張格陽(yáng) 張子敬 翟亞瑩 呂世杰 朱肖亭 朱進(jìn)華 李崢 于翔 王紅利 施巧婷 閆祥洲 王二耀*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450008；4.河南省動(dòng)物檢疫總站，河南鄭州 450000；5.河南省郟縣紅牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，河南平頂山 467100）

基因編輯（geneediting）簡(jiǎn)單講是通過(guò)對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾、定位敲除以及插入目的基因片段來(lái)改變其特征和功能的技術(shù)。目前，鋅指核酸內(nèi)切酶（zincfingerendonuclease，ZFN）、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TAL ENs）和新型基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是3 種主要基因編輯技術(shù)。近年來(lái)，基因編輯技術(shù)取得了喜人的進(jìn)展，被越來(lái)越多的人熟知和關(guān)注。除了廣泛應(yīng)用于人類(lèi)生命科學(xué)研和及臨床應(yīng)用外，在畜牧業(yè)也有應(yīng)用。

畜牧業(yè)作為支撐我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的支柱之一，不僅是實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)繁榮的重要內(nèi)容，也是發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)的關(guān)鍵途徑。高效精準(zhǔn)的基因編輯技術(shù)為研究家畜的疾病機(jī)制和培育良好品質(zhì)品種家畜提供了強(qiáng)有力的“武器”。在治療家畜疾病方面,通過(guò)特定基因編輯技術(shù)在DNA 水平上使用能良好表達(dá)的基因來(lái)替換或補(bǔ)償致病基因突變，抑或是切除致病性基因,從而達(dá)到治療疾病的目的。在家畜遺傳育種方面，與傳統(tǒng)育種方式不同，在有一定安全性保障的同時(shí)，根據(jù)人們的不同需求，借助基因編輯技術(shù)在指定位置對(duì)基因?qū)嵤┒c(diǎn)編輯。一方面極大縮短了育種時(shí)間，另一方面也降低了育種過(guò)程中的人力、物力、財(cái)力成本[1]。

1 主要基因編輯技術(shù)

1.1 鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)

鋅指核酸酶（ZFN）：由DNA 識(shí)別域鋅指蛋白（Zinc-Finger Protein，ZFP）（負(fù)責(zé)識(shí)別）與DNA 切割域限制性核酸內(nèi)切酶FokI（負(fù)責(zé)切割）構(gòu)成。

機(jī)理：ZFN 作為人工合成的限制性內(nèi)切酶通過(guò)其鋅指DNA 結(jié)合域、DNA 切割域發(fā)揮作用。研究者通過(guò)改造DNA 結(jié)合域，靶向定位于不同的DNA 序列，再由DNA 切割域進(jìn)行特異性切割。此外，ZFN 技術(shù)還可與細(xì)胞內(nèi)DNA 修復(fù)機(jī)制共同發(fā)揮作用，使研究者自由編輯基因組。

鋅指核酸酶（ZFNs）在基因靶向修飾方面起到促進(jìn)作用，盡管如此，為了彌補(bǔ)鋅指基序與其靶序列間缺乏特異性缺陷，構(gòu)建大型文庫(kù)用來(lái)篩選能與靶點(diǎn)序列特異性結(jié)合的鋅指蛋白是必不可少的步驟。與此同時(shí)，該技術(shù)的弊端還有易脫靶、細(xì)胞死亡、額外突變等[2]。

1.2 類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)

類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）：TALEN 為第二代基因組編輯核酸酶。TAL 效應(yīng)因子（TALE）可以特異性結(jié)合目的序列，通過(guò)將一段人造TALE 與FokI 核酸酶連接起來(lái)，即組成了TALEN，一類(lèi)具有特異性基因組編輯功能的強(qiáng)大工具。

與ZFNs 技術(shù)相比，因?yàn)門(mén)ALEN 具有高度特異性，能與DNA 靶位點(diǎn)結(jié)合，大大降低了功能蛋白脫靶的幾率。并且與ZFNs 相比，TALEN 具有靈活性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、構(gòu)建更便捷、脫靶效應(yīng)和細(xì)胞毒性低等優(yōu)勢(shì)。但裝配TALEN 模塊是一個(gè)高強(qiáng)度、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的過(guò)程。

1.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)

CRISPR 序列由眾多短而保守的重復(fù)序列（repeats）和間隔區(qū)（spacer）組成。間隔區(qū)是一些可變序列，其與先前入侵細(xì)菌基因組外的外源遺傳物質(zhì)的序列相對(duì)應(yīng)。這些間隔序列儲(chǔ)存在細(xì)菌基因組內(nèi)，被看作是通過(guò)再感染來(lái)觸發(fā)降解入侵病毒DNA 的記憶機(jī)制。

機(jī)理：①具有核酸酶活性的Cas9 蛋白質(zhì)在sgRNA 引導(dǎo)下特異性地識(shí)別原間隔序列的相鄰序列。②Cas9 蛋白質(zhì)到達(dá)目標(biāo)DNA 的指定部位后，發(fā)揮核酸酶作用，切斷DNA 雙鏈，引起雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）。③雙鏈dna 盾斷裂后啟動(dòng)細(xì)胞自我復(fù)原系統(tǒng)，利用非同源末端的連接復(fù)原（non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重組修復(fù)（homology dependent repair，HDR）兩種方式的基因修復(fù)。研究人員可以導(dǎo)入外源基因，通過(guò)同源重組將目標(biāo)基因重組為目標(biāo)基因，并通過(guò)在接收細(xì)胞中表達(dá)外源基因來(lái)進(jìn)行基因編輯。

CRISPR-Cas9 技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于構(gòu)建和使用時(shí)非常簡(jiǎn)單、方便和低成本，使用它可以用來(lái)同時(shí)瞄準(zhǔn)多個(gè)基因的優(yōu)勢(shì)，可以逐條甚至批量檢測(cè)人類(lèi)或動(dòng)物基因組中的基因表達(dá)和互做情況,以明確基因的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。但易脫靶一直是CRISPR-Cas9 技術(shù)亟待解決的問(wèn)題。

2 基因編輯技術(shù)在畜牧業(yè)上的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)為畜牧業(yè)發(fā)展做出了極大貢獻(xiàn)。在改良生產(chǎn)性能方面，基因編輯技術(shù)通過(guò)改造動(dòng)物基因組，大力改良畜禽經(jīng)濟(jì)性狀，加快生長(zhǎng)速度，提高飼料利用率等。在改善肉質(zhì)方面，為達(dá)到人們對(duì)肉質(zhì)的需求，基因編輯方法既可以降低動(dòng)物脂肪量，也可以降低其肌肉質(zhì)量；在提高家畜抗病力方面，開(kāi)發(fā)具有抗藥性的新物種，增加動(dòng)物基因適應(yīng)性，減少抗生素使用，促進(jìn)人類(lèi)健康和環(huán)境保護(hù)的研究；在構(gòu)建疾病模型方面，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用既能開(kāi)發(fā)人類(lèi)疾病模型，也有助于理解疾病的運(yùn)作機(jī)理和治療方法。

2.1 豬

全世界第一例POSA26 定點(diǎn)基因敲入豬模型來(lái)源于2014 年Li 等采用了TALEN 介導(dǎo)的基因敲入技術(shù)獲得的結(jié)果[3]。賴良學(xué)等開(kāi)發(fā)了ZFN 和TALEN 靶向技術(shù)，并將其應(yīng)用于豬基因組修飾中[4]。該研究小組通過(guò)ZFN 獲得了PPARγ 基因敲除豬。研究小組又使用TALEN 技術(shù)將一對(duì)外來(lái)loxp 引入豬基因組的ROSA26 位點(diǎn)，可以將任意的基因通過(guò)重組酶介導(dǎo)插入到ROSA26 的位點(diǎn)處，并且在豬組織中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的無(wú)差異表達(dá)。Yang 等用ZFN 技術(shù)分別得到敲除GGTA1（α 1,3-galactosyltransferase）基因和PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）基因的克隆豬，并且在原代細(xì)胞中觀察到雙等位基因失活的比率達(dá)到1%，這比之前同源重組的打靶效率高10000 倍[5]。中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪等研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，利用“一步法” 直接將切割v WF 基因的CRISPR-Cas9 系統(tǒng)注射到豬受精卵中，該方法非常便利、安全和高效[6]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除豬以及相應(yīng)的宿主細(xì)胞中CD163 全蛋白或者是病毒互相作用的SRCR5 區(qū)基因，可以使其對(duì)I 型和II 型的PRRSV 分離株產(chǎn)生抵抗力。2018 年，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)吳珍芳帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)將CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)與體細(xì)胞核移植（Somatic Cell nuclear transfer，SCNT）相結(jié)合，獲得了一頭敲除CD163 基因的杜洛克豬[7]。2018 年，研究人員利用CRISPR/Cas9 將靶向非洲豬瘟（ASFV）磷蛋白p30（ASFV-p30）導(dǎo)入病毒體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由ASFV 引起的空斑完全消失，且毒力下降4 個(gè)數(shù)量級(jí)。2014 年，Hai 等通過(guò)卵顯微注射和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)組合的辦法成功獲得血管性血友病因子（vWF）雙等位基因敲除的小型豬[8]。Yu 等利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得了可用于研究杜興氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne Muscular Dystrophy，DMD）基因敲除肌營(yíng)養(yǎng)不良癥疾病模型[9]。Zhou 等采用顯微注射技術(shù)，分別將豬酪氨酸酶基因、PARK12 基因以及PINK1 基因的gRNA 和Cas9 調(diào)至豬成纖維細(xì)胞中，順利獲得敲除這些基因后的純合子細(xì)胞[10]。并且把經(jīng)人工篩選出來(lái)的敲除酪氨酸酶基因純合子當(dāng)做供體，經(jīng)由體細(xì)胞核移植后得到因敲除酪氨酸酶基因本應(yīng)為黑色的表現(xiàn)為白的版納豬。研究人員利用CRISPR/Cas9 技術(shù)也在豬成纖維細(xì)胞中成功進(jìn)行了肌肉生長(zhǎng)抑制素基因敲除，為建立基因敲除的克隆豬和新豬種培育打下了基礎(chǔ)。2015 年，Cui 等利用ZFNs 技術(shù)成功敲除了豬的生長(zhǎng)激素受體（growth hormone receptor，GHR）基因，該試驗(yàn)為進(jìn)一步研究人類(lèi)侏儒綜合征提供了理想的動(dòng)物模型[11]。

2.2 牛、羊

張存芳研究表明，利用ZFN 技術(shù)將雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）引入羊肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）基因，誘導(dǎo)細(xì)胞自身固有的非同源末端（non-homologous end-joining，NHEJ）修復(fù)途徑提高M(jìn)STN 基因敲除效率，為通過(guò)胚胎工程手段獲得產(chǎn)肉性能高的轉(zhuǎn)基因家畜奠定基礎(chǔ)[12]。利用ZFN 在牛中高效產(chǎn)生MSTN 雙等位基因突變[13]。

MSTN 屬于TGF-β 超家族，抑制肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)。Luo 等利用組裝后的ZFN 來(lái)破壞編碼肌肉生長(zhǎng)抑制蛋白的牛MSTN 基因，同時(shí)又采用ZFN 技術(shù)誘導(dǎo)基因靶向策略，突變頻率約為20%，雙等位基因突變效率為8%，通過(guò)SCNT 成功獲得了來(lái)自黃牛的MSTN 基因靶向成纖維細(xì)胞克隆牛[13]。在牛、山羊和豬的細(xì)胞基因中導(dǎo)入特異的自然突變體和單核苷酸多態(tài)性（SNP），是Tan 等在2013 年利用TALEN 技術(shù)和同源重組做的研究，如把Celtic 牛的無(wú)角基因POLLED 導(dǎo)入有角的奶牛，將豬、羊的Pc、GDF8、p65 和LDLR基因引入SNP 等[14]。

選定以山羊成纖維細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)后，Ni 等以山羊MSTN 基因、核孔蛋白（NUP）基因、病毒蛋白（PrP）基因以及β-乳球蛋白（BLG）基因?yàn)閷?duì)象設(shè)計(jì)了gRNAs，并且依據(jù)CRISPR/Cas9 技術(shù)同時(shí)編輯了4個(gè)基因，敲除細(xì)胞雙等位基因MSTN 后，又經(jīng)過(guò)體細(xì)胞核移植手段成功獲得基因敲除后的山羊后代[15]。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)呼銳利用CRISPR/Cas9 技術(shù)將Cas9 mRNA 和sgRNA（Single Guide RNA）注射到原核，成功生產(chǎn)出FGF5 基因敲除羊[16]。

3 基因編輯技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用前景

基因編輯技術(shù)解決了家畜育種周期長(zhǎng)和遺傳資源少等問(wèn)題，大大縮短了育種周期，降低育種成本，迅速增加了遺傳多樣性。有了基因編輯技術(shù)的加持，畜禽基因功能的研究和轉(zhuǎn)基因育種變得更加高效。基因編輯技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的整合隨機(jī)、遺傳不穩(wěn)定等缺陷?；蚓庉嫾夹g(shù)前景廣闊，特別是CRISPR/Cas9 技術(shù)因?yàn)槠浜?jiǎn)單、高效、成本低等原因，越來(lái)越多地被研究人員認(rèn)可、使用。采用基因編輯技術(shù)，我們也可以進(jìn)行以下研究和應(yīng)用：①基因遺傳功能和控制方面的基本生物研究；②為提高畜禽生產(chǎn)能力或者質(zhì)量而進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因育種；③轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器；④抗病育種；⑤人類(lèi)疾病的轉(zhuǎn)基因模型；⑥作為異質(zhì)器官移植的供體。

基因編輯技術(shù)正在迅速發(fā)展，其缺陷也正在被研究和攻克?？傆幸惶欤蚓庉媽O大促進(jìn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在畜牧領(lǐng)域的應(yīng)用。