獨(dú)立樣本間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskall-Wallis檢驗(yàn)。采用偏相關(guān)分析探討胃癌組織hsa_circ_0001322的表達(dá)量（相對(duì)于GAPDH的ΔCT值，經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布）在去除各影響因素后與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve,ROC曲線）分析胃癌組織中hsa_circ_0001322的相對(duì)表達(dá)量對(duì)判斷胃癌組織有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及配對(duì)癌旁正常胃黏膜組織中hsa_circ_ 0001322的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果表明，與配對(duì)癌旁正常胃黏膜組織比較，胃癌組織中的hsa_circ_ 0001322相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 hsa_circ_0001322在胃癌組織相對(duì)癌旁正常胃黏膜組織的表達(dá)情況

2.2 hsa_circ_0001322表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 高分化組的胃癌組織中hsa_circ_0001322的相對(duì)表達(dá)量明顯高于低分化組，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中hsa_circ_0001322的相對(duì)表達(dá)量明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。另外，不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期及TNM分期間胃癌組織中hsa_circ_0001322的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 胃癌中hsa_circ_0001322表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系

2.3 hsa_circ_0001322與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析 胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移受患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤浸潤(rùn)深度、細(xì)胞分化程度等多因素影響，我們采用偏相關(guān)分析排除這些影響因素后判斷hsa_circ_0001322是否與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)。結(jié)果顯示，無(wú)論患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤浸潤(rùn)深度和細(xì)胞分化程度如何，hsa_circ_0003122的表達(dá)量與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在負(fù)相關(guān)性（r=-0.587，P＜0.05）。

2.4 ROC曲線分析hsa_circ_0001322預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感度和特異度 ROC曲線分析結(jié)果顯示，曲線下面積（area under curve,AUC）為0.808（95%CI=0.684～0.933，P＜0.05），以hsa_circ_ 0001322相對(duì)表達(dá)量0.254作為截?cái)嘀蹬袛辔赴┯袩o(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感度和特異度分別為90.0%和75.0%，見(jiàn)圖2。

圖2 hsa_circ_0001322判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能

為進(jìn)一步分析hsa_circ_0001322 預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能，我們另外選取24 例胃癌患者作為驗(yàn)證集，仍以hsa_circ_0001322 相對(duì)表達(dá)量0.254作為截?cái)嘀?，?duì)胃癌有無(wú)淋巴結(jié)進(jìn)行預(yù)測(cè)并與手術(shù)后病理報(bào)告（有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例）對(duì)比。ROC曲線分析顯示，AUC為0.757（95%CI=0.542～0.972，P＜0.05），敏感度和特異度分別為85.7%和80.0%。見(jiàn)圖3。

圖3 hsa_circ_0001322預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能

3 討論

我國(guó)是全球胃癌發(fā)病率最高的國(guó)家，五年存活率僅為27.4%。雖然隨著胃鏡篩查的普及[13]、手術(shù)方式的改良以及輔助放化療的綜合診治手段的推廣，胃癌患者的預(yù)后和生活質(zhì)量已經(jīng)有了較大的提升[14]，但胃癌的預(yù)防和診治仍面臨著許多挑戰(zhàn)。胃癌早期患者經(jīng)及時(shí)治療后的生存率可以達(dá)到90%～95%，但是由于此時(shí)病灶小、較隱秘，且患者癥狀不明顯，易被誤診或者漏診，確診時(shí)已發(fā)展成中晚期胃癌，所以早期胃癌的診斷意義重大，但是現(xiàn)在對(duì)于臨床癥狀不明顯，影像學(xué)不典型的早期胃癌患者還沒(méi)有非常經(jīng)濟(jì)可靠的檢測(cè)手段。另外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素，局部病灶切除加區(qū)域淋巴結(jié)清掃是治療胃癌的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式。但是淋巴結(jié)清掃也伴隨著更高的手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生率以及病死率，并且臨床上常常也因淋巴結(jié)清掃范圍盲目擴(kuò)大，而嚴(yán)重影響手術(shù)療效。因此準(zhǔn)確判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是精確手術(shù)治療胃癌的前提，現(xiàn)在主流的影像學(xué)分析技術(shù)雖已經(jīng)獲得了極大進(jìn)步，但是仍達(dá)不到完全有效的程度，容易漏診或難以判斷[15]，仍亟待其他技術(shù)手段的輔助。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物在癌癥篩查及診斷中發(fā)揮了越來(lái)越重要的角色，結(jié)合特異性腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合診斷方法具有更好的便捷性和更高的準(zhǔn)確度。circRNAs是非編碼RNA的一種特殊類型，與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNAs因其具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以抵抗外切酶和RNA酶的降解，因而在細(xì)胞中可以相對(duì)穩(wěn)定存在[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)circRNAs可以作為分子海綿吸附miRNAs抑制其功能進(jìn)而調(diào)控癌癥的發(fā)展：如circ-TTBK2通過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)節(jié)miR-217/HNF1β/Derlin-1 軸促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展[18]；circEYA3通過(guò)海綿作用吸附miR-1294調(diào)節(jié)c-Myc表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的進(jìn)展[19]；circCCDC9通過(guò)調(diào)節(jié)miR-6792-3P/CAV1軸抑制胃癌的進(jìn)展[20]。同時(shí)MA等[21]報(bào)道hsa_circ_0004872通過(guò)調(diào)節(jié)miR-224/Smad4/ADAR1通路影響胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另外cicrRNA的表達(dá)具有非常強(qiáng)的組織特異性，同時(shí)其在直腸癌、肝癌以及胰腺癌等癌癥中都表現(xiàn)出明顯的異常表達(dá)現(xiàn)象[22]。以上功能特征使得cicrRNA具有作為有效診斷癌癥的特異性標(biāo)志物的潛力。

本研究檢測(cè)了54 例胃癌患者的胃癌組織以及配對(duì)的癌旁正常胃黏膜組織中的hsa_circ_0001322的表達(dá)情況。有趣的是54 例胃癌患者的胃癌組織相對(duì)于癌旁正常胃黏膜組織中hsa_circ_0001322的表達(dá)量皆出現(xiàn)了明顯下降，同時(shí)臨床病理特征關(guān)聯(lián)分析表明其下降在胃癌的各種病理特征分類下都具有一致性，說(shuō)明此下降現(xiàn)象與胃癌病變有直接的強(qiáng)關(guān)聯(lián)。這說(shuō)明癌變的發(fā)生會(huì)伴隨著組織中hsa_circ_0001322表達(dá)量的下降，且這種變化趨勢(shì)的穩(wěn)定性較好。這些變化特征使得hsa_circ_0001322具有作為胃癌診斷的生物標(biāo)志物的潛力。通過(guò)病理特征關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)在是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例分組中hsa_circ_0001322的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另外除分化程度外，其他病理特征分組的hsa_circ_0001322相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明其在胃癌組織中的進(jìn)一步變化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，進(jìn)一步偏相關(guān)分析結(jié)果顯示排除患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤浸潤(rùn)深度和細(xì)胞分化程度后，hsa_circ_0003122的表達(dá)量與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在負(fù)相關(guān)性。hsa_circ_0001322這種變化特征使得它具有作為指示胃癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物的潛力。ROC曲線分析結(jié)果顯示，AUC為0.808，當(dāng)hsa_circ_0001322的相對(duì)表達(dá)量為0.254時(shí)，其預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感度和特異度分別為90.0%和75.0%；本研究繼續(xù)選取24例胃癌患者驗(yàn)證ROC曲線的效能，其AUC為0.757，敏感度和特異度分別為85.7%和80.0%，其在預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面可能具有一定的潛力。

但是本研究尚有一些需要完善的地方，首先我們是從病理樣本中檢測(cè)hsa_circ_0001322的表達(dá)變化，這在一定程度上限制了檢測(cè)的便捷性，可以進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析血清中hsa_circ_0001322的表達(dá)變化，以觀察其規(guī)律。其次，臨床病例分析發(fā)現(xiàn)多種生物標(biāo)志物聯(lián)合使用，可以增加預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度，我們可以進(jìn)一步探索hsa_circ_0001322與其他生物標(biāo)志物，如SLP1、PG等，聯(lián)合分析是否可以增加預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確度。再次本研究的樣本量較少，如針對(duì)更廣泛的患者，這種規(guī)律是否會(huì)保持一致，也需要探討的問(wèn)題。