李穎 陳進(jìn) 呂晶 嚴(yán)飛

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在不同微環(huán)境中被極化為具有不同功能的M1和M2兩種類(lèi)型。巨噬細(xì)胞極化在包括腎纖維化在內(nèi)的多種疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本課題組曾報(bào)道硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）能夠促進(jìn)THP-1源巨噬細(xì)胞M1極化，而Klotho蛋白通過(guò)NF-κB、p38-MARK通路顯著抑制M1極化并強(qiáng)化M2極化[1-3]。本研究通過(guò)構(gòu)建Klotho過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染THP-1源巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步探討β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和Yes相關(guān)蛋白（Yes associated protein，YAP）通路在Klotho蛋白調(diào)節(jié)IS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 THP-1細(xì)胞（上海復(fù)祥生物科技有限公司）；pIRES2-ZsGreen1質(zhì)粒（廣州復(fù)能基因有限公司）；IS（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司）；HLADR抗體、CD206抗體、GAPDH抗體（美國(guó)Abcam公司）；RNeasy MiniKit試劑盒（德國(guó) Qiagen公司）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems公司）；βcatenin 抗體、磷酸化 YAP（phospho-Yes associated protein，p-YAP）抗體（美國(guó) Affnity公司）；YAP抗體（美國(guó)Novus公司）；YAP1抗體（美國(guó) Proteintech公司）；HRP二抗（德國(guó)Dianova公司）；ECL顯影液（美國(guó)Bio-Rad公司）；0.1%Triton X-100（南京森貝伽生物科技有限公司）；GelDoc成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞用含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，并維持2×105/ml濃度。經(jīng)丙二醇甲醚醋酸酯（propylene glycol methyl ether acetate，PMA）（160 nM）處理 48 h誘導(dǎo)成THP-1源巨噬細(xì)胞。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 利用本課題組成功構(gòu)建的Klotho過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1源巨噬細(xì)胞[1-2]。根據(jù)Klotho目的基因序列GenBank：NM-004795.3，設(shè)計(jì)引物PCR目的條帶，獲取目的片段。小量提取pIRES2-ZsGreen1質(zhì)粒，與膠回收Klotho PCR產(chǎn)物混勻，離心，雙酶切，37℃過(guò)夜。回收酶切的pIRES2-ZsGreen1質(zhì)粒和Klotho基因片段，混勻，離心，采用T4 DNA連接酶，4℃過(guò)夜快速連接。鈣離子處理后的感受態(tài)THP-1細(xì)胞解凍后，加入重組連接產(chǎn)物，復(fù)蘇。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及是否用IS干預(yù)，細(xì)胞分為4組：（1）對(duì)照組：轉(zhuǎn)染未經(jīng)處理的pIRES2-ZsGreen1質(zhì)粒；（2）對(duì)照+IS組：轉(zhuǎn)染未經(jīng)處理的pIRES2-ZsGreen1質(zhì)粒，并參照既往研究結(jié)果予 IS（2 mmol/L）干預(yù)[1]；（3）過(guò)表達(dá)組：轉(zhuǎn)染 Klotho過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；（4）過(guò)表達(dá)+IS組：轉(zhuǎn)染Klotho過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并予IS（2 mmol/L）干預(yù)。最后收集適量的細(xì)胞，進(jìn)行樣本制備。

1.4 M1極化標(biāo)志物HLA-DR和M2極化標(biāo)志物CD206陽(yáng)性細(xì)胞百分比檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。細(xì)胞離心重懸后計(jì)數(shù)，每管含1×106個(gè)細(xì)胞；離心后以含0.5%牛血清白蛋白的PBS孵育緩沖液清洗2遍，每管用0.2 ml PBS孵育緩沖液重懸，添加5 μl HLA-DR或CD206抗體，4℃避光孵育30 min；離心后再次清洗、重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果以陽(yáng)性熒光百分比表示。

1.5 β-catenin和YAP mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法。根據(jù)RNeasy MiniKit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA并對(duì)DNase進(jìn)行消化。使用大容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)條件如下：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存；qRT-PCR實(shí)驗(yàn)利用SYBR Green實(shí)驗(yàn)方法中Step One Plus Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行，反應(yīng)條件如下：94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法進(jìn)行各基因表達(dá)的相對(duì)定量。相關(guān)引物序列：β-catenin上游引物：5'-CCAAGTGGGTGGTATAGAGG-3'，下游引物：5'-AGTCCATAGTGAAGGCGAAC-3'；YAP 上游引物：5'-GTGGCACCTATCACTCTCGA-3'，下游引物：5'-TGGCTTCAAGGTAGTCTGGG-3'。

1.6 β-catenin、YAP和 p-YAP蛋白表達(dá)水平檢測(cè)采用Western blot法。由于YAP磷酸化是YAP信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，故采用Western blot法檢測(cè)p-YAP蛋白表達(dá)水平。用含有蛋白酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞，收集上清液提取蛋白質(zhì)，利用Bradford法測(cè)量蛋白濃度。取10 μg細(xì)胞裂解液通過(guò)凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，漂洗，用含4%牛奶的封閉液封閉后加入β-catenin抗體（1∶1 000）、YAP 抗體（1∶1 000）、p-YAP 抗體（1∶1 000）、GAPDH 抗體（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜。用含0.1%Tween的PBS溶液將膜洗3遍后，加入含4%牛奶的封閉液以及HRP二抗，在室溫條件下孵育2 h，滴加ECL顯影液并放入GelDoc成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。蛋白表達(dá)水平用內(nèi)參蛋白GAPDH進(jìn)行歸一化處理。

1.7 β-catenin、YAP入核率檢測(cè) 采用細(xì)胞免疫熒光染色法。細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，用含0.1%Triton X-100的PBS處理細(xì)胞15 min。封閉液孵育1 h，滴加一抗 β-catenin（1∶100），YAP1 抗體（1∶100），4℃過(guò)夜孵育，滴加二抗（1∶100），37℃避光孵育 1 h，DAPI進(jìn)行復(fù)染5 min，熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦拍照，計(jì)算β-catenin或YAP入核率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。以上每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組M1和M2極化標(biāo)志物標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較 與對(duì)照組比較，對(duì)照+IS組HLA-DR標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯增加（P＜0.01），CD206標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分比無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與對(duì)照+IS組比較，過(guò)表達(dá)+IS組HLA-DR標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯減少（P＜0.01），而CD206標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯增加（P＜0.01），見(jiàn)圖1和表1。

表1 各組M1和M2極化標(biāo)志物標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分比比較（%）

圖1 Klotho對(duì)IS誘導(dǎo)下THP-1源巨噬細(xì)胞M1和M2極化的調(diào)節(jié)（a：各組細(xì)胞M1極化情況；b：各組細(xì)胞M2極化情況）

2.2 各組細(xì)胞β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平及入核率比較 與對(duì)照組比較，對(duì)照+IS組β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.01）；而與對(duì)照+IS組比較，過(guò)表達(dá)+IS組β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05），見(jiàn)圖2和表2。與對(duì)照組比較，對(duì)照+IS組β-catenin入核率明顯下降（P＜0.01）；與對(duì)照+IS組比較，過(guò)表達(dá)+IS組β-catenin入核率增加（P＜0.05），見(jiàn)表2和圖3（插頁(yè)）。

表2 各組細(xì)胞β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平及入核率比較

圖2 各組細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)的電泳圖

圖3 Klotho對(duì)IS誘導(dǎo)下THP-1源巨噬細(xì)胞β-catenin入核的影響

2.3 各組細(xì)胞YAP mRNA及蛋白表達(dá)水平及入核率比較 各組細(xì)胞YAP mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，對(duì)照+IS組YAP蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），p-YAP蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與對(duì)照+IS組比較，過(guò)表達(dá)+IS組YAP蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），p-YAP蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4和表3。與對(duì)照組比較，對(duì)照+IS組YAP入核率增加（P＜0.01）；而對(duì)照+IS組和過(guò)表達(dá)+IS組YAP入核率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3和圖5（插頁(yè)）。

表3 各組細(xì)胞YAP mRNA及蛋白表達(dá)水平及入核率比較

圖4 各組細(xì)胞YAP及p-YAP蛋白表達(dá)的電泳圖（a：各組細(xì)胞YAP蛋白表達(dá)的電泳圖；b：各組細(xì)胞p-YAP蛋白表達(dá)的電泳圖）

圖5 Klotho對(duì)IS誘導(dǎo)下THP-1源巨噬細(xì)胞YAP入核的影響

3 討論

巨噬細(xì)胞是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)晚期分化細(xì)胞，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，按照其表型和分泌的細(xì)胞因子可分為M1和M2型兩大類(lèi)型。近年研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在腎纖維化中發(fā)揮重要作用，成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[4-5]。M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放趨化因子、前炎癥因子和活化氧等激活炎癥反應(yīng)，加速腎臟損傷；M2型巨噬細(xì)胞分泌大量抗炎因子抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管生成。因此，巨噬細(xì)胞適度M2極化有利于組織修復(fù)與重塑，而過(guò)度M2極化可能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腎纖維化[4-5]。

IS是慢性腎臟病患者血清中一種典型的蛋白結(jié)合毒素，常規(guī)透析方法難以清除，具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和毒性反應(yīng)，能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放前炎癥因子和趨化因子等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生[6-7]。Klotho蛋白主要在腎臟產(chǎn)生，可緩解炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化，有助于腎臟損傷后修復(fù)[8-9]。隨著腎臟疾病進(jìn)展，血清Klotho蛋白水平進(jìn)行性下降，使腎臟更易受到損傷并促進(jìn)腎纖維化[10]。本研究顯示，與對(duì)照組比較，對(duì)照+IS組HLA-DR標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯增加，提示IS可促進(jìn)THP-1源巨噬細(xì)胞發(fā)生M1極化；與對(duì)照+IS組比較，過(guò)表達(dá)+IS組M1型陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯減少，而CD206標(biāo)記的M2型陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯增加，表明Klotho過(guò)表達(dá)可明顯抑制IS誘導(dǎo)的M1型比例增加，并促進(jìn)M2型比例增加。本團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究證實(shí)IS可顯著抑制Klotho表達(dá)，Klotho通過(guò)NF-κB和p38-MARK通路下調(diào)IS誘導(dǎo)下的巨噬細(xì)胞M1極化，并促進(jìn)M2極化[1-2]，與以往的研究結(jié)果一致。

Wnt/β-catenin通路是高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要通過(guò)入核調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用，與巨噬細(xì)胞增殖、分化等密切相關(guān)[11]。IS可通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化[12]、近曲小管上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]，進(jìn)而加速腎纖維化進(jìn)程[14]。而Klotho蛋白具有抑制腎小管上皮、心肌等細(xì)胞的Wnt/β-catenin通路，從而保護(hù)腎臟、心肌等組織，延緩多臟器纖維化的作用[15-17]。本研究顯示，與對(duì)照組比較，對(duì)照+IS組β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低，表明IS可明顯抑制細(xì)胞β-catenin通路信號(hào)分子表達(dá)；而與對(duì)照+IS組比較，過(guò)表達(dá)+IS組β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高，提示Klotho可以明顯抑制IS誘導(dǎo)的β-catenin通路的改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，對(duì)照+IS組β-catenin入核率明顯下降；與對(duì)照+IS組比較，過(guò)表達(dá)+IS組β-catenin入核率增加，表明IS可誘導(dǎo)細(xì)胞中β-catenin入核下降，Klotho對(duì)此過(guò)程具有抑制作用。此結(jié)果與既往的報(bào)道存在差異，可能與選擇細(xì)胞類(lèi)型不同等因素相關(guān)。不同細(xì)胞來(lái)源的Wnt配體均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化[18-19]，在小鼠模型Wnt/β-catenin通路促進(jìn)腎纖維化的過(guò)程中同樣存在巨噬細(xì)胞聚集及M2極化[19]。本研究顯示IS通過(guò)抑制β-catenin通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化，Klotho蛋白通過(guò)緩解IS對(duì)β-catenin通路的抑制強(qiáng)化M2極化，與上述Wnt/β-catenin通路對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用基本一致。

YAP是Hippo信號(hào)通路下游的效應(yīng)蛋白，在哺乳動(dòng)物中，Hippo信號(hào)通路被激活后，使YAP磷酸化并滯留在胞質(zhì)中，從而功能受到抑制；相反，通路抑制后YAP的磷酸化程度降低，非磷酸化的YAP進(jìn)入細(xì)胞核與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，最終啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。YAP進(jìn)入腫瘤細(xì)胞胞核后可誘導(dǎo)分泌IL-6、IL-4等細(xì)胞因子，使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2極化[20]，YAP1基因敲除或藥物阻斷結(jié)腸癌細(xì)胞YAP通路均能夠顯著抑制結(jié)腸癌相關(guān)的巨噬細(xì)胞M2極化[21]。本課題組曾報(bào)道IS可活化脂多糖刺激下巨噬細(xì)胞的YAP通路，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)M1極化[3]，與上述結(jié)論存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞YAP mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IS誘導(dǎo)和Klotho過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)YAP轉(zhuǎn)錄水平影響不大。與對(duì)照組比較，對(duì)照+IS組YAP蛋白表達(dá)水平明顯升高，p-YAP蛋白表達(dá)水平明顯降低；與對(duì)照+IS組比較，過(guò)表達(dá)+IS組YAP蛋白表達(dá)水平明顯降低，p-YAP蛋白表達(dá)水平升高。胞內(nèi)YAP蛋白水平變化明顯，且與YAP磷酸化水平變化趨勢(shì)相反，提示IS可以通過(guò)抑制YAP磷酸化來(lái)阻斷YAP降解從而促進(jìn)YAP的積累，Klotho則可解除IS對(duì)YAP磷酸化的抑制作用。進(jìn)一步研究顯示與對(duì)照組比較，對(duì)照+IS組YAP入核率增加；而對(duì)照+IS組和過(guò)表達(dá)+IS組YAP入核率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IS可以促進(jìn)YAP入核，而Klotho對(duì)IS誘導(dǎo)下THP-1源巨噬細(xì)胞中YAP入核影響不大。從而證實(shí)Klotho雖可以調(diào)節(jié)IS誘導(dǎo)下的YAP磷酸化水平和蛋白含量，但對(duì)YAP入核作用不大。

總之，本研究證實(shí)Klotho蛋白可通過(guò)抑制IS誘導(dǎo)的β-catenin通路下調(diào)強(qiáng)化巨噬細(xì)胞 M2極化，對(duì)YAP通路中入核關(guān)鍵環(huán)節(jié)無(wú)顯著作用。結(jié)果中有部分與以往報(bào)道存在差異，其相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。