陳德勝，張 晨，劉子歌，宋國(guó)瑞，郭鳳英，李 燕

（1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，銀川 750002；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)作為關(guān)節(jié)終末期疾病和老年股骨頸骨折的有效治療手段，明顯提高了患者的生活質(zhì)量[1-2]。在術(shù)后15～20年，10%～15%的患者因各種因素造成無(wú)菌性松動(dòng)，最終導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)失效，需采取人工關(guān)節(jié)返修術(shù)。人工關(guān)節(jié)產(chǎn)生的磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解是引起人工假體松動(dòng)的首要原因，直接影響人工假體的使用壽命。有研究[3-4]證實(shí)，磨損顆粒在關(guān)節(jié)間隙大量積聚。界膜巨噬細(xì)胞被磨損顆粒激活后釋放了大量強(qiáng)效溶骨細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）等。這些細(xì)胞因子主要通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成與活化，并刺激巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞引起鄰近骨質(zhì)吸收、骨重建紊亂。

隨著人們對(duì)人工假體周圍骨溶解發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步了解，使得藥物預(yù)防人工假體周圍骨溶解成為可能。近期研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，p38MAPK不僅參與骨重建的調(diào)節(jié)，還與炎性反應(yīng)有關(guān)。本文以小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，以鈦（Ti）顆粒為研究因素，以p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為作用靶點(diǎn)，探討p38MAPK選擇性抑制劑SB203580在無(wú)菌性松動(dòng)中的潛在治療和預(yù)防價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

磨損顆粒選用Ti顆粒，購(gòu)自Alfa Aesar公司（Ward Hill，MA），要求顆粒直徑＜20 μm。小鼠RAW巨噬細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司，四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）和酶聯(lián)免疫法（ELISA）試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磨損顆粒的內(nèi)毒素去除處理并檢測(cè) 在干燥箱內(nèi)180℃將Ti顆粒焙烤6 h，浸泡于70%乙醇，然后以2 000 r·min-1速度離心15 min，沉淀出Ti顆粒。多次循環(huán)操作，再加入PBS洗滌、離心、干燥，通過紫外線持續(xù)照射，消毒處理顆粒，加入無(wú)菌PBS，制成濃度為300 mg·mL-1的Ti顆粒懸液，4℃保存?zhèn)溆?。Ti顆粒懸液加入內(nèi)毒素檢測(cè)試劑，全部標(biāo)本恢復(fù)到室溫，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度測(cè)量結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算每個(gè)樣品內(nèi)毒素含量。Ti顆粒去除內(nèi)毒素處理。

1.2.2 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系復(fù)蘇與培養(yǎng) 從醫(yī)用液氮罐中取出小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株冷凍管放入38℃水浴中，持續(xù)搖動(dòng)，加入培養(yǎng)基6 mL，離心機(jī)中離心后去除上清液。沉淀加入2 mL培養(yǎng)基（由10%的小牛血清、青霉素100 U·mL-1、鏈霉素100 μg·mL-1添加的DMEM）懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)入小鼠RAW264.7巨噬培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞分組與處理 將選用的Ti顆粒（0.1 mg·mL-1）、p38MAPK抑制劑（SB203580，120 nmol·L-1為最適宜濃度）、RANKL（50 ng·mL-1）和脂多糖（LPS 2 mg·mL-1）作為作用物。A組:單純細(xì)胞培養(yǎng)組；B組:細(xì)胞+Ti顆粒培養(yǎng)組；C組:細(xì)胞+RANKL培養(yǎng)組；D組:細(xì)胞+Ti顆粒＋RANKL培養(yǎng)組；E組:細(xì)胞+Ti顆粒＋RANKL＋SB203580培養(yǎng)組。分組培養(yǎng)6 d，每3 d換液1次（加RANKL時(shí)，先加入RANKL與細(xì)胞共同培養(yǎng)2 h后再加入其他作用物）。

1.2.4 抗酒石酸酸性染色（TRAP）檢測(cè)SB203580對(duì)Ti顆粒刺激RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響 將各組細(xì)胞接種于6孔板中，1×104/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，去除培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，選用無(wú)菌PBS洗滌，用檸檬酸鹽/丙酮溶液固定30 s，在TRAP染液（萘酚ASBI磷酸鹽作為底物）中37℃孵育1 h。蒸餾水洗滌3次，蘇木素復(fù)染2 min，干燥后二甲苯透明，DPX（聚苯乙烯+酞酸二丁酯+二甲苯）封固。選用倒置電子顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)TRAP陽(yáng)性細(xì)胞，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 MTT比色法檢測(cè)SB203580對(duì)Ti顆粒刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的影響 將貼壁小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞制成懸浮細(xì)胞放置于DMEM的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)皿中鋪板，每孔1 mL（2×105個(gè)細(xì)胞/孔），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。各加入0、60、120、240 nmol·L-1的SB203580，每組設(shè)定為6個(gè)復(fù)孔。按照上述條件進(jìn)行分組培養(yǎng)24、48和72 h。移液槍吸取后棄去每孔中培養(yǎng)液，加入含10%MTT（5 mg·mL-1）的DMEM培養(yǎng)液（不含小牛血清），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移液槍吸取棄去細(xì)胞上清液，每孔加入二甲亞砜（DMSO）150 μL振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm的吸光度，制圖表并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 ELISA檢測(cè)SB203580對(duì)Ti顆粒刺激RAW 264.7細(xì)胞分泌TNF-α、MMP-9細(xì)胞因子的影響 設(shè)定LPS為陽(yáng)性對(duì)照組，將貼壁小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞制成懸浮細(xì)胞于DMEM的培養(yǎng)液中，在96孔培養(yǎng)皿中鋪板，每孔1 mL（2×105個(gè)細(xì)胞/孔），37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分為巨噬細(xì)胞+不同濃度（0、0.25、0.50、1.00 mg·mL-1）Ti顆粒組、巨噬細(xì)胞+不同濃度（0、0.25、0.50、1.00 mg·mL-1）Ti顆 粒+120 nmol·L-1SB203580組，其中將巨噬細(xì)胞+0 mg·mL-1Ti顆粒設(shè)為單純細(xì)胞對(duì)照組。每組設(shè)定為6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各孔培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，采用ELISA法檢測(cè)TNF-α和MMP-9的含量。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)SB203580對(duì)Ti顆粒刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、MMP-9的mRNA表達(dá)情況 總RNA快速提取試劑盒提取小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞、Ti顆粒（1 mg·mL-1）刺激的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞及p38信號(hào)通路抑制劑SB203580（120 nmol·L-1）和Ti顆粒（1 mg·mL-1）刺激下小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞中的總RNA。將細(xì)胞預(yù)處理、混勻、洗脫，獲取總RNA。按照Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，進(jìn)行TNF-α及MMP-9的PCR擴(kuò)增，采用2×Taq PCR MasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，見表1。

表1 運(yùn)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物

Real-Time PCR反應(yīng)按照SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。Real-Time PCR結(jié)果分析應(yīng)用IQ5快速實(shí)時(shí)定量PCR軟件系統(tǒng)，按照設(shè)定的閾值，從擴(kuò)增曲線中直接獲得循環(huán)閾值（Ct），并對(duì)Ct值進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA）。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAP染色法檢測(cè)SB203580對(duì)Ti顆粒刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響

經(jīng)TRAP染色可見，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿大多數(shù)呈紫紅色，小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞周圍有許多細(xì)長(zhǎng)的偽足樣突起，細(xì)胞胞核數(shù)目比較多，細(xì)胞內(nèi)可見到大量的胞漿，細(xì)胞胞漿內(nèi)含空泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞胞核大、核仁清晰。TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨著Ti顆粒濃度（0.25、0.50、1.00 mg·mL-1）增高而相應(yīng)增多，加入抑制劑SB203580后，TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。TRAP染色結(jié)果證實(shí)通過RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)，加入Ti顆粒后進(jìn)一步培養(yǎng)的TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞為破骨細(xì)胞，抑制劑SB203580能夠抑制小鼠鈦顆粒誘導(dǎo)下RAW264.7巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞增殖、成熟和活化（圖1）。

圖1 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果（TRAP×40）

2.2 MTT比色法檢測(cè)SB203580對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的影響

在24、48和72 h時(shí)，0 nmol·L-1與60、120、240 nmol·L-1p38MAPK特異性抑制劑SB203580對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見圖2。說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)所使用的p38MAPK抑制劑SB203580濃度范圍內(nèi)并未影響小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的正常增殖。

圖2 不同濃度SB203580對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.3 ELISA法檢測(cè)SB203580對(duì)Ti顆粒刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、MMP-9細(xì)胞因子表達(dá)的影響

在Ti顆粒作用下，對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性因子含量隨Ti顆粒濃度（0.25、0.50、1.00 mg·mL-1）的增高而增加，TNF-α分別為（254.31±7.49）pg·mL-1、（597.88±15.31）pg·mL-1、（873.85±36.28）pg·mL-1，加入120 nmol·mL-1SB203580后，TNF-α水平［（137.22±5.45）pg·mL-1、（271.35±4.98）pg·mL-1、（341.65±17.16）pg·mL-1］降低（P均＜0.05），見圖3。

圖3 ELISA法檢測(cè)上清液中TNF-α含量

Ti顆粒濃度為0.25、0.50、1.00 mg·mL-1時(shí)，MMP-9分別為（194.23±6.02）pg·mL-1、（482.13±10.09）pg·mL-1、（654.11±11.53）pg·mL-1，當(dāng)加入120 nmol·mL-1SB203580后，MMP-9水平［（102.73±15.27）pg·mL-1、（223.79±5.06）pg·mL-1、（275.41±6.72）pg·mL-1］降低（P均＜0.05），見圖4。

圖4 ELISA法檢測(cè)上清液中MMP-9含量

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)SB203580對(duì)Ti顆粒刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α、MMP-9的mRNA表達(dá)情況

結(jié)果表明，12、24、48和96 h時(shí)，Ti顆粒刺激下小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9和TNF-α的mRNA表達(dá)較control組增加，SB203580-p38的MAPK抑制劑能降低Ti顆粒刺激下小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9和TNF-α的mRNA表達(dá)（P均＜0.05），見圖5、圖6。說(shuō)明p38MAPK特異性抑制劑SB203580對(duì)磨損顆粒刺激小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的MMP-9和TNF-α的mRNA表達(dá)有下調(diào)作用。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間段TNF-α的mRNA表達(dá)

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間段MMP-9的mRNA表達(dá)

3 討論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)作為骨關(guān)節(jié)終末期疾病和老年股骨頸骨折等疾病最為有效的治療手段，可以明顯提高患者的生活質(zhì)量[1-2]。人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最主要的并發(fā)癥。大量研究表明[7-8]，磨損顆粒—界膜巨噬細(xì)胞—骨溶解—無(wú)菌性松動(dòng)之間存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，該聯(lián)系的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)為巨噬細(xì)胞被磨損顆粒激活后釋放的大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，主要有TNF-α、IL-1、MMP等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，并刺激巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞引起鄰近骨質(zhì)吸收、骨重建紊亂[3-4]。

介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟的各種細(xì)胞因子都會(huì)通過多種信號(hào)傳導(dǎo)通路直接或間接地調(diào)控關(guān)鍵核基因的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變可能是參與破骨細(xì)胞調(diào)控的中心環(huán)節(jié)，因而可能調(diào)控人工關(guān)節(jié)磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解。

MAPK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，其廣泛存在于包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多種生物細(xì)胞中，MAPK家族的信號(hào)傳導(dǎo)途徑主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的蛋白激酶（extracellular signal regulated protein kinase，ERK）、c-Jun N端激酶（c-Jun Nterminal kinase，JNK）/應(yīng)激活化的蛋白激酶（stress activated protein kinase，SAPK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK）以及ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶1（big MAP kinase，BMK1）四條途徑[9]。p38MAPK參與了生物凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及細(xì)胞骨架識(shí)別等，是許多細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)和共同通路[10]。p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與破骨細(xì)胞的溶骨性改變有著密切的相關(guān)性。有實(shí)驗(yàn)研究[11]表明，人工假體產(chǎn)生的磨損顆粒可以刺激和激活炎性反應(yīng)微環(huán)境中的前炎性因子如RANKL及TNF-α，而這些因子能激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和MAPK，其中MAPK也包括c-JNK、ERK和p38，這些轉(zhuǎn)錄因子均可參與破骨細(xì)胞的增殖和分化。

TNF-α為破骨細(xì)胞吸收刺激因子主要作用于未成熟的成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)RANKL分子，并與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上受體RANK結(jié)合，使破骨細(xì)胞分化、成熟并產(chǎn)生活性。這些細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)刺激成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL而成為局部骨吸收的重要潛在調(diào)節(jié)者[12]。TNF通過和細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥等生物學(xué)效應(yīng)?，F(xiàn)已證明：TNF-α和RANKL相互作用可以增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性[13]。

MMP-9主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞，也是MMPs家族中分子量相對(duì)較大的酶。破骨細(xì)胞增殖、分化和成熟不斷加強(qiáng)后出現(xiàn)骨溶解的作用。在這個(gè)過程中，MMP-9作為一種主要蛋白酶，能夠降解各種細(xì)胞外基質(zhì)。因此在破骨細(xì)胞中有多種細(xì)胞因子可以影響MMP-9的活性，除此之外，多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑亦能調(diào)控其表達(dá)。Franco等[14]通過動(dòng)物體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，破骨細(xì)胞可在RANKL介導(dǎo)下出現(xiàn)分化增殖，也使得MMP-9的活性增加。

p38抑制劑被廣泛應(yīng)用于p38 MAPK對(duì)TNFα、IL-1、MCP-1等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)活性的研究[15-17]。SB203580是p38MAPK的特異性的吡啶異咪噠唑類抑制劑[18-21]，結(jié)構(gòu)與腺嘌呤類似，可競(jìng)爭(zhēng)性與磷酸化的p38α和p38β上的具有ATP酶活性的ATP盒結(jié)合，從而抑制p38MAPK對(duì)下游分子如ATF2的磷酸化，然而并不影響p38MAPK的磷酸化[22]。p38MAPK具有一個(gè)較小的氨基末端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)較大的羧基末端結(jié)構(gòu)域，其氨基末端結(jié)構(gòu)域主要由D折疊組成，而其羧基末端結(jié)構(gòu)域主要為Ⅱ螺旋。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域交界處形成一個(gè)裂隙，也即ATP結(jié)合位點(diǎn)。SB203580并不是通過抑制p38MAPK上游激酶的活性而發(fā)揮作用，而是結(jié)合于激活的p38MAPK及未被激活的p38MAPK的ATPK口袋，從而抑制下游底物MAPK APK2（MK2）的磷酸化及其功能的發(fā)揮[23]。吡啶異咪噠唑類化合物的藥用潛力也被用于多種疾病，特別是炎癥相關(guān)性疾病，并且取得了一定的效果[24-25]。

本研究以小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，證實(shí)Ti顆粒能在體外促進(jìn)巨噬細(xì)胞部分細(xì)胞因子TNF-α和MMP-9的表達(dá)，并與Ti顆粒濃度呈正相關(guān)；p38MAPK抑制劑SB203580能通過p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制Ti顆粒誘導(dǎo)下的巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和MMP-9等的表達(dá)；同時(shí)，SB203580能抑制小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，通過p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響破骨細(xì)胞活性。這可能是p38MAPK抑制劑SB203580能降低骨溶解的機(jī)制之一。應(yīng)用ELISA法也證實(shí)前者的TNF-α水平低于后者，結(jié)果提示，SB203580抑制了p38 MAPK的酶活性，阻止了p38 MAPK對(duì)下游底物的激活，從而抑制了P38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，減少了細(xì)胞因子如TNF-α和MMP-9的釋放。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ti顆粒誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的TNF-α和MMP-9表現(xiàn)為高表達(dá)，并出現(xiàn)過度凋亡現(xiàn)象，可與Ti顆粒的濃度呈正相關(guān)。磨損顆粒促進(jìn)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。p38MAPK抑制劑SB203580通過p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制Ti顆粒誘導(dǎo)下的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和MMP-9等炎性因子；SB203580能促進(jìn)巨噬細(xì)胞正常凋亡，抑制巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。