趙佳佳 趙蓓 高未 李杰 蔡俏 應(yīng)小明

自閉癥又稱孤獨(dú)癥，是廣泛性發(fā)育障礙的代表性疾病，核心癥狀主要包括情緒表達(dá)困難、社交互動障礙，語言和非語言的溝通障礙、限制行為與重復(fù)刻板動作以及明顯的興趣狹窄[1-2]。除上述三大核心癥狀外，自閉癥患者還可能伴發(fā)其他臨床癥狀，如智力障礙、癲癇、睡眠障礙、感知系統(tǒng)異常、頭圍異常、胃腸道不適、免疫及代謝異常等[3-4]。由于自閉癥具有高度臨床異質(zhì)性和病因異質(zhì)性，其真正的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚[5-6]。相關(guān)研究表明，自閉癥的發(fā)生可能受到基因和環(huán)境因素的共同影響[7]。本文通過構(gòu)建自閉癥小鼠模型，對其神經(jīng)遞質(zhì)[包括γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、多巴胺等]水平病理性改變的機(jī)制作一探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 12只雌性、6只雄性C57BL/6小鼠，6周齡，無特定病原體，購自上海斯萊克，SCXK（滬）2017-0005，合格證號：20170005047072。試驗(yàn)前小鼠在動物房環(huán)境中適應(yīng)1周。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。本實(shí)驗(yàn)委托杭州赫貝科技有限公司機(jī)構(gòu)完成，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)該公司動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審查通過。

1.2 主要試劑和儀器 高爾基染色試劑盒（批號：PK401）購自美國FD Neuro Technologies Inc公司，丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA；批號：K1823102）購自四川科瑞德制藥股份有限公司，聚偏二氟乙烯膜（批號：IPVH00010）購自美國 Millipore公司，GABA（批號：14012）試劑盒購自美國 R&D公司，5-HT（批號：17101）試劑盒購自美國R&D公司，多巴胺（批號：14082）試劑盒購自美國R&D公司，Arc一抗（批號：H00023237-B01）購自艾美捷科技有限公司，EGR2一抗（批號：ab63943）購自上海恒斐生物科技有限公司，S-100a9一抗（批號：H00006280-M01A）購自艾美捷科技有限公司。水迷宮系統(tǒng)購自北京智鼠多寶科技有限責(zé)任公司，CM186UV型冷凍切片機(jī)購自德國Leica公司，BX43型電子顯微鏡購自日本Olympus公司，AB SCIEX 5500 QTRAP質(zhì)譜儀購自美國AB SCIEX公司，1290 Infinity LC超高效液相色譜儀購自美國Agilent公司，5430R低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)、ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀、定量PCR儀及配套的分析軟件均購自美國Bio-RAD公司。

1.3 自閉癥小鼠（子代）模型的建立 將健康成年雌鼠12只和雄鼠6只合籠，受孕后將雌鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（母代）和對照組（母代），記為受孕0 d。模型組（母代）于受孕10、12 d腹腔注射VPA注射液（使用0.9%氯化鈉注射液配置，濃度為250 mg/ml）1.2 ml/kg，對照組給予等體積0.9%氯化鈉注射液。新生鼠出生當(dāng)天記為出生0 d，模型組（子代）于出生4 d后進(jìn)行母子分離實(shí)驗(yàn)。將新生小鼠移至遠(yuǎn)離親本的新房間，分離24 h后將新生小鼠送回，與親本同籠。建模8周后，取模型組（子代）、對照組（子代）各12只用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4 小鼠（子代）行為學(xué)觀察 采用理毛實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)。對照組、模型組小鼠（子代）各取3只進(jìn)行行為學(xué)觀察。（1）理毛實(shí)驗(yàn)：觀察并記錄小鼠5 min內(nèi)的理毛次數(shù)。（2）水迷宮實(shí)驗(yàn)：將小鼠置于水迷宮中央?yún)^(qū)，記錄小鼠搜尋站臺的時間，即潛伏時間。（3）曠場實(shí)驗(yàn)：將小鼠置于50 cm×50 cm×50 cm的曠場裝置中，測量小鼠5 min內(nèi)的運(yùn)動距離，記錄某一肢體進(jìn)入曠場中央格子的次數(shù)（即穿越格子次數(shù)）、后肢站立次數(shù)。

1.5 小鼠（子代）海馬錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)觀察 采用高爾基染色法。對照組、模型組小鼠（子代）各取3只，斷頭處死，取腦組織并用紙巾輕輕擦拭，采用聚乙二醇包埋，置于-20℃冷凍切片，切片厚度100 μm，采用黏附載玻片貼片，避光，于30 min內(nèi)進(jìn)行高爾基染色。避光，蒸餾水洗2次，4 min/次；用吸水紙輕輕吸去多余水分，將工作液滴于組織上，室溫下放置12 min，蒸餾水洗2次，4 min/次；不同乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。在電子顯微鏡下觀察，膠質(zhì)細(xì)胞的胞體呈棕黑色或黑色為神經(jīng)元染色結(jié)果，使用Image系統(tǒng)計(jì)算錐體神經(jīng)元數(shù)量。

1.6 小鼠（子代）腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測 采用高效液相色譜法。對照組、模型組小鼠（子代）各取3只，斷頭處死，取出腦皮層樣本并分別稱取60 mg進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加入 800 μl甲醇乙腈溶液（1∶1，v/v），渦旋 60 s；低溫超聲30 min，共2次，-20℃放置1 h；14 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液；冷凍干燥，-80℃保存樣本。采用高效液相色譜法測定GABA、5-HT和多巴胺水平。

1.7 兩組小鼠（子代）腦組織Arc、EGR2和S-100a9蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。對照組、模型組小鼠（子代）各取3只，斷頭處死，取0.1 mg腦組織，加入 500 μl裂解液，充分勻漿；4 ℃、11 000 r/min離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，置于-80℃保存；采用BCA法測定蛋白濃度。配置十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，上樣，電泳（先80 V 30 min，再120 V 60～70 min）；將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；過夜孵育一抗；TBST洗一抗；室溫孵育二抗1 h；TBST洗二抗6～7次，6 min/次；曝光顯色。蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠（子代）理毛實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 模型組小鼠（子代）理毛次數(shù)為（25.67±6.51）次，明顯多于對照組小鼠（子代）的（7.31±3.24）次，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 兩組小鼠（子代）水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 兩組小鼠（子代）第1天潛伏時間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而第 2、3、4、5天模型組小鼠（子代）潛伏時間均明顯長于對照組小鼠（子代），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 1。

表1 兩組小鼠（子代）潛伏時間比較（s）

2.3 兩組小鼠（子代）曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 模型組小鼠（子代）總運(yùn)動距離明顯短于對照組小鼠（子代），且穿越格子次數(shù)、后肢站立次數(shù)均明顯少于對照組小鼠（子代），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組小鼠（子代）曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.4 兩組小鼠（子代）海馬錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)比較 模型組小鼠（子代）較對照組小鼠（子代）的海馬錐體神經(jīng)元胞體萎縮，錐體神經(jīng)元數(shù)量明顯減少[（0.06±0.04）個/μm 比（0.32±0.11）個/μm]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 1。

圖1 兩組小鼠（子代）海馬錐體神經(jīng)元高爾基染色所見（電子顯微鏡下，×1 000）

2.5 兩組小鼠（子代）腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)水平比較 模型組小鼠（子代）腦皮層GABA、5-HT水平均高于對照組小鼠（子代），而多巴胺水平明顯低于對照組小鼠（子代），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組小鼠（子代）神經(jīng)遞質(zhì)水平比較（nmol/g）

2.6 兩組小鼠（子代）腦組織 Arc、EGR2、S-100a9蛋白表達(dá)水平比較 模型組小鼠（子代）腦組織Arc、EGR2蛋白表達(dá)水平均高于對照組小鼠（子代），而S-100a9蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組小鼠（子代），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2和表4。

表4 兩組小鼠（子代）腦組織Arc、EGR2和S-100a9蛋白表達(dá)水平比較

圖2 兩組小鼠（子代）腦組織Arc、EGR2和S-100a9蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

自閉癥是一種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙疾病，起病于嬰幼兒期，一般在3歲前發(fā)病，嚴(yán)重影響兒童的健康，甚至對其成年后的學(xué)習(xí)、工作和生活均有深遠(yuǎn)影響[8]。近年來，自閉癥患病率呈不斷上升趨勢[9]。新生兒出生后早期有一段特定時間窗，其大腦能非常敏銳地感知外界環(huán)境刺激并獲取外部信息，這段時期為腦發(fā)育的關(guān)鍵期[10]。研究表明，在新生兒腦發(fā)育關(guān)鍵期的經(jīng)歷可以塑造大腦神經(jīng)環(huán)路，對其成年后的認(rèn)知、情感及行為均有影響[11]。生命早期應(yīng)激被認(rèn)為是多種精神疾病的重要風(fēng)險因素。針對哺乳動物母嬰關(guān)系在早期生長發(fā)育、學(xué)習(xí)認(rèn)知和社交行為中的重要作用，早期母愛剝奪被認(rèn)為是早期應(yīng)激事件之一。根據(jù)靈長類動物以及人類的研究結(jié)果，早期母愛剝奪會影響個體的神經(jīng)發(fā)育和行為表現(xiàn)，且這些影響可能持續(xù)一生[12]。新生幼鼠的早期生長主要依賴于母鼠所提供的溫暖、營養(yǎng)與庇護(hù)，母嬰聯(lián)系在出生后2周內(nèi)尤為重要。以嚙齒類動物（大鼠、小鼠）母子分離實(shí)驗(yàn)?zāi)M人類生命早期母子分離的特征，已成為研究早期經(jīng)歷影響個體發(fā)育的主要模型[13]。既往實(shí)驗(yàn)表明，早期母子分離可導(dǎo)致大鼠、小鼠行為學(xué)發(fā)生改變，這些改變呈現(xiàn)出自閉癥類似行為，如經(jīng)歷早期母子分離的小鼠自發(fā)活動減少，社交行為受損，同時焦慮、抑郁類似行為明顯增加[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)建立了自閉癥小鼠模型，結(jié)果表明與對照組小鼠（子代）比較，模型組小鼠（子代）理毛次數(shù)明顯增多，第2、3、4、5天潛伏時間明顯延長，總運(yùn)動距離明顯縮短，穿越格子次數(shù)及后肢站立次數(shù)均明顯減少。這提示模型組小鼠（子代）存在社交障礙、探索能力異常等。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組小鼠（子代）錐體神經(jīng)元數(shù)量少于對照組小鼠（子代），提示模型組小鼠（子代）的海馬錐體神經(jīng)元胞體萎縮。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，突觸傳遞最重要的方式是基于神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)化學(xué)傳遞。近年來研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制中的作用備受關(guān)注[16]，GABA、5-HT和多巴胺是重要神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者發(fā)作期血液中GABA、5-HT水平均明顯升高，而多巴胺水平明顯降低[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠（子代）腦皮層GABA、5-HT水平明顯升高，而多巴胺水平明顯降低，提示自閉癥模型小鼠存在神經(jīng)遞質(zhì)水平改變。進(jìn)一步檢測腦組織Arc、EGR2、S-100a9蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠（子代）Arc、EGR2蛋白表達(dá)水平明顯升高，而S-100a9蛋白表達(dá)水平明顯降低。這提示自閉癥模型小鼠存在行為學(xué)異常和神經(jīng)遞質(zhì)水平改變，可能與Arc、EGR2蛋白表達(dá)上調(diào)、S-100a9蛋白表達(dá)下調(diào)的機(jī)制有關(guān)，但有待后續(xù)研究作進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，自閉癥模型小鼠存在行為學(xué)異常和神經(jīng)遞質(zhì)水平改變，可能與Arc、EGR2蛋白表達(dá)上調(diào)、S-100a9蛋白表達(dá)下調(diào)的機(jī)制有關(guān)。但本研究也存在一定的局限性，今后仍需開展多中心、多樣本的研究，以提供更可靠的參考依據(jù)。