劉倩，李春燕,2

綜 述

增強(qiáng)子的鑒定及其在腫瘤研究中的應(yīng)用

劉倩1，李春燕1,2

1. 北京航空航天大學(xué)，大數(shù)據(jù)精準(zhǔn)醫(yī)療高精尖創(chuàng)新中心和醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100191 2. 工業(yè)和信息化部大數(shù)據(jù)精準(zhǔn)醫(yī)療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京航空航天大學(xué))，北京 100191

增強(qiáng)子是一類增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用元件。但是增強(qiáng)子與靶基因的方向和距離不確定，大大增加了研究增強(qiáng)子調(diào)控的靶基因及其作用機(jī)制的困難。已有大量研究顯示，增強(qiáng)子的突變或功能異常與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)；僅有少量研究報道增強(qiáng)子通過促進(jìn)靶基因的表達(dá)，引發(fā)癌癥或產(chǎn)生抗藥性。目前與癌癥發(fā)生發(fā)展和在癌癥治療過程中抗藥性產(chǎn)生相關(guān)的增強(qiáng)子尚未得到充分鑒定，這些增強(qiáng)子的調(diào)控機(jī)制也未得到充分解析。本文對目前可在全基因組水平上預(yù)測和鑒定增強(qiáng)子以及解析增強(qiáng)子調(diào)控機(jī)制的方法進(jìn)行總結(jié)和對比，并對近幾年增強(qiáng)子在腫瘤診斷、治療和發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。期望本文為篩選與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的增強(qiáng)子和解析這些增強(qiáng)子的調(diào)控機(jī)制提供參考，為提高癌癥的診斷和制定癌癥的治療策略提供新的視角。

增強(qiáng)子；超級增強(qiáng)子；鑒定；腫瘤

增強(qiáng)子是一種通過與靶基因啟動子相互作用來增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控元件。增強(qiáng)子與調(diào)控的靶基因的位置不確定，有些位于靶基因的5?端，有些位于靶基因的3?端，甚至位于基因的內(nèi)含子中。增強(qiáng)子與靶基因的距離也不確定，甚至遠(yuǎn)離靶基因達(dá)幾 Mb仍可增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。猿猴空泡病毒40 (simian virus 40,)的增強(qiáng)子與其早期啟動子相距3000 bp以上，并且該增強(qiáng)子無論是在啟動子上游還是下游均能對轉(zhuǎn)錄起增強(qiáng)作用。在小鼠()肢芽組織中，()基因與增強(qiáng)子相距1 Mb以上，但是此增強(qiáng)子仍然可以通過促進(jìn)的表達(dá)，參與器官的模式形成[1]。盡管在DNA序列上，增強(qiáng)子距離靶基因有很遠(yuǎn)的距離，但在染色質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)上，增強(qiáng)子區(qū)域和靶基因啟動子區(qū)域形成三維環(huán)狀結(jié)構(gòu)(3D-loop)直接相互作用，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[1,2]。

2006年，Chapel-Fernandes等[3]發(fā)現(xiàn)人(prostate specific antigen)增強(qiáng)子可以增強(qiáng)啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白在前列腺癌中的表達(dá)。近年來，越來越多研究表明增強(qiáng)子通過增強(qiáng)啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[4]。癌基因的表達(dá)水平上調(diào)是腫瘤形成的重要機(jī)制，經(jīng)過基因重組或基因突變的增強(qiáng)子，通?？纱龠M(jìn)癌基因的表達(dá)[5,6]。近年來，湯柳笛等[5]發(fā)現(xiàn)，在基因重組過程中增強(qiáng)子位置變化與腫瘤發(fā)生相關(guān)，基因重組使原本距癌基因較遠(yuǎn)的增強(qiáng)子出現(xiàn)在癌基因附近，進(jìn)而增強(qiáng)子可以調(diào)控附近癌基因的表達(dá)[5]。2017年，Abraham等[6]發(fā)現(xiàn)插入突變的增強(qiáng)子在腫瘤發(fā)生中起著重要作用，并在致癌基因附近的增強(qiáng)子序列中發(fā)現(xiàn)了多種插入突變，如插入突變造成調(diào)控原癌基因(LIM only protein 2)的活性增強(qiáng)子形成，使正常體細(xì)胞癌變?yōu)樵l(fā)性白血病腫瘤細(xì)胞。因此，對增強(qiáng)子位置、活性及功能的鑒定對研究癌癥的發(fā)生機(jī)制具有重要意義，可提供全新的癌癥治療策略。本文主要總結(jié)了增強(qiáng)子和超級增強(qiáng)子的特點(diǎn)、鑒定和預(yù)測調(diào)控機(jī)制的方法及其在腫瘤研究中的應(yīng)用。

1 增強(qiáng)子及其特性

增強(qiáng)子最早被發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代初期。1980年，Grosschedl等[7]發(fā)現(xiàn)位于組蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大于100 bp處的一段DNA序列能促進(jìn)基因有效轉(zhuǎn)錄。1981年，Benoist等[8]在早期基因的上游發(fā)現(xiàn)了首個增強(qiáng)子序列，該序列的缺失會使基因的轉(zhuǎn)錄效率降低，將增強(qiáng)子序列反轉(zhuǎn)后放置在基因的下游依然可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，由此將這種不依賴位置和方向增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄的順式元件命名為增強(qiáng)子[9]。

隨著增強(qiáng)子研究的深入，其作用特點(diǎn)以及生物學(xué)功能進(jìn)一步被發(fā)現(xiàn)。近40年的研究證明增強(qiáng)子具有以下特征：(1)增強(qiáng)子是增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄的順式作用元件。但不能根據(jù)方向和距離預(yù)測增強(qiáng)子調(diào)控的靶基因，因?yàn)樵鰪?qiáng)子可以位于靶基因的上游，也可位于下游，甚至可以位于基因內(nèi)；而且兩者的距離可遠(yuǎn)可近[10]。(2)增強(qiáng)子位于染色質(zhì)開放區(qū)域。(3)增強(qiáng)子的活性與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、DNA序列的甲基化修飾及核小體中組蛋白的修飾有關(guān)，如增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合可促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄[10]；增強(qiáng)子DNA序列高甲基化會導(dǎo)致eRNA表達(dá)下降，相反，低甲基化可促進(jìn)eRNA的表達(dá)[11]；H3K4me1 (H3 lysine 4 monomethylation)修飾常常促進(jìn)增強(qiáng)子序列轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而H3K27me3 (H3 lysine27 trimethylation)修飾會使增強(qiáng)子沉默無法轉(zhuǎn)錄表達(dá)；H3K27ac (H3 lysine 27 acetylation)修飾使增強(qiáng)子序列轉(zhuǎn)錄活躍[12,13]。(4)增強(qiáng)子區(qū)域需要和啟動子區(qū)域形成三維環(huán)狀結(jié)構(gòu)直接相互作用才能發(fā)揮功能，增強(qiáng)子和啟動子的相互作用由多種蛋白介導(dǎo)，如Mediator復(fù)合體和cohesin等[14,15]。

2 超級增強(qiáng)子及其特性

2013年首個超級增強(qiáng)子(super enhancers, SEs)由美國懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所Richard A. Young實(shí)驗(yàn)室在胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)室定義超級增強(qiáng)子是多個具有轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)子串聯(lián)而成的長約8~20 kb的片段，可以強(qiáng)力驅(qū)動相關(guān)基因的表達(dá)[16]。與增強(qiáng)子相比，超級增強(qiáng)子與重要轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合密度更高，調(diào)控轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度和敏感度更高[17]。

隨著對超級增強(qiáng)子研究的深入，研究人員提出了一些更為明確、普遍的超級增強(qiáng)子特性。目前，超級增強(qiáng)子區(qū)別于增強(qiáng)子的功能特性有：(1)超級增強(qiáng)子結(jié)合更多的轉(zhuǎn)錄因子以及轉(zhuǎn)錄輔助因子[14,15]；(2)超級增強(qiáng)子具有更多的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)組蛋白修飾，如：H3K27ac和H3K4me1修飾；(3)超級增強(qiáng)子的DNA序列具有較低的甲基化修飾[11]；(4)組成超級增強(qiáng)子的單個增強(qiáng)子同樣具有增強(qiáng)子激活靶基因轉(zhuǎn)錄的功能[9]；(5)超級增強(qiáng)子活性對轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的變化更敏感[18]；(6)超級增強(qiáng)子驅(qū)動的基因表達(dá)量更高[9]。增強(qiáng)子與超級增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)特征和功能對比如圖1所示。

3 增強(qiáng)子的研究方法

由于增強(qiáng)子多位于基因的非編碼區(qū)，不同增強(qiáng)子相對于靶基因的位置不固定，而且增強(qiáng)子可能只在特定組織細(xì)胞或特殊生理情況下才具有活性[19]。因此，增強(qiáng)子的發(fā)現(xiàn)和功能注釋變得更為復(fù)雜和具有挑戰(zhàn)性。比較基因組方法(comparative genomics)和轉(zhuǎn)錄因子基序法(transcription factor motif matches)可以進(jìn)行增強(qiáng)子的預(yù)測。在已知各物種基因組序列的前提下，比較基因組法是通過不同物種基因組的比較，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)在不同物種間高度保守的DNA序列。但與編碼基因序列比較，增強(qiáng)子的保守性較差，因此基于保守性預(yù)測增強(qiáng)子的效率較低。轉(zhuǎn)錄因子基序法鑒定增強(qiáng)子的原理基于增強(qiáng)子中包含充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的DNA基序(一般只有6~10 bp)，利用結(jié)合位點(diǎn)的保守性，在全基因組范圍搜索與已知轉(zhuǎn)錄因子基序匹配的序列。較短的DNA序列在整個基因組中出現(xiàn)的頻率較高，影響增強(qiáng)子鑒定的準(zhǔn)確率[17]。此外，通過保守的基因組和基序，無法預(yù)測增強(qiáng)子的活性狀態(tài)。因此需要新的方法進(jìn)行增強(qiáng)子的預(yù)測和鑒定。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，在全基因組水平上研究增強(qiáng)子方法和工具呈現(xiàn)多樣化，如ChIP-Seq (chromatin immunoprecipitation followed by sequencing)、DNase-Seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)、ATAC-Seq (assay for transposase-accessible chromatin with high throughput sequencing)、RNA-Seq (RNA sequen-cing)、基因編輯(gene editing)技術(shù)、亞硫酸氫鹽測序法(bisulfite sequencing PCR, BSP)和染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(chromosome conformation capture, 3C)技術(shù)及其衍生技術(shù)，如環(huán)形染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(circular chromosome conformation capture, 4C)、染色質(zhì)構(gòu)象捕獲碳拷貝(chromosome conformation capture carbon copy, 5C)和高通量染色體構(gòu)象捕獲(high- through chromosome conformation capture, Hi-C)等。

3.1 基于ChIP-Seq技術(shù)鑒定增強(qiáng)子

1997年，Orlando等[20]創(chuàng)立了染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)技術(shù)，該技術(shù)也稱結(jié)合位點(diǎn)分析法，其原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下用甲醛固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，然后利用抗原抗體免疫結(jié)合將含目的蛋白的復(fù)合物沉淀下來，然后從中提取DNA進(jìn)行PCR分析和序列測定，從而獲得與目的蛋白互作的DNA信息。ChIP是在全基因組范圍內(nèi)檢測DNA與蛋白質(zhì)體內(nèi)相互作用的方法[21]。ChIP-Seq技術(shù)是將ChIP技術(shù)與二代測序技術(shù)相結(jié)合在全基因組范圍內(nèi)分析蛋白質(zhì)與DNA互作信息的方法。首先利用ChIP技術(shù)富集與目的蛋白特異性結(jié)合的DNA片段，然后利用二代測序技術(shù)對DNA片段進(jìn)行高通量測序，從而在全基因組范圍內(nèi)獲得與轉(zhuǎn)錄因子、輔助轉(zhuǎn)錄因子、或不同修飾的組蛋白結(jié)合的DNA信息。根據(jù)已知增強(qiáng)子的特征(特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子和輔助轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾特征等)，可利用ChIP-Seq技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)尋找轉(zhuǎn)錄因子和輔助轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、組蛋白修飾區(qū)段，進(jìn)而進(jìn)行增強(qiáng)子的預(yù)測和鑒定[22]。

圖1 增強(qiáng)子與超級增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu)特征和功能

A：增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu)特征和功能。增強(qiáng)子位于染色質(zhì)疏松的區(qū)域，平均長約300 bp。增強(qiáng)子區(qū)域的組蛋白富集H3K4me1和H3K27ac修飾，暴露的DNA序列招募并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子招募Mediator復(fù)合體介導(dǎo)增強(qiáng)子與RNA聚合酶Ⅱ的相互作用。增強(qiáng)子在RNA聚合酶II的介導(dǎo)下雙向轉(zhuǎn)錄eRNA。增強(qiáng)子區(qū)域和啟動子區(qū)域形成三維環(huán)狀結(jié)構(gòu)相互作用，增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。B：超級增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu)特征與功能。超級增強(qiáng)子是由多個具有轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)子串聯(lián)而成，平均長約20 kb。與增強(qiáng)子相比，超級增強(qiáng)子區(qū)域組蛋白的H3K4me1和H3K27ac修飾更加富集，暴露的DNA序列結(jié)合更多的轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子招募更多的Mediator復(fù)合體介導(dǎo)增強(qiáng)子與RNA聚合酶Ⅱ的相互作用。暴露的超級增強(qiáng)子序列通過結(jié)合RNA聚合酶II雙向轉(zhuǎn)錄出超級增強(qiáng)子RNA。超級增強(qiáng)子區(qū)域與啟動子區(qū)域同樣形成三維環(huán)狀結(jié)構(gòu)相互作用，但促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄的效果更為顯著(與A圖比較，啟動子下游的線更粗)。

3.1.1 基于轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合位點(diǎn)鑒定增強(qiáng)子

轉(zhuǎn)錄因子是可以直接結(jié)合在增強(qiáng)子的DNA序列上調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，可利用ChIP-Seq技術(shù)在全基因組內(nèi)尋找增強(qiáng)子DNA序列與轉(zhuǎn)錄因子(蛋白質(zhì))的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行增強(qiáng)子的預(yù)測。轉(zhuǎn)錄輔助因子由轉(zhuǎn)錄因子募集到結(jié)合位點(diǎn)行使生物學(xué)功能，協(xié)助RNA聚合酶與靶基因啟動子的結(jié)合，促進(jìn)增強(qiáng)子RNA的轉(zhuǎn)錄。因此，也可利用ChIP-Seq技術(shù)檢測輔助轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合位點(diǎn)，從而對增強(qiáng)子進(jìn)行預(yù)測。如廣泛表達(dá)的通用輔助轉(zhuǎn)錄激活因子組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶P300，參與多種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[10]。Visel等[23]曾在小鼠模型中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄輔助因子P300的ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)數(shù)千個P300結(jié)合位點(diǎn)，然后通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明絕大部分預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)都顯示了增強(qiáng)子的調(diào)控活性?；蚪M上增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔助因子的結(jié)合機(jī)制為增強(qiáng)子的鑒定提供了可行方法。

3.1.2 基于組蛋白修飾鑒定增強(qiáng)子

纏繞在組蛋白上的DNA處于高度壓縮狀態(tài)，基因很難表達(dá)，為了提高基因的表達(dá)，需要改變DNA與組蛋白的緊密結(jié)合程度。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)的重要部分，組蛋白修飾的改變可導(dǎo)致組蛋白與DNA結(jié)合程度的改變，從而實(shí)現(xiàn)表觀修飾對基因表達(dá)的調(diào)控作用。組蛋白修飾主要包括甲基化、磷酸化、乙?；头核鼗Ｄ壳?，關(guān)于增強(qiáng)子研究較多的組蛋白修飾是組蛋白甲基化和乙?；?。不同的組蛋白甲基化修飾可能會激活也可能會抑制增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如H3K4me1修飾會促進(jìn)增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄，而H3K27me3修飾會抑制增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄。組蛋白乙?；揎椏梢詼p弱增強(qiáng)子DNA序列與組蛋白的結(jié)合程度，讓部分DNA序列暴露，進(jìn)而可以與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合促進(jìn)增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如H3K27ac修飾使增強(qiáng)子序列轉(zhuǎn)錄活躍；相反，組蛋白去乙酰化會使增強(qiáng)子DNA序列與組蛋白的結(jié)合更加緊密，抑制增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[24]。目前H3K4me1和H3K27ac常用來作為鑒定增強(qiáng)子的組蛋白修飾特征。

Nathaniel等[25]利用ChIP-Seq技術(shù)在人類基因組中發(fā)現(xiàn)高密度的H3K4me1修飾存在于活性增強(qiáng)子區(qū)域[25]。研究者發(fā)現(xiàn)H3K27ac修飾是區(qū)分活性增強(qiáng)子和非活性增強(qiáng)子的重要標(biāo)記，非活性增強(qiáng)子只存在H3K4me1的修飾；而活性增強(qiáng)子存在H3K4me1、H3K27ac等的修飾，位于轉(zhuǎn)錄基因的近端；存在H3K27me3和H3K4me1修飾卻不存在H3K27ac修飾，不參與基因的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子為平衡增強(qiáng)子[26,27]。此外，有活性的增強(qiáng)子可以有多種組蛋白修飾方式，如H3K79me3 (H3 lysine 79 trimethylation)、H4K16ac (H3 lysine 16 acetylation)和H3K122ac (H3 lysine 122 acetylation)修飾等[27~29]。因此，利用ChIP-Seq技術(shù)在全基因組水平尋找富集多種不同的組蛋白修飾的位點(diǎn)進(jìn)行增強(qiáng)子預(yù)測和活性鑒定。

3.2 基于DNA甲基化檢測技術(shù)鑒定有活性的增強(qiáng)子

DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下DNA序列特定堿基共價結(jié)合一個甲基基團(tuán)，DNA甲基化通常發(fā)生在CpG (胞嘧啶–磷酸–鳥嘌呤)位點(diǎn)，胞嘧啶在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下結(jié)合一個甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。通過增強(qiáng)子DNA甲基化修飾，可以在不改變增強(qiáng)子DNA序列的情況下影響增強(qiáng)子的活性。增強(qiáng)子DNA序列高甲基化會導(dǎo)致eRNA表達(dá)下降，相反，低甲基化可促進(jìn)eRNA的表達(dá)，因此，增強(qiáng)子序列CpG位點(diǎn)的甲基化成為增強(qiáng)子活性預(yù)測的標(biāo)志物[30,31]。

常用的DNA甲基化檢測方法為BSP直接測序法，首先用重亞硫酸氫鹽處理DNA，然后設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直接對PCR產(chǎn)物測序進(jìn)而判斷CpG位點(diǎn)是否甲基化[32]。增強(qiáng)子序列的甲基化水平與增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄活性成反比，通過BSP直接測序法檢測已知增強(qiáng)子序列CpG位點(diǎn)是否甲基化，進(jìn)而預(yù)測增強(qiáng)子的活性。

3.3 基于DNase-Seq、ATAC-Seq、RNA-Seq技術(shù)鑒定有活性的增強(qiáng)子

核小體是由DNA和組蛋白形成的染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位，一連串的核小體呈螺旋狀排列構(gòu)成染色質(zhì)。常染色質(zhì)狀態(tài)下的DNA壓縮包裝比約為1000，在細(xì)胞有絲分裂前期染色質(zhì)高度螺旋化成染色體，此染色體狀態(tài)下的DNA壓縮包裝比最高可達(dá)8400，染色體長度約為伸展?fàn)顟B(tài)的萬分之一，核小體的高度壓縮使DNA序列不被暴露。非活性增強(qiáng)子通常由未修飾的核小體緊密包裹，因此它不能與轉(zhuǎn)錄因子或聚合酶結(jié)合。當(dāng)增強(qiáng)子被激活時，它的局部染色質(zhì)首先被修飾(如H3K4me1)變得松散，可以與轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶結(jié)合[10,33]。

當(dāng)增強(qiáng)子與一些轉(zhuǎn)錄因子如CBP(CREB- binding protein)結(jié)合，被充分激活，增強(qiáng)子將去除核小體結(jié)構(gòu)，局部染色質(zhì)完全開放，使其具有可接近性(亦稱為染色質(zhì)可及性，chromatin acces-sibility)。可以利用脫氧核糖核酸酶I超敏位點(diǎn)測序(DNase-Seq)技術(shù)或ATAC-Seq技術(shù)檢測染色質(zhì)開放區(qū)域。DNase-Seq技術(shù)利用脫氧核糖核酸酶I (DNase I)識別并切割染色質(zhì)開放區(qū)域的DNA片段，然后對切出的DNA片段測序，與已知基因組序列進(jìn)行比對，在全基因組范圍內(nèi)確定染色質(zhì)開放的區(qū)域[33]。ATAC-Seq技術(shù)利用Tn5轉(zhuǎn)座酶將已知序列標(biāo)簽插入到染色質(zhì)開放區(qū)域，利用已知序列標(biāo)簽進(jìn)行測序，捕獲全基因組范圍內(nèi)完整的染色質(zhì)開放區(qū)域。與DNase-Seq相比，ATAC-Seq不僅操作簡單、可重復(fù)性強(qiáng)，并且可以在全基因組范圍內(nèi)捕獲完整的染色質(zhì)開放區(qū)域[33]。由于增強(qiáng)子位于染色質(zhì)開放區(qū)域，利用DNase-Seq或ATAC-Seq在全基因組范圍內(nèi)檢測染色質(zhì)開放區(qū)域，可進(jìn)行增強(qiáng)子的預(yù)測。

當(dāng)增強(qiáng)子區(qū)域與RNA聚合酶結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄出增強(qiáng)子RNA。通過檢測增強(qiáng)子表達(dá)出的eRNAs (如通過分析RNA-Seq數(shù)據(jù))，鑒定增強(qiáng)子的活性。Kim等[34]通過RNA-Seq數(shù)據(jù)分析，在神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了活躍增強(qiáng)子的廣泛轉(zhuǎn)錄模式。2018年，Chen等[35]利用TCGA的RNA-Seq數(shù)據(jù)對33種癌癥類型近9000例癌癥患者樣本中的增強(qiáng)子表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)癌癥中廣泛存在已激活的增強(qiáng)子。2019年，美國德州大學(xué)健康科學(xué)中心韓冷實(shí)驗(yàn)室利用RNA-Seq技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)鑒定了9108種人類癌癥中可檢測到的eRNAs，構(gòu)建了目前最完整的癌癥eRNA圖譜，充分展現(xiàn)了癌癥中活性增強(qiáng)子的分布[36]。利用RNA-Seq在全基因組范圍內(nèi)檢測eRNA的表達(dá)，判斷已知增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

3.4 基于基因編輯技術(shù)研究增強(qiáng)子

基因編輯技術(shù)可以在活細(xì)胞內(nèi)對增強(qiáng)子進(jìn)行靶向插入、敲除或修飾，進(jìn)而探究增強(qiáng)子的功能和作用機(jī)制?；蚓庉嫾夹g(shù)主要通過基因工程改造的核酸酶在基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，使DNA雙鏈斷裂，通過同源重組(homologous recombine-tion, HR)或非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)進(jìn)行修復(fù)，從而導(dǎo)致基因的插入、刪除或替換。基因編輯技術(shù)包括ZFN (zinc finger nucleases)技術(shù)、TALEN (transcription activator-like effector nucleases)技術(shù)以及CRISPR (clustered re-gularly interspaced short palindromic repeats)技術(shù)。與CRISPR相比，ZFN操作繁瑣、價格昂貴，而TALEN的基因切割效率較低，因此CRISPR的應(yīng)用更為廣泛[37]。利用CRISPR靶向識別切割基因的特性對增強(qiáng)子的活性進(jìn)行靶向調(diào)控，進(jìn)而研究增強(qiáng)子的功能。研究者基于CRISPR開發(fā)出CRISPR-Cas (CRISPR-associated)系統(tǒng)，融合了向?qū)NA (guide RNA, gRNA)，提高了基因編輯的靶向性和精確度，含有Cas9蛋白的CRISPR-Cas9在基因編輯中使用較為廣泛。在CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基礎(chǔ)上開發(fā)出CRISPR-dCas9 (nuclease-de-ficient cas9, dCas9)系統(tǒng)，dCas9蛋白與效應(yīng)器融合可以特定位點(diǎn)進(jìn)行基因調(diào)控且不損傷DNA[4,38]。下面將分別列舉 CRISPR-Cas9和 CRISPR-dCas9這兩個工具在增強(qiáng)子功能研究中的應(yīng)用。

3.4.1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在增強(qiáng)子研究中的應(yīng)用

目前最常用的基因編輯工具是CRISPR-Cas9，Cas9 核酸內(nèi)切酶與gRNA融合，gRNA可將Cas9蛋白靶向到目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割[4]?；诨蚓庉嫾夹g(shù)構(gòu)建靶向人增強(qiáng)子關(guān)鍵區(qū)的CRISPR-Cas9重組質(zhì)粒，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)增強(qiáng)子序列的定向敲除，便于增強(qiáng)子功能的預(yù)測和深入研究。郭曉龍等[37]人利用該技術(shù)構(gòu)建靶向人增強(qiáng)子的CRISPR- Cas9載體并檢測其基因敲除功能。該實(shí)驗(yàn)室設(shè)計了2個gRNA靶位點(diǎn)，分別靶向人增強(qiáng)子關(guān)鍵區(qū)的上、下游，并對食管癌EC109細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在CRISPR-Cas9重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至食管癌EC109細(xì)胞群48h后，提取細(xì)胞基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和亞克隆測序分析。結(jié)果表明，CRISPR-Cas9重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，在共轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞基因組DNA中檢測到增強(qiáng)子關(guān)鍵區(qū)的缺失，增強(qiáng)子的缺失會抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而為食管癌的治療提供新的靶點(diǎn)(圖2，黑色框所示)。莫文慧等[39]發(fā)現(xiàn)前列腺癌的獨(dú)立風(fēng)險因子位于一個增強(qiáng)子內(nèi)部，并且該增強(qiáng)子與基因存在相互作用。為研究該增強(qiáng)子的功能，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除該增強(qiáng)子，結(jié)果顯示癌細(xì)胞的增殖和遷移能力降低，該增強(qiáng)子的缺失可以抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移(圖2，黑色框所示)。張曉燕等[40]利用CRISPR- Cas9技術(shù)敲除肺癌細(xì)胞中位于基因3?端下游約450 kb的增強(qiáng)子，基因表達(dá)降低，癌細(xì)胞的增殖和遷移能力降低。各種調(diào)控癌基因表達(dá)的增強(qiáng)子成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

圖2 增強(qiáng)子對不同標(biāo)志腫瘤的治療應(yīng)用

癌細(xì)胞的10大標(biāo)志性特征如餅圖所示；針對癌細(xì)胞的某標(biāo)志性特征，與增強(qiáng)子相關(guān)的治療方法分別列舉在外圍的4個方框中。

3.4.2 CRISPR-dCas9系統(tǒng)在增強(qiáng)子研究中的應(yīng)用

CRISPR-dCas9系統(tǒng)是在CRISPR-Cas9的基礎(chǔ)上對Cas9蛋白進(jìn)行改造，使其失去內(nèi)切酶活性，從而成為dCas9蛋白。在gRNA的引導(dǎo)下，dCas9蛋白只結(jié)合到目標(biāo)序列上并不進(jìn)行切割[41]。Qi等[42]利用CRISPR-dCas9系統(tǒng)，將抑制因子或激活因子與dCas9融合，靶向調(diào)控特定增強(qiáng)子的活性，調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的表達(dá)。抑制因子與dCas9融合后可抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，目前最常用的抑制因子是KRAB (kruppel-associated box, KRAB)，KRAB通過組蛋白甲基化和去乙?；揎椪心家种妻D(zhuǎn)錄的輔助因子，抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[41,43]。Gilbert等[4]利用dCas9-KRAB靶向已知的增強(qiáng)子，抑制增強(qiáng)子對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用(圖2，紅色框所示)。dCas9-KRAB可通過靶向增強(qiáng)子來抑制其表達(dá)，而激活因子VP64和P300融合到dCas9中可增加目標(biāo)基因的表達(dá)。Gao等[44]將VP64與dCas9蛋白融合，靶向激活遠(yuǎn)端增強(qiáng)子，增強(qiáng)子被激活表現(xiàn)出增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的功能[44]。徐麗等[45]將P300與dCas9融合，通過組蛋白乙?；瘉碚心即龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，靶向激活增強(qiáng)子的活性。利用CRISPR-dCas9系統(tǒng)靶向增強(qiáng)或抑制增強(qiáng)子進(jìn)而影響靶基因的表達(dá)，該系統(tǒng)常用于已知增強(qiáng)子的功能研究。表1為研究增強(qiáng)子的常用方法描述及其優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)。

表1 增強(qiáng)子預(yù)測和功能解析的常用方法

4 超級增強(qiáng)子的研究方法

超級增強(qiáng)子是由多個具有轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)子串聯(lián)而成，超級增強(qiáng)子的預(yù)測和功能鑒定是在已鑒定出的活性增強(qiáng)子基礎(chǔ)上進(jìn)行的(第3節(jié)為增強(qiáng)子的預(yù)測和功能鑒定方法)。與增強(qiáng)子相比，超級增強(qiáng)子序列結(jié)合更多的轉(zhuǎn)錄因子、輔助轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶Ⅱ，同時也有更高的轉(zhuǎn)錄活性，轉(zhuǎn)錄出更多的eRNA (圖1所示)[17]。結(jié)合超級增強(qiáng)子的上述特征，在增強(qiáng)子基礎(chǔ)上進(jìn)一步鑒定出超級增強(qiáng)子。目前超級增強(qiáng)子的預(yù)測和鑒定是借助ChIP-Seq技術(shù)和RNA-Seq技術(shù)基于轉(zhuǎn)錄因子和輔助轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合特征、組蛋白修飾特征及eRNA的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行的[17]。

與增強(qiáng)子相比，超級增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子和輔助轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合密度更高、組蛋白修飾也更加富集。因此可以借助ChIP-Seq技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)鑒定出與轉(zhuǎn)錄因子或輔助轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或具有特定組蛋白修飾的增強(qiáng)子，再進(jìn)一步根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子和輔助轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合密度或組蛋白修飾的富集程度，篩選和鑒定出超級增強(qiáng)子[13,17,46]。Whyte等[16]利用ChIP-Seq技術(shù)在小鼠胚胎細(xì)胞中檢測出8000多個增強(qiáng)子，發(fā)現(xiàn)其中231增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合密度遠(yuǎn)高于其余增強(qiáng)子，故將這些增強(qiáng)子命名為超級增強(qiáng)子。

此外，與增強(qiáng)子相比，超級增強(qiáng)子序列結(jié)合更多的RNA聚合酶II，因此超級增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄出的eRNA的水平更高。在已知的活性增強(qiáng)子基礎(chǔ)上，利用RNA-Seq技術(shù)檢測活性增強(qiáng)子的eRNA轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而判斷該活性增強(qiáng)是否為超級增強(qiáng)子[17]。

5 增強(qiáng)子的應(yīng)用方向

5.1 增強(qiáng)子在腫瘤診斷治療上的應(yīng)用潛力

腫瘤診斷是腫瘤治療的前提，傳統(tǒng)的癌癥診斷依賴于影像學(xué)檢查或活體組織檢查(活檢)。但是目前影像學(xué)檢查的分辨率需要進(jìn)一步提高；由于腫瘤有很強(qiáng)的異質(zhì)性，活檢組織的代表性越來越受質(zhì)疑[47]。為了實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷，同時提高診斷的特異性和代表性，腫瘤的液體活檢技術(shù)日益興起，如血漿中循環(huán)游離DNA (circulating free DNA, cfDNA)的檢測[31,48]。通過測序分析cfDNA中的增強(qiáng)子，根據(jù)增強(qiáng)子的腫瘤特異性診斷出癌基因的來源，腫瘤的早期診斷為腫瘤治療提供了更大的成功率[48~50]。

癌細(xì)胞內(nèi)的增強(qiáng)子通過與啟動子相互作用促進(jìn)癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，增強(qiáng)子的活性可以影響相關(guān)癌基因的表達(dá)。研究表明，免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。在肺癌和黑色素瘤中，PD-1/PD-L1通路的激活在腫瘤免疫逃逸過程中起著關(guān)鍵作用，T細(xì)胞表面的PD-1 (programmed cell death-1，程序性死亡受體-1)與腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1 (programmed cell death 1 ligand 1，程序性死亡配體1)結(jié)合后傳遞抑制性信號，T細(xì)胞的增殖和活化受到阻礙，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。抑制腫瘤細(xì)胞的表達(dá)有利于進(jìn)一步阻斷PD-1/PD-L1信號通路的活化，使免疫治療效果得以改善，因此，成為了免疫治療的主要靶點(diǎn)[51]。Chen等[35]利用TCGA的RNA-Seq數(shù)據(jù)對多種腫瘤樣本分析發(fā)現(xiàn)，mRNA水平與下游140 kb的增強(qiáng)子有很強(qiáng)的共表達(dá)關(guān)系。通過對Hi-C數(shù)據(jù)的再分析，進(jìn)一步證實(shí)了增強(qiáng)子直接結(jié)合到的下游。ChIP-Seq數(shù)據(jù)顯示NF-κB結(jié)合在該增強(qiáng)子以及啟動子的p65結(jié)合基序上，表明NF-κB參與增強(qiáng)子與的相互作用。利用CRISPR- Cas9技術(shù)敲除此增強(qiáng)子后，在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著降低，并且很大程度上抑制了NF-κB對表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)，癌細(xì)胞免疫逃逸得到有效抑制(圖2，紫色框所示)。這是一個增強(qiáng)子–啟動子相互作用的模型，表明增強(qiáng)子還可作為預(yù)測癌癥治療反應(yīng)的標(biāo)志物。

c-Myb是造血過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，在造血祖細(xì)胞中表達(dá)量很高，但隨著細(xì)胞分化，表達(dá)量會逐漸降低甚至不表達(dá)。的異常表達(dá)會引發(fā)各種癌癥，如白血病，乳腺癌，結(jié)腸癌。為研究基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，陳連香等[52]使用4C技術(shù)在人的白血病細(xì)胞系K562中發(fā)現(xiàn)，在基因的上游有兩個遠(yuǎn)端增強(qiáng)子與啟動子互作較強(qiáng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證增強(qiáng)子的功能，利用dCas9-P300靶向激活增強(qiáng)子，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)增強(qiáng)，在一定程度上降低了k562細(xì)胞的分化，通過驗(yàn)證兩個上游增強(qiáng)子對的影響從而為白血病的治療提拱了一個新的突破點(diǎn)(圖2，綠色框所示)[52]。此外，還有一些增強(qiáng)子用于腫瘤特異性治療研究，如在結(jié)腸癌細(xì)胞中敲除位于基因上游335 kb處的腫瘤特異性增強(qiáng)子，癌細(xì)胞的生長和增殖受到抑制，而對正常腸道細(xì)胞沒有任何影響[53]；在急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)的癌細(xì)胞中敲除位于(T-cell acute lymphocytic leukemia 1)基因上游8 kb處的癌癥特異性增強(qiáng)子的缺失，導(dǎo)致基因沉默進(jìn)而癌細(xì)胞存活率降低[54]等。增強(qiáng)子的敲除可以使用CRISPR-Cas9技術(shù)，對增強(qiáng)子的抑制不僅可以使用CRISPR-dCas9技術(shù)，還可以利用化合物干擾轉(zhuǎn)錄因子與增強(qiáng)子的結(jié)合，進(jìn)而達(dá)到抑制增強(qiáng)子的目的，如通過構(gòu)建(hepatitis B virus)人工轉(zhuǎn)錄因子靶向抑制增強(qiáng)子活性[55]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，癌基因的高倍數(shù)擴(kuò)增多發(fā)生于大規(guī)模DNA重組，在重組過程中發(fā)生的調(diào)控元件位置變化與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。這類重組包括了一種以染色體外環(huán)狀DNA (extrachromo-somal circular DNA, eccDNA)形式存在的特殊擴(kuò)增體[56,57]。近年來研究表明，eccDNA幾乎不存在于正常細(xì)胞中，而存在于近一半的人類癌癥細(xì)胞中，且其富集處癌基因擴(kuò)增明顯，表明了這類DNA對于腫瘤細(xì)胞進(jìn)化可能存在的重要意義[58]。2019年Mischel等[59]研究發(fā)現(xiàn)，在人類腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的大量eccDNA，eccDNA內(nèi)癌基因與增強(qiáng)子空間位置的變化，改變了癌基因的表達(dá)方式，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞的侵襲性，并在腫瘤快速進(jìn)化和抵御威脅的能力(如化療、放療和其他治療)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[59]。同年，Morton等[60]發(fā)現(xiàn)癌基因及其鄰近增強(qiáng)子通過eccDNA的形式進(jìn)行擴(kuò)增從而增強(qiáng)已有聯(lián)系或建立新的聯(lián)系、促進(jìn)癌癥發(fā)展的全新分子機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)在非擴(kuò)增的腫瘤細(xì)胞中，啟動子僅與其上游的兩個染色體內(nèi)增強(qiáng)子具有顯著聯(lián)系；而在擴(kuò)增的腫瘤細(xì)胞中，啟動子盡管仍保持了與其上游兩個增強(qiáng)子的聯(lián)系，但同時也獲得了大量新的互作對象。包括兩個上游鄰近增強(qiáng)子在內(nèi)的多個于擴(kuò)增后新獲得的互作增強(qiáng)子都具有對擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞活性很強(qiáng)的正向效應(yīng)。該研究表明增強(qiáng)子在由癌基因環(huán)化擴(kuò)增介導(dǎo)的促癌效應(yīng)中所發(fā)揮的重要作用，展現(xiàn)了超越通常規(guī)定的基因邊界的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。環(huán)狀染色體外DNA上增強(qiáng)子新的互作模式為癌基因的高倍數(shù)擴(kuò)增提供了依據(jù)，也為腫瘤的有效抑制提供新的方向。

Hanahan等[61]總結(jié)了目前癌細(xì)胞的十大標(biāo)志性特征，如持續(xù)不斷的增殖信號、逃避生長抑制因子、逃避免疫破壞，遺傳信息的持續(xù)復(fù)制、促進(jìn)新血管生成、基因組的不穩(wěn)定性、抵抗細(xì)胞死亡、激活入侵和轉(zhuǎn)移等。針對部分癌細(xì)胞的標(biāo)志性特征，已有增強(qiáng)子相關(guān)的對應(yīng)治療方法(圖2)。

5.2 eRNA在腫瘤診斷治療上的應(yīng)用潛力

eRNA在調(diào)控多種腫瘤信號通路中起著重要作用，介導(dǎo)靶基因的激活，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。-eRNA (kallikrein related peptidase 3,)是人類前列腺癌激肽釋放酶3 ()的增強(qiáng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄生成的，抑制-eRNA的合成可下調(diào)基因的表達(dá)，降低前列腺癌細(xì)胞增殖速率(圖2，綠色框所示)[62]。因此，可通過分析腫瘤相關(guān)eRNAs來評價腫瘤的治療效果。

2019年，Zhang等[36]鑒定了9108種人類癌癥中可檢測到的eRNAs，并將這些可檢測的eRNAs分為3組：652個普遍存在的eRNAs(在10種以上的癌癥類型中表達(dá))；3124個中間特異性eRNAs (在2~9種癌癥類型中表達(dá))；5332個癌癥特異性eRNAs (只在一種癌癥類型中表達(dá))。表明大量eRNAs可能在特定的特異性癌癥類型中具有生物標(biāo)記作用。研究者通過分析癌細(xì)胞系的eRNAs表達(dá)水平與抗癌藥物敏感性之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)無論是在直接目標(biāo)通路內(nèi)還是間接交叉通路，eRNAs和抗癌藥物之間都有很強(qiáng)的相關(guān)性[36]。

5.3 超級增強(qiáng)子在腫瘤研究中的進(jìn)展

5.3.1 超級增強(qiáng)子與腫瘤的關(guān)系

近年研究發(fā)現(xiàn)，超級增強(qiáng)子所驅(qū)動的異?；蜣D(zhuǎn)錄對維持腫瘤細(xì)胞特性至關(guān)重要。2013年美國懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所Richard A. Young實(shí)驗(yàn)室首次在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了超級增強(qiáng)子通過調(diào)控和等基因，促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展[63]。研究發(fā)現(xiàn)，超級增強(qiáng)子通過促進(jìn)mRNA的生成、microRNA (miRNA)的轉(zhuǎn)錄以及成熟和lncRNA (long non-coding RNA)的轉(zhuǎn)錄生成對靶基因?qū)崿F(xiàn)調(diào)控[9]。2018年Jiang等[64]在食道鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了主要轉(zhuǎn)錄因子TP63和SOX2，通過激活超級增強(qiáng)子和啟動子協(xié)同調(diào)控長鏈非編碼RNA CCAT1的表達(dá)，CCAT1促進(jìn)細(xì)胞的增殖，或基因的過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生，CCAT1與TP63和SOX2形成復(fù)合物，通過與的超級增強(qiáng)子結(jié)合調(diào)控表達(dá)，激活下游信號通路，從而促進(jìn)食道鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生。同年，Peng等[65]在肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種超級增強(qiáng)子驅(qū)動的長鏈非編碼RNA HCCL5，可促進(jìn)HCC細(xì)胞的存活、遷移和侵襲，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

與增強(qiáng)子相比，大多數(shù)致癌基因的表達(dá)異常是由超級增強(qiáng)子驅(qū)動的，癌細(xì)胞通過構(gòu)建驅(qū)動致癌基因過表達(dá)的超級增強(qiáng)子，顯著促進(jìn)多種癌基因表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力；抑制超級增強(qiáng)子的活性，則顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長和存活[17,66]。目前已在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中鑒定出處于異常激活狀態(tài)的超級增強(qiáng)子，如發(fā)病率較高的乳腺癌、結(jié)腸癌、小細(xì)胞肺癌、T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病等[13]。研究并揭示腫瘤細(xì)胞中處于異常激活狀態(tài)的超級增強(qiáng)子的構(gòu)建機(jī)制和激活路徑，為基因水平上抑制癌基因的過表達(dá)提供了新的思路，進(jìn)一步改善腫瘤的臨床治療效果。

5.3.2 超級增強(qiáng)子在腫瘤治療中的應(yīng)用潛力

在超級增強(qiáng)子驅(qū)動致癌基因表達(dá)而導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞中，因超級增強(qiáng)子區(qū)域過大(平均在20 kb以上)不易敲除，為了精確抑制癌基因的表達(dá)，需要抑制超級增強(qiáng)子對癌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[49,67]。超級增強(qiáng)子調(diào)控癌基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)可作為靶點(diǎn)特異性地抑制癌基因表達(dá)[13]。

超級增強(qiáng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)有：Me-diator復(fù)合體、BRD4 (bromodomain containing 4)和關(guān)鍵的CDK (cyclin-dependent kinase)，這些關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)基因表達(dá)水平降低均會抑制超級增強(qiáng)子調(diào)控的相關(guān)基因表達(dá)，因此，通過靶向關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)可以影響超級增強(qiáng)子調(diào)控的癌基因轉(zhuǎn)錄[13]。2016年Jiang等[46]發(fā)現(xiàn)了一種治療食管鱗狀細(xì)胞癌的特異性CDK7抑制劑THZ1，可抑制多種致癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。目前通過靶向抑制上述關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)而針對超級增強(qiáng)子的治療藥物主要有：(1)BRD家族蛋白抑制劑或降解劑如：針對BRD4治療多發(fā)性骨髓瘤的抑制劑JQ1；針對BDR4治療白血病的抑制劑 iBET151；針對BRD2、BRD3、BRD4治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤的抑制劑OTX051等。(2)CDK7抑制劑如：針對CDK7治療食管鱗狀細(xì)胞癌的抑制劑THZ1；針對CDK7治療成人晚期實(shí)體瘤的抑制劑SY-1365等。(3)其他類型抑制劑如：針對RARα (retinoic acid receptor alpha, RARα)治療急性髓樣細(xì)胞樣白血病的抑制劑SY-1425等[13]。

6 結(jié)語與展望

增強(qiáng)子在人類的生命過程中扮演著十分重要的角色，了解和研究增強(qiáng)子有助于精細(xì)解讀人類基因組的功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分化以及個體發(fā)育的機(jī)制。隨著基因組水平鑒定技術(shù)的成熟和高通量測序技術(shù)的不斷完善以及第三代測序技術(shù)的應(yīng)用，增強(qiáng)子的定位、功能、鑒定會有較大突破，為腫瘤治療提供新的有效的靶點(diǎn)。

多個具有轉(zhuǎn)錄活性且作用方向相關(guān)的增強(qiáng)子構(gòu)成超級增強(qiáng)子。研究顯示，在多種腫瘤細(xì)胞中超級增強(qiáng)子處于激活狀態(tài)，對癌基因的表達(dá)有促進(jìn)作用。目前對超級增強(qiáng)子的組成、超級增強(qiáng)子內(nèi)部每個增強(qiáng)子的活性以及超級增強(qiáng)子內(nèi)部多個增強(qiáng)子的協(xié)作機(jī)制知之甚少。為了更好地治療腫瘤，人們需要探索超級增強(qiáng)子內(nèi)各個組分的作用機(jī)制，探索怎樣利用藥物同時抑制超級增強(qiáng)子內(nèi)的多個增強(qiáng)子活性，從而抑制癌基因的表達(dá)。

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The identification of enhancers and its application in cancer studies

Qian Liu1, Chunyan Li1,2

Enhancers are a type of-acting DNA elements that enhance transcriptional activity of target genes. However, the uncertainty in the orientation and distance between enhancers and target genes could post significant difficulties in identifying the target genes and the regulatory mechanisms of the enhancers. Numerous studies have shown that the mutations and/or abnormalities in the functions of enhancers are associated with development of diseases. A few studies have reported that enhancers could activate cancer development or drug resistance by promoting the expression of target genes. At present, enhancers involved in carcinogenesis and drug resistance have not been fully identified, and the underlying mechanism are still largely unknown. This paper summarizes the main methods used in identifying and characterizing enhancers and analyzing the regulatory mechanism at the genome-wide level. It further reviews the recent research progress of enhancers in cancer diagnosis, treatment, and the underlying mechanism during carcinogenesis, thereby providing a reference for the screening of these enhancers involved in carcinogenesis and drug resistance and exploring their regulatory mechanisms of target genes. It also provides a new perspective for improving the diagnosis of cancer and insights for formulating cancer therapeutic strategies.

enhancer; super enhancer; identification; cancer

2020-04-09;

2020-07-23

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(編號：31801094)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31801094)]

劉倩，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物醫(yī)學(xué)工程。E-mail: ZY1910219@buaa.edu.cn

李春燕，博士，特聘副研究員，研究方向：腫瘤基因組學(xué)。E-mail: lichunyan@buaa.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-097

2020/8/6 11:48:29

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200804.1614.002.html

(責(zé)任編委: 孫玉潔)