陳乾 秦銘 徐志云

(1.中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學長海醫(yī)院心血管外科，上海 200433)

鈣化性主動脈瓣疾病(calcific aortic valve disease，CAVD)是一種礦物質(zhì)代謝失調(diào)的退行性疾病，病理表現(xiàn)為主動脈瓣的增厚和鈣鹽沉積，其病理機制類似于成骨分化。主動脈瓣膜鈣化與動脈粥樣硬化具有相似的病理特征，包括炎癥細胞的浸潤、脂質(zhì)斑塊的沉積以及最終的鈣化等[1]。近些年來研究[2]顯示炎癥在調(diào)節(jié)主動脈瓣鈣化和狹窄中發(fā)揮關(guān)鍵作用，表明調(diào)控瓣膜細胞免疫可能是治療CAVD的可行目標之一。

健康主動脈瓣瓣葉中約有15%的細胞為造血干細胞衍生細胞，其中大部分白細胞為單核/巨噬細胞和樹突細胞，以及少量的淋巴細胞和中性粒細胞[3-4]。單核/巨噬細胞作為機體非特異性免疫細胞，在主動脈瓣膜鈣化病理進程中通過分泌功能和吞噬作用扮演了極其重要的作用?，F(xiàn)通過總結(jié)單核/巨噬細胞與主動脈瓣鈣化的機制研究，以為主動脈瓣膜鈣化性病變的臨床治療提供理論基礎(chǔ)和潛在的治療方法。

1 單核/巨噬細胞的分型和功能

巨噬細胞具有多個亞型，包括M0、M1、M2、Mox和M4型巨噬細胞[5]。M0巨噬細胞為未活化的巨噬細胞，可進一步極化為M1和M2亞型。M1巨噬細胞在脂多糖或Th1細胞因子(如γ干擾素)的刺激下激活，促進炎癥并清除病原微生物發(fā)揮作用[6]，而M2巨噬細胞由Th2細胞因子[如白介素(interleukin，IL)-4和IL-13]激活，通過產(chǎn)生IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β等抗炎因子抑制炎癥，促進受損組織修復發(fā)揮作用[7]。Mox巨噬細胞在動脈粥樣硬化組織中顯著增加，其由氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導并具有致動脈粥樣硬化特性。M4巨噬細胞由血小板趨化因子4誘導，與斑塊不穩(wěn)定有關(guān)，與M1巨噬細胞一樣具有促炎作用，但缺乏吞噬能力[8]。

2 瓣膜單核/巨噬細胞浸潤機制

瓣膜組織中的巨噬細胞由血液中的單核細胞分化而來。在心動周期中，主動脈瓣小葉承受持續(xù)的彎曲、剪切、拉伸和壓縮應力，從而可能導致瓣膜內(nèi)皮細胞活化或損傷，降低瓣膜內(nèi)皮的完整性，誘導黏附分子的后續(xù)表達[9]。在手術(shù)切除的鈣化心臟瓣膜表面發(fā)現(xiàn)黏附分子血管細胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和E選擇素的表達增加，表明內(nèi)皮的不完整性和黏附分子的表達作為可能的機制促進了單核細胞衍生的巨噬細胞浸潤瓣膜組織[9-10]。此外，巨噬細胞在非鈣化主動脈瓣中的浸潤隨年齡增高而逐漸增加，這可能與年齡增長導致的瓣膜損傷增加相關(guān)[5]。

3 瓣膜組織及體液中單核/巨噬細胞的分布

巨噬細胞是主動脈瓣細胞免疫的重要組成部分，在所有免疫細胞中占比最高[8]。在健康主動脈瓣膜中，纖維層、海綿層和心室層均有巨噬細胞分布，其中海綿層中巨噬細胞的比例相對較高，這可能與海綿層浸潤的微血管網(wǎng)絡(luò)有關(guān)[5]。而與健康瓣膜相比，鈣化主動脈瓣膜中M0、M1浸潤增加，M2浸潤明顯減少[5，11]。此外，Mox巨噬細胞在鈣化主動脈瓣膜中的比例明顯高于健康瓣膜，然而其激活的機制和在主動脈瓣鈣化機制中的作用仍有待進一步研究[5]。

Schwartzenberg等[12]的研究表明，循環(huán)血中單核細胞的計數(shù)隨著主動脈瓣狹窄嚴重程度的增加逐漸減少。然而中間單核細胞作為一種具有炎性特征的單核細胞亞群，當嚴重主動脈瓣狹窄存在時，其外周血水平顯著升高，這可能與機體慢性炎癥和顯著的血流動力學紊亂相互作用的結(jié)果相關(guān)[13]。

4 先天性二葉主動脈瓣鈣化與巨噬細胞

臨床流行病學研究[14]表明，同正常三葉主動脈瓣人群相比，先天性二葉主動脈瓣(congenital bicuspid aortic valve，CBAV)人群更容易進展為瓣膜狹窄。二尖瓣中增加的剪切應力可能會調(diào)節(jié)瓣膜內(nèi)的炎癥過程[15]。在組織學中發(fā)現(xiàn)，CBAV人群的M1巨噬細胞密度相對較高，M2巨噬細胞密度相對較低，這與瓣膜組織中巨噬細胞集落刺激因子表達降低導致M1巨噬細胞向M2巨噬細胞轉(zhuǎn)化降低有關(guān)，而M1巨噬細胞的持續(xù)浸潤可能有助于CBAV的鈣化[16]。此外，CBAV中新血管生成、小葉內(nèi)出血也是導致CBAV鈣化快速進展的重要原因[17]。單核/巨噬細胞浸潤導致的炎癥還會刺激病理性血管生成過程，導致鈣化瓣膜變性的進展[18]。

5 單核/巨噬細胞通過分泌功能誘導瓣膜鈣化

5.1 細胞因子

瓣膜間質(zhì)細胞(valvular interstitial cells，VICs)在未受刺激的巨噬細胞來源的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下，其成骨分化進程明顯加快。在M1巨噬細胞來源的條件培養(yǎng)基中這一作用被進一步增強，這與M1巨噬細胞通過分泌多種促炎細胞因子，進而轉(zhuǎn)換VICs的表型有關(guān)[19]。Liu等[2]發(fā)現(xiàn)高脂飲食飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動脈瓣巨噬細胞等炎癥細胞浸潤增強，并伴隨著VICs向肌成纖維細胞分化的增加。M1巨噬細胞分泌的炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β能夠促進瓣膜肌成纖維細胞失活，并促進其增殖[19]。TNF-α是一種重要的炎癥微環(huán)境介質(zhì)，巨噬細胞通過分泌TNF-α上調(diào)VICs中Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)2的水平，從而加劇瓣膜炎癥以及接下來的成骨進程，并通過激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)來上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)的表達并促進VICs的鈣化[20]。Yu等[21]證明TNF-α可通過BMP2-Dlx5途徑加速主動脈瓣的鈣化。M1巨噬細胞分泌的IL-6促進了Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)核定位和BMP2的表達，促進失活的瓣膜肌成纖維細胞向成骨細胞樣細胞進行表型轉(zhuǎn)化[22-23]。IL-18主要在巨噬細胞中表達，尤其是在嚴重鈣化區(qū)域高表達，可以有效促進VICs的肌成纖維細胞分化[24]。IL-18促進了主動脈瓣葉中巨噬細胞的紅細胞吞噬作用和紅細胞降解，而紅細胞降解產(chǎn)物可促進VICs的成骨分化和鈣沉積[25]。IL-17由Th17細胞釋放，在動脈粥樣硬化病理機制中扮演重要作用[26]。在主動脈瓣炎癥模型中，IL-17與巨噬細胞中的IL-17受體的結(jié)合促進了巨噬細胞NF-κB通路激活，并誘導了VICs的肌成纖維細胞樣分化[2]。

IL-37是一種潛在的炎癥抑制因子，能夠通過NF-κB和Notch通路抑制M1巨噬細胞極化，并激活M2巨噬細胞，從而發(fā)揮抗炎作用，延緩CAVD的鈣化過程[27-28]。而鈣化瓣膜中發(fā)現(xiàn)IL-37的表達較低，IL-37調(diào)節(jié)巨噬細胞極化和減輕瓣膜炎癥的功能減弱，這可能與主動脈瓣鈣化機制相關(guān)[27]。TLR7在人主動脈瓣CAVD發(fā)病過程中上調(diào)，并與M2巨噬細胞共定位，在TLR7配體刺激下，巨噬細胞釋放抗炎細胞因子IL-10，并促進主動脈瓣膜組織釋放TNF-α和粒巨噬細胞集落刺激因子等[29]。

5.2 胞外囊泡

巨噬細胞除了直接釋放炎癥因子作用于VICs外，也可通過分泌胞外囊泡的方式參與瓣膜鈣化的進程。Li等[30]的研究表明，M1通過衍生的胞外囊泡將miR-214遞送至VICs并隨后下調(diào)VICs的Twist相關(guān)蛋白1，從而促進主動脈瓣膜鈣化的進展。從單核細胞釋放的外泌體TNF-α可能促進VICs中黏附分子表達的上調(diào)，促進瓣膜炎癥的產(chǎn)生[20]。

5.3 基質(zhì)分解

巨噬細胞在早期主動脈瓣疾病中發(fā)揮蛋白水解活性，在主動脈瓣鈣化中發(fā)揮重要作用。在炎癥主動脈瓣膜中，巨噬細胞衍生的組織蛋白酶S和其他彈性分解酶參與細胞外基質(zhì)的降解，而降解產(chǎn)物的釋放可能會招募更多的巨噬細胞，進一步加重瓣膜炎癥[31]。瓣膜細胞外基質(zhì)的重塑可能導致瓣膜功能障礙，由此產(chǎn)生的流動模式的變化可能誘導成纖維細胞活化為肌成纖維細胞[9]。Joghetaei等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導劑(CD147)在鈣化主動脈瓣中的巨噬細胞表達，并激活鈣化性主動脈瓣狹窄中金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)來誘導蛋白水解，從而促進單核細胞遷移，加速瓣膜炎癥和鈣化。雙糖鏈蛋白聚糖作為一種胞外基質(zhì)蛋白聚糖，在細胞外基質(zhì)水解后通過TLR2和TLR4在培養(yǎng)的巨噬細胞中誘導VICs中ICAM-1和單核細胞趨化蛋白1的表達[33]。巨噬細胞分泌的IL-1和TNF-α能夠刺激肌成纖維細胞表達MMP-1和MMP-2，從而調(diào)節(jié)鈣化性主動脈瓣狹窄中細胞外基質(zhì)的重塑[34]。

6 Notch1突變在巨噬細胞誘導瓣膜鈣化中的作用

患者Notch1突變與CAVD發(fā)病率的升高具有明顯相關(guān)性。Notch1信號表達不足可驅(qū)動巨噬細胞在主動脈瓣的浸潤和成熟并驅(qū)動鈣化進程。Raddatz等[35]的研究表明，Notch1突變導致巨噬細胞暴露的增加可引起信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)剪接的急劇變化，導致抑制性STAT3β剪接產(chǎn)物的減少并促進鈣化進程。而STAT3β能夠結(jié)合RUNX2抑制其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能從而緩解鈣化進程[36]。

7 單核/巨噬細胞的脂質(zhì)清理作用與瓣膜鈣化

鈣化瓣膜中存在ox-LDL，并且它們與巨噬細胞和T細胞共定位，表明瓣膜炎癥過程與氧化修飾脂質(zhì)的存在密切相關(guān)[37]。單核細胞與VICs共培養(yǎng)時，可促進VICs表達ICAM-1、VCAM-1、單核細胞趨化蛋白-1等黏附分子，進而脂蛋白在瓣膜內(nèi)皮細胞下積聚，并被修飾成ox-LDL。在動脈粥樣硬化病變區(qū)域中巨噬細胞攝取ox-LDL并形成泡沫細胞，而在高膽固醇血癥引起的瓣膜硬化中，募集的巨噬細胞同樣吞噬脂質(zhì)，形成泡沫狀外觀并釋放TNF-α[10，37]。脂質(zhì)滲入和泡沫細胞形成后主動脈瓣膜內(nèi)會出現(xiàn)成骨細胞樣細胞并開始鈣化進程[38]。

8 單核/巨噬細胞與其他免疫細胞在瓣膜鈣化中的作用

單核/巨噬細胞同其他免疫細胞之間存在相互作用，在主動脈瓣鈣化進展中發(fā)揮重要作用。單核細胞可衍生為樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)，并聚集在主動脈瓣狹窄病變區(qū)域，在主動脈瓣狹窄中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，然而其具體的作用機制需要進一步的研究[10]。在狹窄的主動脈瓣中，瓣膜內(nèi)存在B細胞，并被證明與狹窄的嚴重程度相關(guān)[39]。B細胞可被巨噬細胞和單核細胞衍生的DCs分泌的B細胞激活因子等細胞因子所活化，從而促進其自身的存活、成熟和增殖[10，40]。在活化巨噬細胞和DCs呈遞的作用下，B細胞可能通過驅(qū)動T細胞活化，促進Th1細胞致動脈粥樣硬化表型激活，且B細胞的積累以及與巨噬細胞的相互作用可能與瓣膜的進行性增厚和鈣化相關(guān)[39]。

9 小結(jié)

CAVD的患病率很高，嚴重影響患者生存質(zhì)量，目前尚無高效的非手術(shù)治療策略或預防方法，而手術(shù)治療面臨著費用昂貴、并發(fā)癥多等問題。單核/巨噬細胞在瓣膜鈣化中扮演重要的作用，然而實驗性高脂血癥動物中單核/巨噬細胞的消耗并不能阻止主動脈瓣病變的形成，并表現(xiàn)出病變區(qū)域脂質(zhì)和膠原含量增加，瓣膜厚度增加[41]。因此，針對巨噬細胞浸潤和極化并改變其表型以適應瓣膜微環(huán)境，以及靶向抑制巨噬細胞炎性因子的釋放，可能是對抑制瓣膜鈣化進程具有效果的治療手段。