楊偉 范長江 張維元 凌洋 李培峰

[摘要] 目的 運用轉錄組測序（RNA-seq）和染色質開放性測序技術（ATAC-seq），探討心肌肥大發(fā)生后基因差異表達以及特征基因開放性。方法 將12只小鼠隨機分為心肌肥大組和對照組（各6只），分別腹腔注射血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和生理鹽水。應用超聲和免疫組化方法檢測心肌肥大和纖維化程度，RNA-seq、實時熒光定量PCR（qPCR）方法檢測并驗證基因的表達，ATAC-seq方法檢測染色質開放性。結果 與對照組比較，心肌肥大組心肌發(fā)生肥大和纖維化。高通量測序技術獲得與心肌功能相關的差異表達基因，qPCR檢測顯示marker基因的表達量和染色質開放水平均較對照組增高。結論 心肌肥大后，基因的轉錄表達和染色質開放性皆發(fā)生變化，尤其是marker基因。

[關鍵詞] 心臟擴大;血管緊張素Ⅱ;染色質開放性測序;轉錄組測序

[中圖分類號] R541

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）01-0001-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.029

心肌肥大是提高心肌儲備能力和心排血量的一種適應性代償性反應，病理性心肌肥大與許多心臟疾病如高血壓、冠心病等具有共同的病理過程，不可逆轉，嚴重危害人類健康[1-2]。目前，心肌肥大的研究涉及蛋白修飾、DNA修飾和RNA修飾等方面，但尚不夠全面[3-6]，其在轉錄調控方面的研究還處于起始階段。染色質開放性測序技術（ATAC-seq）是一種在全基因組范圍內研究轉錄調控的利器[7]，已被廣泛應用于研究小鼠視覺皮質[8]、心肌梗死[9]、腫瘤[10]以及免疫系統(tǒng)[11]中關鍵的轉錄調控因子以及新的調控機制。本研究使用血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）構建心肌肥大模型，應用轉錄組測序（RNA-seq）和ATAC-seq兩種高通量測序方法，探討全基因組內的基因差異表達以及部分特征基因順式調控元件區(qū)域的染色質可及性，從兩個不同層次水平上提供心肌肥大發(fā)生后的數據，以揭示影響特征基因差異表達的潛在因素，加深對驅動心肌肥大的分子變化的認識，為后期揭示心肌肥大基因差異表達的潛在調控機制以及更深層次信號通路和分子水平方面的研究提供數據支持?，F將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 動物分組及處理

SPF級8周雄性C57BL/6小鼠12只，購自青島大任富城畜牧有限公司。小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組和心肌肥大組，每組6只，分別腹腔注射生理鹽水100 μL和AngⅡ（購自EMD Millipore公司，用生理鹽水溶解，0.6 mg/（kg·d））100 μL。

1.2 超聲心動圖檢查

腹腔注射2周后，對小鼠進行超聲檢測，檢測指標包括室間隔舒張末厚度（IVSd）、左室舒張末期內徑（LVIDd）、舒張末左室后壁厚度（LVPWd）、室間隔收縮末厚度（IVSs）、左心室收縮期內徑（LVIDs）、收縮末左室后壁厚度（LVPWs）、射血分數（EF）、縮短分數（FS）和心率（HR）等。

1.3 心肌細胞的大小及纖維化程度檢測

采用免疫組化方法。超聲檢查完成后，腹腔注射適量的水合氯醛（40 g/L）麻醉，斷頸處死小鼠，隨后用剪刀剪開小鼠胸腔，取出心臟，使用40 g/L多聚甲醛固定，然后分別行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色檢測心肌細胞的大小及纖維化程度。

1.4 RNA-seq檢測基因表達

取心肌組織，按照Trizol（購自Takara公司）說明書提取總RNA，用NanoDrop ND-1000型分光光度儀進行質量檢測，然后送華大基因應用RNA-seq方法檢測基因表達情況。

1.5 差異表達基因的篩選與分析方法

根據測序所獲得的基因表達變化量的log2值進行篩選，最后用DAVID網站進行GO功能分析和KEGG通路分析。

1.6 染色質開放性檢測

制備細胞核懸液，然后依次進行轉座、純化和DNA文庫擴增，最后送華大基因應用ATAC-seq檢測染色質開放性。

1.7 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測

采用qPCR檢測基因的表達量，使用逆轉錄試劑盒（購自Takara公司）將RNA逆轉錄為cDNA，然后應用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行qPCR，并用 2-△△Ct評估基因的相對表達量。實驗重復3次，取均值。

1.8 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料結果以x2±s表示，數據間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組超聲心動圖比較

與對照組比較，心肌肥大組小鼠的LVIDd、EF和FS均顯著下降，LVPWd和LVPWs均顯著升高，差異有顯著性（t=-5.616～8.750，P<0.05）;兩組IVSd、IVSs、LVIDs和HR比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1和圖1。表明心肌肥大模型建立成功。

2.2 兩組HE染色結果比較

對照組心肌細胞為橢圓形，排列整齊，細胞核大小均一，心肌纖維排列整齊（圖2A）。心肌肥大組心肌細胞肥大，心肌纖維出現不同程度增生，排列紊亂（圖2B）。

2.3 兩組Masson染色結果比較

Masson染色心肌細胞為紅色，膠原為藍色。對照組心肌細胞間隙沒有膠原增生（圖2C）。心肌肥大組心肌細胞間質纖維化并有膠原堆積（圖2D）。進一步證明心肌肥大模型建立成功。

2.4 基因差異表達情況

應用生物信息學工具對基因進行GO 生物學進程分析和 KEGG通路分析（圖3A、B、C）。結果表明，GO生物學進程分析主要富集到炎癥反應、免疫反應、血管生成、心肌收縮和鈣穩(wěn)態(tài)等生物學功能;KEGG通路分析主要富集到PI3K-Akt 通路、心肌肥大、鈣離子信號通路、Rap1通路、cAMP通路、Ras通路、Foxo通路、AMPK通路、cGMP-PKG通路和MAPK通路等。篩選出27個與心肌肥大相關的基因（圖3D），其中8個基因表達下調，分別為α肌球蛋白重鏈（myh6）、Foxp1、Sirt3、Sirt2、Ppargc1a、Ppargc1b、心肌肌漿網 Ca2+-ATP 酶 2a（Atp2a2）、Trim63;19個表達上調，分別為心房鈉尿肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）、α骨骼肌肌動蛋白（Acta1）、β-肌球蛋白重鏈（myh7）、Col3a1、Col1a1、CYP1B1、Fn1、Il18、CD36、Timp1、Tgfbr1、PDE1C、PDE1A、Sirt1、Sirt4、Pfkp、CDK1和Fbln2。 篩選出23個與心肌疾病相關的基因（圖3E），其中13個表達下調，分別為DSP、Timp3、Sgcb、Hfe、Ldb3、Fktn、Apln、Fkrp、Prkce、Sgca、Pdgfa、Prkaa2、Gja1;10個表達上調，分別為Mapk8、Rtn4、Dcn、Myot、Ptk2b、Ppbp、Xdh、Tnfrsf1b、Ctnnb1、Cxadr。

2.5 染色質開放性情況

開放結構主要位于基因間區(qū)域，其次是內含子區(qū)域;基因的外顯子、啟動子和轉錄起始位點區(qū)域的peak占比相同（圖3F）。心肌肥大后，基因間區(qū)域的peak在總體中占比有所下降，而內含子、外顯子、啟動子和轉錄起始位點區(qū)域的peak占比有所增加。通過IGV軟件可視化分析部分肥大基因相應區(qū)域，結果表明心肌肥大后，ATAC-seq信號在NPPA、NPPB和Acta1轉錄起始位點附近區(qū)域有所增強;此外，在肥大發(fā)生之前這些基因就存在一定的開放性（圖3G）。

2.6 兩組marker基因比較

qPCR檢測結果顯示，心肌肥大組marker基因ANP、BNP、β-MHC和Acta1表達較對照組顯著升高，差異有顯著性（t=4.685～7.124，P<0.05）。見圖4。說明心肌發(fā)生了明顯肥大。

3 討 論

心肌肥大是心臟為了應對內、外部生物學應力刺激而做出的應激反應，嚴重危害人類健康[1]。心肌肥大主要特點是心室壁變厚，心肌細胞體積變大，并伴有心肌功能障礙和纖維化。本研究超聲檢測和免疫組化結果均說明本研究制備的心肌肥大模型特征與其一致。

本研究差異表達基因的GO功能和 KEGG通路分析得到的心肌肥大相關通路與NAKAMURA等[12]研究結果相同。心肌肥大發(fā)生后，與心肌肥大相關的基因隨之發(fā)生差異表達，其中，marker基因ANP、BNP、Acta1、myh7等的表達升高，而myh6的表達下降，進一步證明心肌肥大模型構建成功。在心肌肥大相關的基因中，Col3a1、Col1a1、Fn1、Il18、Timp1和Tgfbr1與心肌纖維化和膠原生成相關，其表達升高說明心肌發(fā)生纖維化，這與相關研究結果一致[3-6，13-16]。另有研究表明，PDE1既參與心臟病理性重塑和纖維化，又與鈣調蛋白相互作用，通過PKG通路調控心肌肥大[3]。Fbln2與TGFβ共同調控TAK1發(fā)生磷酸化，繼而激活P38/JNK、CaN-NFAT和NF-kB信號通路，促進心肌肥大[17]。Foxp1參與心臟重塑、心肌纖維化、成肌纖維細胞形成、細胞外基質蛋白生成和心肌肥大[18]，這些研究所涉及的心肌肥大相關基因在本研究中也呈現出相同的表達結果。此外，在心肌肥大相關基因中，一些基因涉及心肌功能、代謝功能和心律失常，如Sirt1、Sirt2、Sirt3和Sirt4等與線粒體能量代謝密切相關。有研究表明，心肌肥大后去乙?；傅某志眯允Щ顣е戮€粒體蛋白高度乙酰化和能量代謝紊亂，Sirt3引發(fā)線粒體相關蛋白高度乙酰化，導致心肌肥大和纖維化[12]。而CYP1B1、 Ppargc1a和Ppargc1與心肌肥大的代謝重編程相關，CD36和Atp2a2能導致心律失常和心功能障礙，Trim63、Pfkp和CDK1參與調控心肌肥大[19-23]。

另外，本文研究在差異表達的基因中還獲得一些與心肌疾病相關的基因，其中Tnfrsf1b和Prkce與代謝疾病相關[21]，Myot 和Ldb3與肌原纖維性心肌病相關[24]，Fktn和Fkrp與肌營養(yǎng)不良相關的心肌病相關 [25]，Ppbp是潛在的冠心病標志物[26]，Hfe參與血色素沉著癥誘發(fā)的心肌病[27]，Prkaa2在進展性心肌病中發(fā)揮作用[21]，Timp3參與鐵超負荷介導的心肌病[28]。除此以外，本研究在差異表達的基因中，還獲得一些涉及心臟功能的基因，其中Ptk2b、Pdgfa、Dcn和Apln調控心臟纖維化[29-32]，CXADR和DSP介導心律失常 [33-34]，而Mapk8 和

Ct-nnb1分別是腎素-血管緊張素通路和Wnt通路的核心參與者[21，35]，Rtn4調節(jié)血管生成[36]，Gja1和Xdh與線粒體功能相關[28，37]，Sgca和Sgcb是肌糖復合物形成的必要成分[21]?；虿町惐磉_分析表明，AngⅡ在誘導心肌肥大的過程中，除了能導致心肌肥大以外，還可能導致與心肌疾病和心肌功能相關基因發(fā)生差異表達。

本文研究分析ATAC-seq信號在不同順式調控元件區(qū)域上的分布，結果顯示，心肌肥大組中啟動子和轉錄起始位點區(qū)域的peak所占比例較對照組有所增加，這與其參與調控基因表達的功能密切相關。通過對心肌肥大marker基因相應區(qū)域分析顯示，心肌肥大后，在NPPA、NPPB和Acta1轉錄起始位點附近區(qū)域的染色質開放性有所增強，這可能為它們表達升高的原因。

綜上所述，本文應用RNA-seq和ATAC-seq兩種高通量測序技術，研究心肌肥大后基因表達以及特征基因的染色質開放性。結果顯示，心肌肥大后，與心肌肥大和心肌疾病相關的基因表達具有明顯的差異，心肌肥大特征基因（如ANP、BNP、Acta1）在染色質開放水平上明顯提高，揭示了導致心肌肥大特征基因表達升高的潛在因素。本文在兩個不同層次水平上檢測了心肌肥大發(fā)生后的數據，為后期更深層次地研究心肌肥大相關基因轉錄調控機制，以及更詳細地了解驅動心肌細胞肥大的分子變化提供了數據支持，更為開發(fā)逆轉心肌肥大病理性重塑的治療方法提供了參考。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

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