吳燕虹 龔超超 習海濤 趙軍招

近年來，不孕不育癥已成為全球性的問題。不孕不育癥發(fā)病率約為10%～15%，發(fā)病原因中男性因素占40%[1]。常規(guī)精液分析的重要指標精子形態(tài)正常率能否預測男性生育能力和體外受精胚胎移植結局一直備受爭議[2]。有研究表明，精子畸形率高不僅會降低受精率，還會延長自然受孕時間，甚至增加自然流產(chǎn)的概率[3-4]。但也有研究發(fā)現(xiàn)即使精子形態(tài)正常率為0也有成功受精和受孕的可能，精子形態(tài)異常對輔助生殖技術的助孕結局無明顯影響[5-6]。目前關于精子形態(tài)對單囊胚移植的影響相關報道較少。鑒于單囊胚移植是今后輔助生殖技術革新的方向，本研究通過探討精子形態(tài)對年輕女性患者行新鮮單囊胚移植后助孕結局的影響，以期為提高單囊胚移植的安全性提供臨床依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 回顧性分析2019年1至12月在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行新鮮單囊胚移植的年輕女性患者690例。納入標準：（1）女方年齡≤35歲；（2）促排卵方案為卵泡期超長方案；（3）女方基礎激素水平正常；（4）女方不孕原因為輸卵管因素或多囊卵巢綜合征，超聲提示雙卵巢、子宮正常；（5）男女雙方身體健康，無酗酒、吸毒等不良嗜好；（6）取卵和移植周期均為第1次。排除標準：（1）不適合新鮮周期移植者，如子宮腺肌癥、子宮肌瘤壓迫內(nèi)膜、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜息肉等；（2）男性少弱精子癥；（3）男性精子DNA 碎片率高（DNA-fragmetation-index，DFI≥25%）。根據(jù)《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）精子形態(tài)正常率參考值下限為 4%[7]，將患者根據(jù)男方精子形態(tài)正常率分為正常組、精子輕中度畸形組和精子重度畸形組3組。正常組：精子形態(tài)正常率≥4%，共157例；精子輕中度畸形組：2%≤精子形態(tài)正常率＜4%，共256例；精子重度畸形組：精子形態(tài)正常率＜2%，共277例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 降調節(jié) 于月經(jīng)周期1～5 d注射3.75 mg長效醋酸亮丙瑞林微球（商品名：貝依，規(guī)格：3.75 mg/支，麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司）降調節(jié)，32～38 d后測定血卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2），同時B超監(jiān)測內(nèi)膜、卵泡的數(shù)量及大小。當垂體達到脫敏狀態(tài)（FSH＜5 mIU/ml、LH＜5 mIU/ml、E2＜50 pg/ml，B超監(jiān)測無直徑＞10 mm卵泡、子宮內(nèi)膜厚度＜5 mm），則使用促性腺激素（gonadotropin，Gn）啟動促排卵。如降調節(jié)后B超檢查提示子宮內(nèi)膜厚度≥5 mm，查尿妊娠試驗，排除妊娠后再用Gn促排卵。

1.2.2 促排卵 根據(jù)患者年齡、體重、竇卵泡數(shù)、基礎FSH選擇Gn促排卵，Gn刺激第5～6天開始監(jiān)測，根據(jù)B超監(jiān)測及血清性激素水平調整Gn種類和劑量。當有2～3個卵泡直徑≥18 mm時，于21:00至22:00肌肉注射注射用絨促性素（規(guī)格：5 000 IU/支，麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司）4 000～10 000 IU或皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素注射液（商品名：艾澤，規(guī)格：250 μg/支，瑞士默克雪蘭諾公司）125～250 μg 扳機。

1.2.3 取卵、精液檢查、移植及黃體支持 扳機后36～38 h，在陰道超聲引導下經(jīng)陰道取卵。取卵當日，男方以手淫法收集精液。獲取的卵母細胞常規(guī)行體外受精（in vitro fertilization，IVF）操作及胚胎培養(yǎng)，若常規(guī)受精失敗，則行補救性卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術（rescue intracytoplasmic sperm injection，R-ICSI）。采用Gardner囊胚分級法進行分級[8]：以數(shù)字1～6對囊胚的擴張度和孵化狀態(tài)進行評分，以字母A、B、C對內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM）和滋養(yǎng)外胚層細胞（trophectoderm，TE）進行評分。優(yōu)質囊胚的標準定義為3期及3期以上、ICM及TE均為B級及以上者，可利用胚胎定義為3期以上、ICM和TE評分不同時為C者。取卵后第5天選取1枚優(yōu)質囊胚進行移植，如本周期內(nèi)無優(yōu)質囊胚者，則選取1枚可利用囊胚進行移植。移植后黃體支持方案為：自取卵日起，地屈孕酮片（商品名：達芙通，規(guī)格：10 mg/片，荷蘭Abbott Healthcare Products B.V.）20 mg/次，2 次/d 口服；黃體酮軟膠囊（商品名：安琪坦，規(guī)格：0.1 g/片，法國法杏制藥廠），0.2 g/次，2次/d口服或陰道給藥。

1.2.4 妊娠結局判定標準 胚胎移植后2周，測血清人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）水平以確定是否妊娠。胚胎移植后4周，陰道超聲檢查發(fā)現(xiàn)有孕囊者為臨床妊娠；血hCG≥15 mIU/ml或尿妊娠試驗陽性，但陰道超聲檢查未見孕囊者為生化妊娠；發(fā)生在妊娠12周前的流產(chǎn)為早期流產(chǎn)，而發(fā)生在12周或之后的流產(chǎn)為晚期流產(chǎn)。妊娠滿28周至不足37周間分娩者為早產(chǎn)。出生體重＜2 500 g的嬰兒為低出生體重兒，出生體重≥4 000 g的嬰兒為巨大兒。

1.3 觀察指標 助孕結局包括實驗室結局、妊娠結局和新生兒結局。其中實驗室結局包括獲卵數(shù)、成熟數(shù)、受精數(shù)、囊胚形成率、優(yōu)質囊胚形成率、優(yōu)質囊胚移植比和囊胚冷凍數(shù)等指標，妊娠結局包括hCG陽性率、臨床妊娠率、生化妊娠率、早期和晚期流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎妊娠率、早產(chǎn)率、活產(chǎn)率等指標。新生兒結局包括新生兒出生體重、巨大兒和低出生體重兒占比、新生兒死亡率、新生兒畸形率和新生兒性別等指標。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，3組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，3組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。采用多因素logistic回歸分析影響活產(chǎn)的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組患者基本情況比較 3組患者女方年齡、不孕年限、BMI、雙側竇卵泡計數(shù)（antral follicl ecount，AFC）、不孕類型、不孕原因、基礎激素水平、降調節(jié)后激素水平、hCG日激素水平及子宮內(nèi)膜厚度、Gn用量和天數(shù)，男方年齡、不育類型、精液量、精子密度及精子活率等一般情況比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），3組患者精子形態(tài)正常率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 1。

表1 3組患者基本情況比較

2.2 3組患者實驗室結局比較 3組患者獲卵數(shù)、受精方式、成熟數(shù)、受精數(shù)、囊胚形成率、優(yōu)質囊胚形成率、優(yōu)質囊胚移植比和囊胚冷凍數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 3組患者實驗室結局比較

2.3 3組患者妊娠結局和新生兒結局比較 3組患者hCG陽性率、臨床妊娠率、生化妊娠率、早期和晚期流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎妊娠率、早產(chǎn)率、活產(chǎn)率、新生兒出生體重、巨大兒和低出生體重兒占比、新生兒死亡率、新生兒畸形率和新生兒性別比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表3。

表3 3組患者妊娠結局和新生兒結局比較

2.4 影響活產(chǎn)結局的多因素分析 以是否活產(chǎn)作為因變量，以精子形態(tài)是否正常、女方不孕類型、男方不孕類型、多囊卵巢綜合征等18個變量為自變量（賦值情況見表4）進行多因素logistic回歸分析，結果顯示精子形態(tài)異常不是影響活產(chǎn)結局的因素（P＞0.05），見表5。

表4 自變量賦值

表5 影響活產(chǎn)結局的多因素分析

3 討論

現(xiàn)階段影響輔助生殖技術結局的因素包括男女方年齡、不孕年數(shù)、BMI、母體陰道和子宮內(nèi)膜微生物組以及著床前后血清孕酮水平[9-10]。本研究入選患者的女方年齡不超過35歲、基礎激素水平功能正常、均使用卵泡期超長方案促排卵、首次取卵及移植，可有效避免高齡、卵巢功能減退、反復種植失敗以及促排卵方案不同可能對研究結果造成的不利影響。在排除上述因素后，著重探討精子形態(tài)異常對新鮮單囊胚移植助孕結局的影響。

目前，精子形態(tài)預測輔助生殖技術妊娠結局方面的應用價值在業(yè)界尚未達成共識[11]。多位學者發(fā)現(xiàn)，單獨的畸形精子癥對IVF輔助生育妊娠結局無顯著影響[12-14]。相反，Dubey等[15]發(fā)現(xiàn)正常精子形態(tài)組的正常胚胎率、種植率、臨床妊娠率均高于畸形精子組。本研究中，精子形態(tài)對新鮮單囊胚移植后臨床妊娠率、活產(chǎn)率等妊娠結局和新生兒結局均無明顯影響。究其原因，可能在于精子形態(tài)分類、染色制片技術缺乏共識，精子形態(tài)正常率的閾值也有可能隨著時間的推移而改變，精子畸形對妊娠結局的影響似乎比最初想象的作用要小[13]。另外，本研究采用的精子處理方法是密度梯度離心后再上游法，有研究認為該方法不僅可以減少異倍體的精子和欠成熟的精子比例，富集運動能力高的精子群體，還有益于獲得冷凍復蘇后頂體完整性高的精子，對改善畸形精子百分比具有一定的優(yōu)越性，從而降低了精子形態(tài)畸形可能產(chǎn)生的影響[16-17]。

畸形精子的頂體功能異?？芍苯訉е翴VF受精失敗或影響受精率[14，18-19]。R-ICSI作為常規(guī)IVF受精失敗時的一種安全有效的補救方法，從提出發(fā)展到如今，已被廣泛應用。Li等[20]探討了精子形態(tài)對R-ICSI周期臨床結局和實驗室結局并無影響。本研究中，3組分別有5、9、18例患者行R-ICSI操作，單純精子形態(tài)異常并未影響受精率，且與囊胚形成率、優(yōu)胚率以及囊胚冷凍數(shù)無相關性。這也意味著精子形態(tài)對IVF受精結果的影響尚無定論，孤立的精子形態(tài)異常不應作為行ICSI操作的預測因素，倘若IVF過程中發(fā)生受精失敗，及時行補救ICSI治療也可獲得滿意的實驗室結局。

流產(chǎn)同樣為輔助生殖技術治療的一個重要風險事件。既往針對流產(chǎn)的研究主要集中在女性方面[21]，對有男性因素導致的流產(chǎn)重視程度遠遠不夠。隨著近來研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)卵子質量對成功活產(chǎn)的貢獻為70%～80%，子宮條件所占的權重為10%～15%，剩余的10%～15%為精子的貢獻，當精子異常時，男方因素對于可否獲得活產(chǎn)后代的影響顯著增大[22]。Gil-Villa等[23]的研究顯示，與正常可育男性相比，反復流產(chǎn)患者的男性伴侶有較低的精子正常形態(tài)率。本研究中，異常的精子形態(tài)不增加生化妊娠、早期流產(chǎn)以及晚期流產(chǎn)等風險的發(fā)生，與多位學者的研究[14，24]一致。目前針對精子因素所致流產(chǎn)的研究仍處于探索階段，胚胎學家們更認可精子DNA損傷（高DFI值）對胚胎發(fā)育的影響[25]，臨床上應結合多項檢查結果綜合評估精子質量。

本研究有3個主要局限性，希望能在未來的研究中加以解決。首先，WHO發(fā)布的《WHO精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）并沒有包括關于中國人群的任何數(shù)據(jù)和資料，因此，目前正常精子形態(tài)的設定是否適合中國人群是很值得探討的問題。其次，僅僅統(tǒng)計到新鮮單囊胚移植周期妊娠結局，沒有進行累計妊娠率統(tǒng)計，且未能追蹤新生兒出生后的智力體格發(fā)育等情況。最后，系單中心的回顧性研究，日后還需要進行大樣本量的、嚴格控制外變量的、多中心的、前瞻性的隨機對照研究精子形態(tài)對單囊胚新鮮移植的影響。

綜上所述，在年輕女性行新鮮單囊胚移植周期中，精子形態(tài)異常既不影響IVF的實驗室結局，也不影響妊娠結局和新生兒結局，為精子形態(tài)異常患者選擇新鮮單囊胚移植助孕的安全性提供一定的參考價值，減少了畸形精子癥患者行輔助生殖技術助孕的后顧之憂。