劉沫然 鄭玉婷 李紅柳 肖銦 杜欣 才奇博

作者單位：161000 黑龍江齊齊哈爾，齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院檢驗科（劉沫然、鄭玉婷、李紅柳、杜欣、才奇博），腫瘤一科（肖銦）

近年來，由于臨床各類侵入性操作的增加以及抗菌藥物的不合理應用，會削弱患者機體免疫功能，增加血流感染的發(fā)生率［1］。血流感染具有病情發(fā)展迅速且危及生命等特點，會引發(fā)機體嚴重損傷，也是導致重癥監(jiān)護病房（intensive care unit，ICU）患者死亡的重要原因之一，現已引起臨床的高度重視與關注［2-3］。傳統血培養(yǎng)鑒定具有易操作、結果準確等優(yōu)點，但耗費時間較長，細菌培養(yǎng)一般需16～24 h［4］。然而對血流感染患者而言，時間就是生命，及早鑒定出病原菌對提高患者存活率具有重要意義。細胞分離液Percoll是一種硅膠顆粒，含有乙烯吡咯烷酮，不能穿透生物膜，因此多用于病毒、細菌和細胞分離［5］。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）沉淀法利用溫和的表面活性劑純化菌體，去除干擾因素，從而提高細菌鑒定率?；|輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDITOF MS）是一種新型的細菌鑒定技術，不僅可以鑒定純培養(yǎng)的菌落，還可以直接鑒定培養(yǎng)結果為陽性的體液、尿液、血液標本，與傳統血培養(yǎng)方法比較，明顯縮短了細菌鑒定時間［6-7］。本研究收集2022年1—11月齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院接收的300份血培養(yǎng)報警陽性標本，探討Percoll分離法和SDS沉淀法聯合MALDI-TOF MS在快速鑒定血流感染病原菌中的應用價值，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1樣本收集 收集2022年1—11月齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院接收的300份血培養(yǎng)報警陽性標本（報警時間＜48 h），剔除同日同一位患者重復報警的標本。

1.2儀器與試劑 安圖AUTOF-MS1000基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀購自鄭州安圖生物工程股份有限公司，BD 9120全自動血培養(yǎng)儀購自美國BD公司，DL96A全自動微生物鑒定及藥敏分析系統購自珠海迪爾生物工程股份有限公司，HF151細菌培養(yǎng)箱由上海力申科學儀器有限公司提供。SDS溶液購自北京中諾泰安科技有限公司，Percoll細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司，中國藍瓊脂平板和血瓊脂平板均購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.3研究方法

1.3.1菌種鑒定 將收集的血培養(yǎng)報警陽性標本立即接種到血瓊脂平板和中國藍瓊脂平板，在35 ℃需厭氧環(huán)境中培養(yǎng)16～24 h后，對單個菌落進行染色鏡檢，通過MALDI-TOF MS對細菌進行直接鑒定。

1.3.2Percoll分離法 取3 mL 0.9%氯化鈉溶液和3 mL培養(yǎng)瓶內容物，加入15 mL離心管中，混勻后以1 000 r/min（離心半徑為8 cm）離心10 min，將上清液移至另一支離心管中，以5 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入0.4 mL超純水，轉移至提前加入2 mL Percoll液的離心管中，氯化鈉溶液與Percoll溶液的體積比為7︰3，以5 000 r/min離心5 min，棄上清液，轉移余下的液體至平底EP管，以13 000 r/min離心2 min，棄上清液，重復洗滌2次，直至洗滌液清亮。

1.3.3SDS沉淀法 取3 mL 0.9%氯化鈉溶液和3 mL培養(yǎng)瓶內容物，加入15 mL離心管中，混勻后以1 000 r/min離心10 min，將上清液移至另一支離心管中，加入1 mL 0.05% SDS溶液，將管內溶液顛倒混勻，以5 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1.5 mL超純水，混勻后轉移至平底EP管，以13 000 r/min離心2 min，棄上清液，重復洗滌2次，洗滌后盡可能排干多余水分。

1.3.4MALDI-TOF MS直接鑒定法 取1 μL富集菌體，涂布在金屬靶板（96孔）上，在室溫環(huán)境下干燥處理，加入1 μL 70%甲酸，室溫環(huán)境下干燥處理，加入1 μL基質液覆蓋，室溫環(huán)境下干燥處理，將靶板置于MALDI-TOF MS質譜儀上，進行細菌鑒定分析，詳細記錄鑒定結果。

1.3.5傳統血培養(yǎng)鑒定法 將采集的陽性標本接種到中國藍瓊脂平板和血瓊脂平板上，在需厭氧環(huán)境下孵育16～24 h，孵育溫度為35 ℃，獲得純菌落后，進行細菌鑒定。

1.4統計學方法 數據處理采用SPSS 26.0 軟件，計量資料符合正態(tài)分布以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗；計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Percoll分離法與SDS沉淀法鑒定結果比較300份標本中分離出210株革蘭陰性（Gram negative，G-）菌、78株革蘭陽性（Gram positive，G+）菌以及12株念珠菌。Percoll分離法對G+菌、G-菌和念珠菌的鑒定率均明顯高于SDS沉淀法，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 Percoll分離法與SDS沉淀法對菌株的鑒定結果

2.2MALDI-TOF MS對Percoll分離法和SDS沉淀法處理后標本的病原菌鑒定結果與傳統血培養(yǎng)鑒定結果比較 MALDI-TOF MS對Percoll分離法處理后標本G+菌、G-菌的鑒定率均明顯高于SDS沉淀法處理后標本病原菌的鑒定率（均P＜0.05），MALDI-TOF MS對Percoll分離法處理后標本真菌鑒定率與傳統血培養(yǎng)鑒定率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。MALDI-TOF MS對SDS沉淀法處理后標本G+菌、G-菌的鑒定率均明顯低于傳統血培養(yǎng)方法（均P＜0.05）。見表2。

表2 MALDI-TOF MS對Percoll分離法和SDS沉淀法處理后標本病原菌鑒定結果與傳統血培養(yǎng)鑒定結果比較

3 討論

血流感染是由于各種毒素和病原菌生物侵入人體血液系統而引發(fā)的一種血液感染，膿毒癥血流感染是一種較嚴重的全身感染性疾病，血液中不斷釋放大量毒素和代謝產物，會加重患者的原發(fā)病，增加病死率［8-9］。血流感染具有病情進展迅速、病死率高、預后差等特征，病死率可高達20%以上［10］?？焖勹b定血流感染病原菌對患者疾病的早期診斷及治療具有重要意義。傳統血培養(yǎng)是臨床診斷血流感染的“金標準”，但該方法耗費時間較長，尤其是對于非典型微生物、苛氧菌等，診斷時間更長，不能滿足臨床診治需求［11-12］。實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）、病原菌核酸技術熒光原位雜交雖然也能明確病原菌類型，但菌種受限于已知類型，具有對檢測人員技術要求高、耗時長、成本高等不足［13］。MALDI-TOF MS技術給血流感染的病原菌類型鑒定提供了廉價、高效、可靠的方法。

由于MALDI-TOF MS檢測法對蛋白的純度及豐度要求較高，因此在進行MALDI-TOF MS法檢測前需要先分離培養(yǎng)物中的菌體，將血漿蛋白和細胞去除，最大限度降低對檢測結果的干擾［14-15］。本研究對選定的血液樣品在MALDI-TOF MS檢測前先通過Percoll分離法和SDS沉淀法快速提取血培養(yǎng)陽性病原菌，結果顯示，Percoll分離法對G+菌、G-菌、念珠菌的鑒定率均明顯高于SDS沉淀法，差異均有統計學意義，表明Percoll分離法對提取血培養(yǎng)陽性病原菌的鑒定率高于SDS沉淀法。本研究結果顯示，MALDI-TOF MS對Percoll分離法處理后標本的病原菌鑒定率明顯高于SDS沉淀法處理后標本病原菌鑒定率，表明將MALDI-TOF MS法與Percoll分離法結合可提高對病原菌的鑒定率，鑒定結果與傳統血培養(yǎng)鑒定結果較接近。分析原因可能是SDS沉淀法在提取和鑒定病原菌的過程中，雖然使用的SDS溶液濃度較低，但仍會影響脆弱擬桿菌等部分G-菌的形態(tài)結構，導致SDS沉淀法檢測的部分G-菌發(fā)生黏液化，從而導致病原菌聚集成團，最終降低鑒定診斷的準確度［16-17］。SDS沉淀法處理后病原菌的鑒定率降低，考慮可能與部分細菌的細胞壁結構不同有關，G-菌與G+菌比較細胞壁更薄，含有大量蛋白質及脂類物質，因此，洗滌過程中更易被SDS溶液破壞。雖然與SDS沉淀法比較，Percoll分離法提高了鑒定率，但該方法也存在一定不足，如增加了洗滌過程的復雜性，在洗滌過程中容易丟失部分菌體［5］。MALDI-TOF MS檢測法步驟更簡便，結果更精確，對經Percoll分離法處理的標本進行鑒定時，可更加直接、快速、準確地鑒定病原菌類型，提高鑒定結果與傳統血培養(yǎng)鑒定結果的符合率，為血流感染患者的早期診斷與治療提供了科學的參考依據，具有較強的實用性［18-19］。梁林等［20］研究表明，Percoll分離法結合MALDI-TOF MS對G-菌的鑒定率（84.5%）明顯高于SDS沉淀法結合MALDI-TOF MS（60.6%），與本研究結果接近，驗證了Percoll分離法結合MALDI-TOF MS在血流感染病原菌的快速鑒定中鑒定率更高。

綜上所述，將Percoll分離法結合MALDI-TOF MS應用于血流感染病原菌的快速鑒定中，可提高鑒定率，鑒定結果與傳統血培養(yǎng)鑒定結果接近，符合率較高，因此臨床實用價值較高，值得推廣、參考、借鑒，給更多血流感染患者的早期診治帶來福音。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突