任婧瑤，王婧，艾鑫，趙姝麗，李仍媛，蔣春姬，趙新華，殷冬梅，于海秋*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng)，110161；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州，450046）

花生（Arachis hypogaeaL.）是重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物[1]，近年來(lái)在我國(guó)逐漸形成以花生和油菜為主的油料作物種植結(jié)構(gòu)[2]，花生在發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和增加農(nóng)業(yè)供給中的地位日益凸顯。近5 年來(lái)，我國(guó)花生年種植面積均在4365 khm2以上[3]，2018 年花生總產(chǎn)量和花生油產(chǎn)量分別為1733 萬(wàn)噸和294萬(wàn)噸，創(chuàng)歷史新高[4]。繼北方產(chǎn)區(qū)、華南產(chǎn)區(qū)和長(zhǎng)江流域產(chǎn)區(qū)三大花生產(chǎn)區(qū)之后，東北地區(qū)已成為我國(guó)第四大花生產(chǎn)區(qū)[4]，種植面積和產(chǎn)量均有較大程度發(fā)展，而黃曲霉毒素污染風(fēng)險(xiǎn)顯著低于其他產(chǎn)區(qū)，成為公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)花生生產(chǎn)基地[5]。然而，東北地區(qū)春季干旱少雨[6,7]，且地表裸露加速水分流失，因而干旱對(duì)花生的產(chǎn)量和品質(zhì)均可造成嚴(yán)重影響。

通常情況下，植株生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS），如羥基自由基、過(guò)氧化氫、單線(xiàn)態(tài)氧和超氧陰離子自由基[8]。維持在正常濃度的ROS 可作為第二信使，調(diào)控植株體內(nèi)的多種應(yīng)答，如種子萌發(fā)、氣孔開(kāi)閉、細(xì)胞程序性死亡等[9,10]，但當(dāng)植株遭受脅迫時(shí)，活性氧的產(chǎn)生與清除平衡被打破，過(guò)量積累的活性氧可破壞核酸、氧化蛋白質(zhì)并引起脂質(zhì)過(guò)氧化[11]。與此同時(shí)，植物中還可產(chǎn)生其他復(fù)雜的生理應(yīng)答，以減輕干旱脅迫造成的傷害[12]。Arash[13]研究指出，干旱脅迫對(duì)植株的主要傷害是破壞細(xì)胞的膜系統(tǒng)，而植株內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸超氧化物酶（APX）、過(guò)氧化物酶（POD）等保護(hù)酶和抗壞血酸、谷胱甘肽、甘氨酸、甜菜堿、脯氨酸等非酶類(lèi)抗氧化劑能有效清除過(guò)量的活性氧從而維持膜的穩(wěn)定，共同保證植株正常的生長(zhǎng)與代謝活動(dòng)[14,15]。

在前人的研究中，先后有學(xué)者調(diào)查了多種作物，如小麥[16,17]、大豆[18]、苜蓿[19]和老芒麥[20]等在應(yīng)對(duì)干旱脅迫時(shí)的生理響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)不同的作物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)存在差異，不同品種間的調(diào)節(jié)機(jī)制也不盡相同。已有研究表明，干旱脅迫顯著降低花生的主莖高與分枝數(shù)，并影響花生生物量積累。此外，干旱脅迫會(huì)增加花生的根冠比、比葉面積，甚至影響光合色素的含量[21]。在經(jīng)受中度干旱脅迫后，花生的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和收獲指數(shù)均顯著降低[22]。因此，為調(diào)查花生應(yīng)對(duì)干旱脅迫的生理應(yīng)答特性，本研究以4份耐旱性差異的花生品種為試材，測(cè)定分析其干旱脅迫下的ROS 積累與清除系統(tǒng)的變化特征，以期為花生的抗旱育種和耐旱栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

耐旱花生品種農(nóng)花5 號(hào)（NH5）和花育22（HY22）、干旱敏感品種阜花18（FH18）和農(nóng)花16（NH16）均為前期篩選所得耐旱性差異品種[23]。將4個(gè)花生品種種子以0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min 進(jìn)行表面消毒，隨后用蒸餾水洗凈并在室溫下（25～28℃）浸泡8 h，將浸泡后的種子置于培養(yǎng)皿中，在25℃培養(yǎng)箱中催芽24 h，期間用紗布覆蓋并始終保持種子濕潤(rùn)，隨后挑選發(fā)芽均勻一致的種子（芽長(zhǎng)約為種子長(zhǎng)度的二分之一）種植于裝有潔凈沙土的塑料方盆中，方盆規(guī)格為50 cm×35 cm×20 cm，底部留孔，每盆播種30株。在光溫培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，并隔天補(bǔ)充1/2 的Hoagland 培養(yǎng)液保證水分充足，培養(yǎng)室的光/暗周期為16 h/8 h，溫度為28℃/25℃，相對(duì)濕度60%，光照強(qiáng)度為500 μmol·m-2·s-1。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至4 葉期后，在盆中注入適量蒸餾水以使沙土松動(dòng)，隨后立即取花生植株并用尖嘴瓶沖洗根部，后置于吸水紙上蘸干表面水分。將處理好的植株根部浸沒(méi)于20%的PEG6000 溶液模擬干旱脅迫處理，分別于干旱脅迫0 h（CK）、2 h、6 h、12 h、24 h 后取花生倒三葉置于-80℃冰箱中保存用于生理指標(biāo)測(cè)定，取根部鮮樣用于根系形態(tài)觀(guān)測(cè)和根系活力測(cè)定。

1.2 生理指標(biāo)測(cè)定

CAT 活性利用紫外吸收法[24]、POD 活性和SOD活性參照Xing[25]的方法，分別利用氮藍(lán)四唑光化還原法和愈創(chuàng)木酚氧化比色法測(cè)定，APX 測(cè)定參照Anwar[26]的方法，游離脯氨酸含量測(cè)定參照J(rèn)ahantigh[27]的方法，可溶性蛋白含量利用考馬斯亮藍(lán)G250進(jìn)行測(cè)定，根系活力的測(cè)定參照鄭炳松TTC 還原量衡量[28]。葉片中H2O2含量及超氧陰離子清除能力分別使用南京建成生物工程研究所的過(guò)氧化氫測(cè)定試劑盒和抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒。各試驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

作圖使用軟件Excel（2010），用SPSS18.0 進(jìn)行單因素方差分析、變異系數(shù)分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下花生葉片中活性氧的積累與清除

如圖1A 所示，在對(duì)照處理中，4 個(gè)花生品種葉片中H2O2含量在0.13～0.17 mmol/g 之間，其中NH16中顯著低于其余3個(gè)品種，但隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，耐旱品種中，NH5 在脅迫至2 h 時(shí)H2O2含量有較小幅度的上升，為0.20 mmol/g，隨后緩慢下降至接近對(duì)照處理，而HY22 中H2O2的含量相對(duì)穩(wěn)定，在脅迫過(guò)程中維持在0.15～0.18 mmol/g 之間。在2個(gè)干旱敏感品種中，H2O2含量在干旱脅迫至12h處均迅速上升，其中NH16 中顯著高于其余品種，達(dá)到0.32 mmol/g，為CK 的2.4 倍，F(xiàn)H18 次之，含量為0.22 mmol/g。

隨后，測(cè)定了4 個(gè)品種葉片中超氧陰離子清除能力的變化（圖1B）。在對(duì)照處理中，耐旱品種NH5和干旱敏感品種NH16 的超氧陰離子清除能力較高，而耐旱品種HY22 和干旱敏感品種FH18 的超氧陰離子清除能力較低，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，耐旱品種中的抗氧化活力呈逐漸上升后緩慢下降的趨勢(shì)，并始終處于相對(duì)較高的水平（2.3～3.9 U/g）；而干旱敏感品種中，NH16 的超氧陰離子清除能力初始值較高，但在受到干旱脅迫后迅速下降，在脅迫6 h～8 h 后顯著低于耐旱品種；FH18 在整個(gè)干旱脅迫過(guò)程中的超氧陰離子清除能力始終較低（2.0～2.8 U/g），并呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。

圖1 不同花生品種ROS積累與清除能力的差異Fig.1 Difference of ROS accumulation and scavenging ability of peanut varieties

2.2 干旱脅迫對(duì)花生根系的影響

如圖2A所示，在未受干旱脅迫之前的花生根系舒展，須根較多，水分狀態(tài)良好，以20%的PEG6000溶液處理24 h 后，HY22 的根系有輕微萎蔫，NH5 的根系輕微變黃脫水。與耐旱品種相比，干旱敏感的品種NH16 和FH18 根系變黃、脫水萎縮嚴(yán)重，根尖處有局部干枯壞死現(xiàn)象。

同時(shí)，花生的根系活力受到了干旱脅迫影響，如圖2B 所示，在干旱處理2 h～6 h 之內(nèi)，NH5 和HY22 的根系活力較高，隨后HY22 較為穩(wěn)定，始終在140～170 mg/（g·h）之間，而NH5 緩慢下降，在干旱脅迫24 h 后下降至103 mg/（g·h），但二者的根系活力始終顯著高于干旱敏感品種。FH18在CK中根系活力較高，在受到干旱脅迫后迅速下降，NH16 的根系活力在CK 中較低，在脅迫至12 h 后有小幅度的上升，但隨后下降并顯著低于耐旱品種。

圖2 干旱脅迫下花生根系特性的變化Fig.2 Changes of root characteristics of peanut under drought stress

2.3 花生葉片中酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

在受到干旱脅迫后，不同花生品種葉片中的SOD 活性存在較大差異（圖3A），其中HY22 的SOD活性較穩(wěn)定，且始終顯著高于其余品種，其次為NH5，在干旱脅迫12 h內(nèi)活性較穩(wěn)定，在24 h處理中有所升高。NH16 和FH18 的SOD 活性始終較低，NH16 在脅迫至24 h 后有較大的幅度上升，但仍顯著低于耐旱品種，而FH18 中SOD 活性較低且變化不顯著。

NH5、HY22 和NH16 的POD 活性在對(duì)照處理中較低，隨著干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸上升，其中NH5 活性最高，維持在3473～5156 U/g 之間，HY22的活性上升幅度最大（2448～4560 U/g），NH16 的活性最低，在1248～2801 U/g 之間。FH18 的POD 活性在對(duì)照處理下顯著高于其余品種，但在處理至12 h時(shí)快速下降，在24 h后顯著低于耐旱品種（圖3B）。

如圖3C 所示，NH5、FH18、HY22 的CAT 活性均顯著高于NH16，其中6～24 h NH5的CAT 活性最高，在845～958 U·g-1·min-1之間，顯著高于其余品種，而FH18 與HY22 的CAT 活性差異不顯著。NH16 活性始終低于其余3 個(gè)品種，但其CAT 活性持續(xù)上升且幅度最大，在處理24 h后為CK的5.0倍。

圖3 干旱脅迫下不同花生葉片保護(hù)酶活性的變化Fig.3 Changes of protective enzyme activity in peanut leaves under drought stress

HY22 與NH5 中APX 活性在干旱處理6 h 時(shí)差異不顯著，并整體上在0～24 h 處理過(guò)程中變化范圍較小。兩個(gè)干旱敏感品種中，F(xiàn)H18 的APX 活性變化較小，而NH16 中APX 活性隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，但FH18和NH16的APX 活性始終顯著低于耐旱品種。

2.4 花生葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在干旱脅迫過(guò)程中具有重要作用，本研究測(cè)定了干旱脅迫下4 個(gè)花生品種葉片中可溶性蛋白含量的變化，如圖4A所示，HY22中可溶性蛋白含量持續(xù)上升且始終顯著高于其余品種，在24 h 處理時(shí)含量最高，為66 mg/g，其次是FH18，可溶性蛋白含量為對(duì)照處理的2.0倍。

在受干旱脅迫后，各花生品種中的脯氨酸含量均有上升趨勢(shì)（圖4B），其中NH5 的脯氨酸含量最高，在24 h 處達(dá)到峰值，為456 μg/g，F(xiàn)H18 在干旱脅迫過(guò)程中呈先下降后上升的趨勢(shì)，同樣在24 h 處含量最高，為444 μg/g，與NH5 差異不顯著。HY22 在CK中的游離脯氨酸含量較低，但在24 h干旱處理內(nèi)持續(xù)上升，24 h 后含量為CK 的4.2 倍。而在NH16中，脯氨酸含量在12 h 處達(dá)到最高值242 μg/g，隨后下降至143 μg/g。

圖4 干旱脅迫下花生葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of osmotic regulation substance content in peanut leaves under drought stress

2.5 花生中各生理指標(biāo)的變異系數(shù)

為了明確不同花生品種遭遇干旱脅迫后調(diào)控機(jī)制的差異，對(duì)各個(gè)生理指標(biāo)的變異系數(shù)進(jìn)行了分析。如表1 所示，花生耐旱品種NH5 和HY22 的各個(gè)生理指標(biāo)中均以脯氨酸含量變異系數(shù)最高，分別為31.74%和72.04%，兩個(gè)干旱敏感品種FH18 和NH16 中，變異系數(shù)最高分別為脯氨酸含量（37.89%）和CAT活性（53.36%）。并且，在NH16中SOD 活性、POD 活性和CAT 活性、APX 活性變異系數(shù)均遠(yuǎn)高于耐旱品種，但其平均值較低，表明NH16葉片中保護(hù)酶類(lèi)的活性調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)，但自身活性較低。此外，NH16 和FH18 中H2O2含量的變異系數(shù)遠(yuǎn)大于耐旱品種且平均值更高，表明干旱敏感品種葉片中的H2O2含量升高更多，細(xì)胞受到活性氧毒害更為嚴(yán)重。

表1 不同花生品種各生理指標(biāo)的變異系數(shù)Table 1 Coefficient of variation of physiological indexes in different peanut varieties

2.6 花生葉片中各生理指標(biāo)相關(guān)性分析

本研究針對(duì)干旱脅迫下花生中的H2O2含量、超氧陰離子清除能力與各種酶類(lèi)、非酶類(lèi)抗氧化劑及根系活力等各指標(biāo)之間進(jìn)行了相關(guān)性分析。根據(jù)皮爾森相關(guān)系數(shù)顯示（圖5），花生葉片中H2O2含量與其余所有指標(biāo)均無(wú)正相關(guān)性，其中與SOD 活性的負(fù)相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)為-0.24，但在0.01水平和0.05 水平未呈顯著相關(guān)。而超氧陰離子清除能力與其他指標(biāo)間的相關(guān)性分析顯示，與之相關(guān)性最大的為APX 活性，相關(guān)系數(shù)為0.6，在0.01 水平上顯著相關(guān)。此外，SOD 活性與APX 活性、可溶性蛋白、根系活力，POD 活性與CAT 活性、可溶性蛋白，CAT活性與APX 活性、可溶性蛋白、脯氨酸，APX 活性與根系活力之間在0.01水平上均呈極顯著的正相關(guān)，表明各指標(biāo)間存在信息重疊。

圖5 花生葉片中各生理指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)矩陣Fig.5 Correlation matrix of physiological indexes in peanut leaves

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，干旱是制約農(nóng)作物生長(zhǎng)的主要因素之一，因此對(duì)作物響應(yīng)干旱脅迫的研究受到廣泛關(guān)注[29,30]?；ㄉ鳛橐环N耐旱、耐瘠薄的重要作物，具有明顯的比較效益，種植面積逐年上升，但由于花生多種植于干旱、半干旱地區(qū)，季節(jié)性缺水常會(huì)造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降[31]。在眾多解決方案中，提高花生品種的耐旱性是最為經(jīng)濟(jì)有效的方式之一，因此明確花生品種對(duì)干旱脅迫的生理應(yīng)答特性，對(duì)于促進(jìn)花生生產(chǎn)具有重要意義。

在遭遇干旱脅迫時(shí)，植株體內(nèi)ROS 系統(tǒng)的平衡首先被打破，ROS 積累會(huì)對(duì)大分子造成氧化損傷，改變膜的流動(dòng)性，影響離子轉(zhuǎn)運(yùn)，并造成蛋白質(zhì)和DNA 損傷等[32,33]。本研究測(cè)定了花生植株活性氧清除的能力，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在受到干旱脅迫之后，4個(gè)花生品種的H2O2含量均有所升高，但耐旱品種中上升幅度較小并且恢復(fù)較快，而干旱敏感品種中的含量變化較大，同樣花生中超氧陰離子清除能力測(cè)定顯示，耐旱品種具有較強(qiáng)的抗氧化能力，甚至在干旱脅迫下有所增強(qiáng)，而敏感品種的抗氧化活力本身較低，并且在遭遇干旱時(shí)逐漸下降，顯示出品種間應(yīng)答機(jī)制存在的巨大差異。此外，通過(guò)皮爾森相關(guān)系數(shù)分析顯示，超氧陰離子清除能力與APX 活性的相關(guān)性最大。APX 是一種重要的抗氧化酶，研究表明APX 基因沉默的水稻植株H2O2積累過(guò)度并且膜脂受損嚴(yán)重[34]。在本研究中，NH5 中APX 活性最高，其次是HY22，在所有測(cè)定節(jié)點(diǎn)均顯著高于干旱敏感品種，因此推測(cè)APX 在提高花生耐旱能力上具有重要作用，是調(diào)節(jié)花生體內(nèi)活性氧平衡的重要保護(hù)酶。而APX 作為一種清除H2O2的抗氧化酶，在本研究中與H2O2含量的負(fù)相關(guān)性不顯著，相關(guān)系數(shù)僅-0.11，并且其他測(cè)定指標(biāo)與H2O2間均無(wú)顯著相關(guān)性。Kar[14]的研究認(rèn)為植株體內(nèi)的CAT 和POD 等多種酶均參與到H2O2的清除過(guò)程，協(xié)同合作共同維持H2O2穩(wěn)定，解釋了本研究中無(wú)單一生理指標(biāo)與H2O2顯著相關(guān)的原因。

通過(guò)變異系數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在NH5、HY22和FH18中，變異系數(shù)最大的生理指標(biāo)均為游離脯氨酸含量（表1）。游離脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，不僅能降低細(xì)胞水勢(shì)，維持細(xì)胞膨壓，還能有效清除活性氧[35]。在牽?；ǖ脑囼?yàn)中表明干旱脅迫誘導(dǎo)牽?；ㄖ蟹e累大量的脯氨酸，并且脯氨酸積累更多的轉(zhuǎn)基因植株存活率顯著高于野生型[36]。干旱脅迫下，游離脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包圍在蛋白質(zhì)周?chē)?，使其免受?xì)胞中不穩(wěn)定分子的干擾，從而維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定[37]。在花生中，耐旱與干旱敏感品種中脯氨酸含量均顯著上升，是對(duì)照處理的1.3～4.2 倍，但耐旱品種中脯氨酸含量上調(diào)更高，表明脯氨酸在花生耐旱進(jìn)程中起到重要作用，因此耐旱品種在干旱脅迫下更能維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定，保證各生物進(jìn)程正常進(jìn)行?？扇苄缘鞍鬃鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在干旱脅迫過(guò)程中同樣有所上升，而不同的是，在敏感品種FH18 中可溶性蛋白含量高于耐旱品種NH5，意味著干旱敏感品種的個(gè)別性狀甚至優(yōu)于耐旱品種。在關(guān)于木薯干旱脅迫下的生理響應(yīng)的研究中，發(fā)現(xiàn)其脯氨酸含量和可溶性蛋白含量均顯著上升[38]，表明植物在遭受干旱脅迫時(shí)脯氨酸和可溶性蛋白含量上升已在多物種中得到證實(shí)。此外，研究發(fā)現(xiàn)干旱敏感品種NH16 的CAT 活性、SOD 活性、APX 活性和POD 活性等變異系數(shù)均遠(yuǎn)高于耐旱品種，但平均值很低，而耐旱品種中酶活性很高，但受干旱脅迫的影響相對(duì)較小。表明敏感品種在干旱脅迫下保護(hù)酶的調(diào)控能力較強(qiáng)，但整體活性較低，而耐旱品種則相反。保護(hù)酶在品種間存在響應(yīng)趨勢(shì)和活性大小上的差異。

4 結(jié)論

干旱脅迫對(duì)花生體內(nèi)的生理應(yīng)答具有明顯影響，并且品種間存在較大差異。耐旱性花生品種的根系活力和形態(tài)特征優(yōu)于敏感品種。保護(hù)酶活性在耐旱花生品種中始終保持較高水平且相對(duì)穩(wěn)定，受干旱脅迫影響較小，而在干旱敏感品種中易受到干旱脅迫影響。游離脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積極響應(yīng)干旱脅迫，在不同花生品種中均有明顯積累，但品種間存在較大差異。本研究較為系統(tǒng)地探究了不同花生品種在干旱脅迫下的生理應(yīng)答機(jī)制，為花生耐旱性的理論研究提供重要參考，并有利于花生耐旱性品種選育進(jìn)程的推進(jìn)。