黎若竹 蔡杰 楊俊波 張志榮 李德銖 郁文彬

摘 要：? 分子系統(tǒng)學(xué)研究將傳統(tǒng)梧桐科與錦葵科、木棉科和椴樹科合并為廣義錦葵科，并進(jìn)一步分為9個(gè)亞科。然而，9個(gè)亞科之間的關(guān)系尚未完全明確，且梧桐亞科內(nèi)的屬間關(guān)系也未得到解決。為了明確梧桐亞科在錦葵科中的系統(tǒng)發(fā)育位置，厘清梧桐亞科內(nèi)部屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，該研究對錦葵科8個(gè)亞科進(jìn)行取樣，共選取55個(gè)樣本，基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)，采用最大似然法和貝葉斯分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：（1）廣義錦葵科中，刺果藤亞科和扁擔(dān)桿亞科組成Byttneriina分支，Malvadendrina分支中山芝麻亞科為其他亞科的姐妹群，隨后分出梧桐亞科（WCG、LSC和SSC矩陣構(gòu)成的數(shù)據(jù)集），以及Malvatheca分支（木棉亞科和錦葵亞科）與非洲芙蓉亞科-椴樹亞科的姐妹關(guān)系。（2）在梧桐亞科中，可樂果屬分支（Cola clade）是獨(dú)立一支，隨后是酒瓶樹屬分支（Brachychiton clade）與蘋婆屬分支（Sterculia clade）+ 銀葉樹屬分支（Heritiera clade）形成姐妹關(guān)系（WCG、LSC和CDS矩陣）。（3）在可樂果屬分支中，可樂果屬為梧桐屬（含閉果桐屬）和胖大海屬+舟翅桐屬的姐妹群。該研究基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)基本澄清了廣義錦葵科的亞科系統(tǒng)關(guān)系以及梧桐亞科內(nèi)各屬關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)育樹框架基本明晰，但梧桐亞科在Malvadendrina分支的位置和酒瓶樹屬在梧桐亞科的位置，以及梧桐屬的概念及范圍仍需進(jìn)一步研究，尤其是結(jié)合核基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

關(guān)鍵詞： 梧桐亞科， 梧桐屬， 錦葵科， 系統(tǒng)發(fā)育基因組， 葉綠體基因組

中圖分類號：? Q949

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）01-0025-14

收稿日期：? 2021-03-24

基金項(xiàng)目：? 中國科學(xué)院重大科技基礎(chǔ)設(shè)施開放研究項(xiàng)目（2017-LSF-GBOWS-02）;云南省萬人計(jì)劃“青年拔尖人才” [Supported by the Large-Scale Scientific Facilities of the Chinese Academy of Sciences （2017-LSF-GBOWS-02）; Ten Thousand Talents Program of Yunnan for Top-Notch Young Talents]。

第一作者： 黎若竹（1996- ），碩士研究生，主要研究方向?yàn)楸Ｗo(hù)生物學(xué)，（E-mail）liruozhu@xtbg.ac.cn。

*通信作者：? 郁文彬，博士，研究員，研究方向?yàn)橹参锵到y(tǒng)演化，（E-mail）yuwenbin@xtbg.ac.cn。

Plastid phylogenomics resolving phylogenetic placement and

genera phylogeny of Sterculioideae （Malvaceae s. l.）

LI Ruozhu1，2， CAI Jie3， YANG Junbo3， ZHANG Zhirong3， LI Dezhu3， YU Wenbin1，4，5*

（ 1. Center for Integrative Conservation， Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Mengla 666303， Yunnan， China;

2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 3. The Germplasm Bank of Wild Species， Kunming Institute of Botany， Chinese

Academy of Sciences， Kunming 650201， China; 4. Center of Conservation Biology， Core Botanical Gardens， Chinese Academy of Sciences， Mengla

666303， Yunnan， China; 5. Southeast Asia Biodiversity Research Institute， Chinese Academy of Science， Mengla 666303， Yunnan， China ）

Abstract：? Phylogenetic analyses supported that four traditionally defined families Sterculiaceae， Tiliaceae， Bombacaceae and Malvaceae were subsumed into Malvaceae s.l. and nine subfamilies had been recognized within Malvaceae s.l. However， phylogenetic relationships among the nine subfamilies were not well resolved. Moreover， phylogenetic relationships among genera were also not clear in Sterculioideae. In this study， we reconstructed phylogenetic trees of Malvaceae s.l. based on chloroplast genome sequences from 55 species that representing eight recognized subfamilies for clarifying phylogenetics relationships of subfamilies and Sterculioideae. The results were as follows： （1） Byttnerioideae and Grewioideae formed the Byttneriina clade in Malvaceae s.l. as sister to the Malvadendrina clade which by having Helicteroideae as the first divergent subfamily， followed by Sterculioideae （WCG， LSC and SSC datasets）， and the Malvatheca clade （Bombacoideae + Malvoideae） and the clade Dombeyoideae + Tilioideae as sister. （2） The Cola clade was the first divergent clade in Sterculioideae， then the Brachychiton clade was sister to the clade Sterculia + Heritiera （WCG， LSC and CDS datasets）. （3） In the Cola clade， Cola + Octolobus + Pterygota were the first divergent group， then Firmiana spp. （including Hildegardia） were sister to the clade Scaphium + Pterocymbium. In this study， plastid phylogenomic analyses have well resolved the phylogenetic framework of subfamilies in Malvaceae s.l.， and phylogenetic relationship among genera in Sterculioideae. However， phylogenetic positions of Sterculioideae in the Malvadendrina clade and Brachychiton in Sterculioideae， respectively， as well as the concept and circumscription of Firmiana， need to confirm and further investigate using nuclear genomic data in the future.

Key words： Sterculioideae， Firmiana， Malvaceae， phylogenomics， chloroplast genome

傳統(tǒng)的梧桐科（Sterculiaceae）由Ventenat于1830年建立，模式屬是蘋婆屬（Steculia L.）。梧桐科隸屬于錦葵目（Malvales），是一個(gè)多型的科，擁有多樣的花部特征和果實(shí)類型（徐頌軍和徐祥浩， 2012）。由于缺乏關(guān)鍵的識別特征，不同學(xué)者在梧桐科的范圍和劃分上持有不同觀點(diǎn)，所包含屬種變動(dòng)很大（Cronquist & Takhtajan， 1992; Takhtajan， 2009; 徐頌軍和徐祥浩， 2012）。形態(tài)上，梧桐科與同屬錦葵目的椴樹科（Tiliaceae）、錦葵科（Malvaceae）及木棉科（Bombacaceae）關(guān)系近緣，被認(rèn)為是核心錦葵目（core Malvales）成員。從形態(tài)學(xué)來看，這4個(gè)科的形態(tài)特征十分相似，甚至有所重合，因而這幾個(gè)科的界限也不甚明確（徐頌軍和徐祥浩， 2000）。

分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果表明，錦葵目核心四科中唯有錦葵科是單系，其他3個(gè)科為多系或并系類群（Alverson et al.， 1999; Bayer et al.， 1999）。因?yàn)橹饕抵g的形態(tài)分化水平不足以支持科級分類，所以Bayer等（1999）和Alverson等（1999）建議將4個(gè)科合并為1個(gè)大科，采用Malvaceae作為科名，并綜合考慮形態(tài)特征、生物地理學(xué)信息及系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，將錦葵科內(nèi)部主要的9個(gè)分支處理為亞科等級。錦葵科的9個(gè)亞科分別為木棉亞科（Bombacoideae）、杯萼椴亞科（Brownlowioideae）、刺果藤亞科（Byttnerioideae）、非洲芙蓉亞科（Dombeyoideae）、扁擔(dān)桿亞科（Grewioideae）、山芝麻亞科（Helicteroideae）、錦葵亞科（Malvoideae）、 梧桐亞科（Sterculioideae）以及椴樹亞科（Tilioideae）。刺果藤亞科和扁擔(dān)桿亞科互為姐妹關(guān)系，組成Byttneriina分支，與余下7個(gè)亞科組成的Malvadendrina分支互為姐妹關(guān)系（Baum et al.， 1998; Alverson et al.， 1999）。在Malvadendrina分支內(nèi)部，錦葵亞科與木棉亞科聚為一支，并得到良好支持（boot strap，BS=82%），這一分支被命名為Malvatheca（Baum et al.， 1998）。9個(gè)亞科的單系性及Byttneriina和Malvadendrina兩大分支在后續(xù)的研究中都得到了支持（Nyffeler et al.， 2005; Hernandez-Gutierrez & Magallon， 2019; Wang et al.， 2021）。在Malvadendrina分支內(nèi)部，最先得到確定的是錦葵亞科和木棉亞科的姐妹關(guān)系（Alverson et al.， 1999; Baum et al.， 2004），其他亞科的系統(tǒng)位置則因取樣的多少及使用的基因片段不同而發(fā)生變動(dòng)（Nyffeler et al.， 2005; Conover et al.， 2019; Hernandez-Gutierrez & Magallon， 2019）。葉綠體基因組較基因片段包含更為豐富的遺傳變異信息，如今測序技術(shù)日臻完善，測序成本隨之降低，葉綠體基因組也被用于解決錦葵科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（Wang et al.， 2021）。通過對錦葵目的39個(gè)葉綠體基因組（包括錦葵科8個(gè)亞科，缺少杯萼椴亞科）劃分的不同數(shù)據(jù)集進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，Wang等（2021）確定了山芝麻亞科處在Malvadendrina分支基部，為其他亞科的姐妹群，椴樹亞科和非洲芙蓉亞科為姐妹關(guān)系。然而，梧桐亞科與Malvatheca分支，及椴樹亞科-非洲芙蓉亞科分支之間的關(guān)系尚未得到解決。

基于現(xiàn)有分子系統(tǒng)學(xué)證據(jù)，傳統(tǒng)梧桐科的屬主要分散在刺果藤亞科、非洲芙蓉亞科、山芝麻亞科中，另有一屬（Fremontodendron Coville）被歸入木棉亞科，只有原蘋婆族（Sterculieae）及蝴蝶樹族（Tarritieae）的部分屬為梧桐亞科的主要成員（Bayer & Kubitzki， 2003）。新界定的梧桐亞科包含12～13屬，主要取決于是將Argyrodendron F. Muell.并入銀葉樹屬（Heritiera Aiton），還是作為一個(gè)獨(dú)立的屬（Bayer & Kubitzki， 2003; Wilkie et al.， 2006）。梧桐亞科的單系性得到了分子系統(tǒng)學(xué)和形態(tài)學(xué)證據(jù)的共同支持。在形態(tài)結(jié)構(gòu)上，梧桐亞科各屬以無花瓣的花、花瓣?duì)畹妮嗥?、心皮離生、具雌雄蕊柄等共有特征和其他亞科區(qū)分開來（Bayer et al.， 1999; Bayer & Kubitzki， 2003）。包含梧桐亞科各屬的ndhF基因所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，梧桐亞科內(nèi)部分為四個(gè)分支，即可樂果屬分支（Cola clade）、酒瓶樹屬分支（Brachychiton clade）、蘋婆屬分支（Sterculia clade）及銀葉樹屬分支（Heritiera clade）（Wilkie et al.， 2006）。然而，這四個(gè)分支之間的關(guān)系尚未得到解決，且分支內(nèi)部屬間關(guān)系尚不明確，有待進(jìn)一步探究。

本研究通過對錦葵科各亞科尤其是梧桐亞科進(jìn)行取樣，盡可能多地獲取淺層測序數(shù)據(jù)及葉綠體基因組數(shù)據(jù)，利用葉綠體基因組數(shù)據(jù)重建錦葵科及梧桐亞科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期明確梧桐亞科在錦葵科中的系統(tǒng)發(fā)育位置，并厘清梧桐亞科內(nèi)部屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料采集與數(shù)據(jù)來源

（1）葉綠體基因組數(shù)據(jù)的獲取：從活植株上采集無病蟲害的幼嫩葉片，經(jīng)硅膠干燥后，用于DNA的提取及測序。本研究新測了錦葵科19屬的29種植物的葉綠體基因組數(shù)據(jù)，并從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載了26個(gè)錦葵科及1個(gè)紅木科的葉綠體基因組數(shù)據(jù)，共計(jì)56個(gè)樣本用于分析。其中，55個(gè)錦葵科樣本中代表了8個(gè)亞科35屬55種，缺少杯萼椴亞科（Bayer & Kubitzki， 2003），涵蓋原梧桐科的26個(gè)屬（徐頌軍和徐祥浩，2012）。樣本具體信息詳見表1。

（2）葉綠體片段數(shù)據(jù)的來源：為了進(jìn)一步闡明梧桐屬（Firmiana Marsili）與閉果桐屬（Hildegardia Schott & Endl.）之間的關(guān)系，在Wilkie等（2006） 的取樣基礎(chǔ)上，增加了matK和rbcL基因片段進(jìn)行聯(lián)合分析。數(shù)據(jù)主要從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載，并從本研究選取的葉綠體基因組數(shù)據(jù)樣本中提取相應(yīng)片段進(jìn)行補(bǔ)充，詳見表1。

1.2 DNA提取及測序

DNA的提取采用改良CTAB法（Doyle JJ & Doyle JL， 1987），從硅膠干燥后的DNA分子材料中提取總DNA。用于文庫構(gòu)建的DNA質(zhì)量要求為總DNA含量≥1.5 μg，濃度≥20 ng·μL-1。每個(gè)樣品的總DNA為0.2 μg，通過超聲波將DNA隨機(jī)打斷成350 bp 或500 bp左右的片段，之后對DNA末端進(jìn)行修飾補(bǔ)齊。接著給每個(gè)樣品添加標(biāo)簽混合建庫，每個(gè)物種確保獲取4～5 G的測序數(shù)據(jù)。純化后的DNA于Illumina測序平臺(tái)上進(jìn)行雙末端測序，采用的測序策略為PE150或PE250，即單端測序reads長度為150 bp或250 bp。由中國科學(xué)院昆明植物研究所中國西南野生生物種質(zhì)資源庫和天津諾禾致源公司的Mi-Seq和Nova-Seq 6600高通量測序儀進(jìn)行測序。

1.3 細(xì)胞器基因組數(shù)據(jù)組裝及注釋

高通測序獲得的原始數(shù)據(jù)直接利用GetOrganelle軟件包（Jin et al.， 2020）進(jìn)行組裝，并自動(dòng)輸出完整的環(huán)狀葉綠體基因組。若未能輸出環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可通過Bandage查看，手動(dòng)對剔除非目的contigs后的FASTG文件進(jìn)行編輯，輸出可靠的葉綠體基因組的contigs或scaffolds，之后利用手動(dòng)校正和拼接成完整的葉綠體基因組。葉綠體基因組的注釋以發(fā)表的云南梧桐（NC_037242）為參考序列，通過Geneious（https：//www.geneious.com）進(jìn)行基因組的相似性注釋，并結(jié)合ORF（open reading frames）進(jìn)行校正。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

葉綠體全基因組和DNA片段分別進(jìn)行比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，用以推斷梧桐亞科與錦葵科其他亞科間以及梧桐亞科內(nèi)部屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)的特征，本研究構(gòu)建了5個(gè)數(shù)據(jù)集矩陣進(jìn)行分析：（1）葉綠體全基因組（whole chloroplast genome，WCG）;（2）蛋白質(zhì)編碼區(qū)（coding sequence， CDS）;（3）大單拷貝區(qū)（large single copy region，LSC）;（4）小單拷貝區(qū)（small single copy region，SSC）;（5）反向重復(fù)區(qū)（inverted repeat region，IR）。為了減少重復(fù)序列的影響，全基因組數(shù)據(jù)集去除了一個(gè)IR區(qū)，CDS數(shù)據(jù)集中所有基因都是唯一的。CDS基因利用Geneious軟件基于基因注釋信息進(jìn)行提取，并使用Geneious的Mafft Multiple Aligenment插件對每個(gè)基因進(jìn)行單獨(dú)比對，再通過concantenate_fasta.py（https：//github.com/Kinggerm/PersonalUtilities）將CDS基因串聯(lián)起來，用于矩陣的構(gòu)建。數(shù)據(jù)矩陣和注釋質(zhì)體基因組序列已上傳到Figshare共享平臺(tái)（Https：//doi.org110.6084/mq.figshare.14308682）。

所有用于系統(tǒng)發(fā)育的葉綠體基因片段或全基因組（僅保留一個(gè)IR）數(shù)據(jù)矩陣，均先使用MAFFT Online version（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/server/）進(jìn)行矩陣比對。比對結(jié)果于Geneious（Kearse et al.， 2012）進(jìn)行查看，如有需要?jiǎng)t對其進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整和校正，之后再用于系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建于CIPRES平臺(tái)（http：//www.phylo.org）上進(jìn)行。所有數(shù)據(jù)集均采取最大似然法（maximum likelihood，ML），選用RAxML 8.2.12工具，選擇了GTRCATI模型，并設(shè)置1 000次靴帶值估算分支的支持率（BS）。此外，葉綠體全基因組（WCG）、CDS數(shù)據(jù)集及用于推斷可樂果屬分支系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的葉綠體基因片段還進(jìn)行了貝葉斯分析（Bayesian inference，BI）。貝葉斯分析于CIPRES平臺(tái)（Miller et al.， 2010）的Mrbayes 3.2.7a進(jìn)行，最佳替代模型依據(jù)貝葉斯信息準(zhǔn)則（Bayesian information criterion），通過jModeltest2 2.1.6（Darriba et al.， 2012）來確定。四條馬爾科夫-蒙特卡洛鏈（Markov Chain Monte Carlo）運(yùn)行了20萬或50萬代，每100代取樣一次，前25%的樹將作為老化樹被丟棄。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組特征

錦葵科29個(gè)新葉綠體基因組都是呈現(xiàn)典型的四分體結(jié)構(gòu)，即包含一個(gè)大單拷貝區(qū)和一個(gè)小單拷貝區(qū)，并由兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)將其分隔開來。錦葵科植物基因組的大小在159 093（Sparrmannia sp.）～165 106 bp（Helicteres isora）范圍內(nèi)變動(dòng)?；蚪M各部分大小范圍如下：LSC區(qū)88 380～90 064 bp;SSC區(qū)19 640～20 774 bp;IR區(qū)25 233～26 784 bp（表2）。

錦葵科植物葉綠體基因組在基因數(shù)量及順序上較為保守，其GC含量也未表現(xiàn)出明顯的差異。錦葵科葉綠體基因組包含113～114個(gè)不重復(fù)基因，由79～80個(gè)編碼基因（僅Guazuma ulmifolia 和Helicteres isora 丟失infA基因）、30個(gè)tRNA基因和4個(gè)rRNA基因組成?；蚪MGC含量范圍為36.5%～37.4%，其中，LSC區(qū)GC含量范圍為34.3%～35.3%，SSC區(qū)GC含量范圍為30.5%～31.9%，IR區(qū)GC含量范圍為41.8%～43.2%。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 矩陣特征 本研究基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)劃分了5個(gè)數(shù)據(jù)集，由此所構(gòu)建的矩陣特征如下：WCG數(shù)據(jù)構(gòu)建的矩陣長度為177 659 bp，包含45 961個(gè)變異位點(diǎn)（variable site）和21 198個(gè)簡約信號位點(diǎn)（parsimony-informative site）。CDS數(shù)據(jù)集構(gòu)建的矩陣長度為74 576 bp，包含15 304個(gè)變異位點(diǎn)和7 040個(gè)簡約信號位點(diǎn)。LSC數(shù)據(jù)集所構(gòu)建的矩陣長度為123 778 bp，包含34 899個(gè)變異位點(diǎn)和16 033個(gè)簡約信號位點(diǎn)。SSC數(shù)據(jù)集所構(gòu)建的矩陣長度為27 633 bp，包含變異位點(diǎn)8 975個(gè)和簡約信號位點(diǎn)4 387個(gè)。IR數(shù)據(jù)集所構(gòu)建的矩陣長度為37 370 bp，包含變異位點(diǎn)2 353個(gè)和簡約信號位點(diǎn)683個(gè)。

基于3個(gè)葉綠體基因片段（ndhF、matK和rbcL）所構(gòu)建的矩陣長度為5 181 bp，包含226個(gè)變異位點(diǎn)和91個(gè)簡約信號位點(diǎn)。

2.2.2 基于葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析 以紅木（Bixa orellana）作為外類群，基于葉綠體基因組各數(shù)據(jù)集，采用最大似然法分別構(gòu)建相應(yīng)的ML樹，系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果如圖1所示。在基于不同數(shù)據(jù)集構(gòu)建的ML樹中，WCG和LSC數(shù)據(jù)集的ML樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致。SSC數(shù)據(jù)集的ML樹在亞科關(guān)系上與WCG、LSC數(shù)據(jù)集表現(xiàn)一致，但在梧桐亞科內(nèi)部存在一些差異;基于CDS數(shù)據(jù)集構(gòu)建的ML樹在亞科關(guān)系上與前三個(gè)數(shù)據(jù)集有所不同，但在梧桐亞科內(nèi)部與WCG、LSC數(shù)據(jù)集呈現(xiàn)一致。IR數(shù)據(jù)集構(gòu)建的ML樹所呈現(xiàn)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)無論是在亞科位置，還是梧桐亞科內(nèi)部屬間關(guān)系上均與WCG、LSC數(shù)據(jù)集存在差異。

錦葵科8個(gè)亞科的單系性得到了除IR數(shù)據(jù)集以外其他四個(gè)數(shù)據(jù)集的支持，同時(shí)Byttneriina和Malvadendrina兩大分支，錦葵亞科和木棉亞科的姐妹關(guān)系（即Malvatheca分支）都得到了所有數(shù)據(jù)集的強(qiáng)烈支持。在IR數(shù)據(jù)集構(gòu)建的ML樹中，榴梿（Durio zibethinus）并未置于山芝麻亞科，而是作為Malvadendrina分支其他屬的姐妹群，隨后為山芝麻亞科的其他屬，但支持率較弱（BS=38%）;除此以外，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與WCG數(shù)據(jù)集的ML樹一致，但大部分節(jié)點(diǎn)支持率偏低。非IR數(shù)據(jù)集中，在Malvadendrina分支內(nèi)部，山芝麻亞科置于基部，為分支內(nèi)余下亞科的姐妹群;椴樹亞科和非洲芙蓉亞科互為姐妹關(guān)系。但是，梧桐亞科、Malvatheca分支，以及椴樹亞科-非洲芙蓉亞科分支間的位置關(guān)系在不同數(shù)據(jù)集中存在分歧。WCG、LSC和SSC數(shù)據(jù)集的ML樹均顯示Malvatheca分支與椴樹亞科-非洲芙蓉亞科分支聚在一起（BSWCG=97%， BSLSC=96%， BSSSC=77%，而在CDS數(shù)據(jù)構(gòu)建的ML樹上Malvatheca與梧桐亞科的關(guān)系更近（BS=81%）。

原梧桐科的屬被分散到錦葵科的四個(gè)亞科中，梧桐亞科的成員主要來自原蘋婆族和蝴蝶樹族，其余屬則被分到刺果藤亞科、非洲芙蓉亞科和山芝麻亞科中（表3）。在梧桐亞科內(nèi)部，各屬的不同樣本均很好地各自聚成單系，可識別到四個(gè)分支，分支名稱沿用Wilkie等（2006） 的命名，即可樂果屬（Cola Schott & Endl.）、梧桐屬（Firmiana Marsili）、胖大海屬（Scaphium Schott & Endl.）及舟翅桐屬（Pterocymbium R. Br.）組成可樂果屬分支;酒瓶樹屬

（Brachychiton Schott & Endl.）、銀葉樹屬（Heritiera）及蘋婆屬（Sterculia L.）三屬各自形成單獨(dú)的分支。在可樂果屬分支內(nèi)，可樂果屬為其他屬的姐妹群，隨后是梧桐屬和胖大海屬-舟翅桐屬的姐妹關(guān)系。蘋婆屬與銀葉樹屬的姐妹關(guān)系在WCG、LSC及CDS構(gòu)建的ML樹上得到高度支持，但在SSC構(gòu)建的ML樹上的支持率較弱;酒瓶樹屬的位置在各ML樹中呈現(xiàn)不一致（圖1）。

BI分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹在結(jié)構(gòu)上與ML分析所產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致。較ML分析而言，基于WCG數(shù)據(jù)集構(gòu)建的BI樹，進(jìn)一步支持了Malvatheca分支與椴樹亞科-非洲芙蓉亞科的近緣關(guān)系（圖2）。與之相反的是，基于CDS數(shù)據(jù)集構(gòu)建的BI樹在Malvatheca與梧桐亞科組成的分支節(jié)點(diǎn)的支持率降低（posterior probability， PP=0.71）。

2.2.3 基于葉綠體片段序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 為了進(jìn)一步探究梧桐屬和閉果桐屬的界限與關(guān)系，我們基于葉綠體基因ndhF、matK和rbcL聯(lián)合矩陣構(gòu)建ML樹和BI樹，重建可樂果屬分支的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（圖3）。增加了matK和rbcL片段的矩陣，Sterc. 梧桐亞科; Dombey. 非洲芙蓉亞科; Til. 椴樹亞科; Bom. 木棉亞科; Malv. 錦葵亞科; M. Malvatheca; Helict. 山芝麻亞科; Bytt. 刺果藤亞科; Grew. 扁擔(dān)桿亞科; O. 外類群。★表示bootstrap值為100%。在A、D中，WCG的bootstrap值標(biāo)注上方，LSC/SSC（CDS）的標(biāo)在下方。

Sterc. Sterculioideae; Dombey. Dombeyoideae; Til. Tilioideae; Bom. Bombacoideae; Malv. Malvoideae; M. Malvatheca; Helict. Helicteroide; Bytt. Byttnerioideae; Grew. Grewioideae; O. Outgroup. ★ indicates that bootstrap value is 100%. In A & D， numbers above the branches indicate bootstrap support values as revealed with WCG， numbers in the below branches indicate bootstrap support values of LSC/SSC（CDS）.

明顯提高了部分節(jié)點(diǎn)的支持率，并依然支持梧桐屬是一個(gè)并系類群，即來自閉果桐屬的Hildegardia barteri與火桐（Firmiana colorata）、馬來火桐（F. malayana）及美麗火桐（F. pulcherrima）聚為一支（BS=81%， PP=0.97），而Hildegardia populifolia與梧桐（Firmiana simplex）、丹霞梧桐（F. danxiaensis）以及云南梧桐（F. major）組成另一支（BS=90%， PP=1.00）。

3 討論與結(jié)論

3.1 錦葵科亞科間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

本研究基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)，用不同的數(shù)據(jù)集分別采用最大似然法和貝葉斯分析進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，在亞科水平上提供了對錦葵科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系更好的理解。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，錦葵科8個(gè)亞科均為單系（IR數(shù)據(jù)集除外），亞科間分為Byttnerrina和Malvadendrina兩大分支，在Malvadendrina分支內(nèi)錦葵亞科與木棉亞科組成Malvatheca分支。這些關(guān)系與前人的研究結(jié)果一致（Bayer et al.， 1999; Alverson et al.， 1999; Nyffeler et al.， 2005; Hernandez-Gutierrez & Magallon， 2019），且得到了各數(shù)據(jù)集的一致支持，

但亞科之間的關(guān)系在數(shù)據(jù)集間存在一定差異。

在Malvadendrina分支內(nèi)，非IR數(shù)據(jù)集構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹都將山芝麻亞科置于該分支基部，作為其他亞科的姐妹群（BS=100%， PP=1.00）。山芝麻亞科的位置與先前基于葉綠體基因數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致（Conover et al.， 2019; Wang et al.， 2021），不過核基因數(shù)據(jù)卻支持非洲芙蓉亞科在這一位置，隨后才是山芝麻亞科與余下亞科的姐妹關(guān)系（Conover et al.， 2019）。同樣利用葉綠體基因片段atpB、matK和ndhF聯(lián)合分析的結(jié)果也支持非洲芙蓉亞科為Malvadendrina分支其他亞科的姐妹群（Nyffeler et al.， 2005）。另有研究表明，非洲芙蓉亞科處在如下位置：（1）與椴樹亞科互為姐妹關(guān)系（Alverson et al.， 1999; Wang et al.， 2021）;（2）作為梧桐亞科-杯萼椴亞科的近緣姐妹群（Bayer et al.， 1999）。在本研究中，包括CDS數(shù)據(jù)集在內(nèi)的所有數(shù)據(jù)集都強(qiáng)烈支持非洲芙蓉亞科和椴樹亞科的姐妹關(guān)系（BS=100%， PP=1.00）。此外，在本研究中，WCG數(shù)據(jù)集的ML分析和BI分析結(jié)果均強(qiáng)烈支持椴樹亞科-非洲芙蓉亞科和Malvatheca分支的姐妹關(guān)系（BS=100%， PP=1.00）。然而，在同樣的分析中，CDS數(shù)據(jù)則與之前多基因片段聯(lián)合分析的結(jié)果一致（Nyffeler et al.， 2005; Hernandez-Gutierrez & Magallon， 2019），這表明梧桐亞科為Malvatheca分支的姐妹群（BS=81%， PP=0.71）。與之相反，Wang et al. （2021） 用葉綠體CDS基因構(gòu)建的錦葵科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系卻顯示梧桐亞科與椴樹亞科-非洲芙蓉亞科分支構(gòu)成姐妹關(guān)系，這種差異可能是取樣差異所造成。

在我們的分析中，WCG和CDS數(shù)據(jù)集的沖突可能源于數(shù)據(jù)的進(jìn)化速率不同。相對基因編碼區(qū)而言，非編碼區(qū)序列擁有更快的進(jìn)化速率，能提供更多具系統(tǒng)學(xué)意義的信息位點(diǎn)（田欣和李德銖，2002）。同時(shí)，數(shù)據(jù)集之間的沖突，也反映出錦葵科演化歷史的復(fù)雜。Malvadendrina分支中亞科之間的莖干枝長較短，表明這些支系可能存在快速分化，適應(yīng)性輻射，由此可能造成不完全譜系分選的發(fā)生（黃原，2012）。此外，該分支還存在全基因組多倍化事件，存在異源多倍體（Conover et al.， 2019）。

在IR數(shù)據(jù)集中，榴梿為該分支其他屬的姐妹群，隨后是山芝麻亞科。盡管在形態(tài)上難以將山芝麻亞科的成員榴梿族（Durioneae）和狹義山芝麻亞科（Helictereteae s. str）聯(lián)系起來，但是山芝麻亞科單系性一直以來都得到分子數(shù)據(jù)的良好支持（Bayer et al.， 1999; Alverson et al.， 1999; Nyffeler et al.， 2005; Hernandez-Gutierrez & Magallon， 2019）。但I(xiàn)R數(shù)據(jù)集中，山芝麻亞科未能形成單系，這與Wang等（2021） 用IR區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹一致。IR數(shù)據(jù)集與其他數(shù)據(jù)結(jié)果的沖突可能是由于與單拷貝區(qū)相比，IR區(qū)的核苷酸替代速率更低 （Zhu et al.， 2016），提供的系統(tǒng)發(fā)育信息有限。

此前，Malvadendrina分支各亞科的關(guān)系一直未能得到完全解決，由于取樣類群和數(shù)據(jù)類型的不同，亞科之間的位置關(guān)系隨之變動(dòng)。Alverson等（1999） 嘗試從形態(tài)學(xué)上為這些亞科的關(guān)系提供一些參考，他們認(rèn)為萼片的離生與合生以及花絲離生或合生成柱可能與亞科的關(guān)系聯(lián)系起來。同時(shí)，他們指出在椴樹亞科和非洲芙蓉亞科中，萼片離生僅在基部稍微連合;反之，杯萼椴亞科、山芝麻亞科、梧桐亞科及Malvatheca的成員萼片合生，呈管狀或鐘狀，常淺裂。另外，雄蕊管（即花絲部分或完全合生）為Malvatheca分支、大部分山芝麻亞科成員，非洲芙蓉亞科及梧桐亞科所共有，可能表明了杯萼椴亞科與椴樹亞科的基本位置。然而在梧桐亞科中也存在花萼分離及合生兩種情況（Tang et al.， 2007），這說明花萼特征可能不是椴樹亞科和非洲芙蓉亞科的共享衍征。從形態(tài)上來看，梧桐亞科被認(rèn)為是Malvatheca分支潛在的姐妹群。因?yàn)閺幕ú啃螒B(tài)來看，梧桐亞科的花藥無柄或近無柄，這與Malvatheca分支中早期分化的成員特征相同（Von Balthazar et al.， 2006），且梧桐亞科和Malvatheca分支中的大多數(shù)屬都缺少在其他亞科中顯著存在的退化雄蕊（Nyffeler et al.， 2005）。但是梧桐亞科與其他亞科相比有其獨(dú)有的特征，即離生心皮、花常單性且無花瓣、具雌雄蕊柄等特征同時(shí)在梧桐亞科植物上出現(xiàn)（Bayer & Kubitzki， 2003; 李德銖等，2020）。山芝麻亞科的單系性一直以來都得到分子數(shù)據(jù)的良好支持，但在形態(tài)上難以將狹義山芝麻亞科和榴梿族聯(lián)系起來。例如雌雄蕊柄是狹義山芝麻亞科最顯著的花部結(jié)構(gòu)，卻在榴梿族中缺失（Alverson et al.， 1999; Nyffeler et al.， 2005）。目前，已有的研究尚不足以在形態(tài)上解釋本研究中所展示的Malvadendrina分支各亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，仍有待進(jìn)一步研究。

3.2 梧桐亞科屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

傳統(tǒng)的梧桐科是一個(gè)多型的科，包含極為豐富的花部形態(tài)和果實(shí)類型。為了更好地理解梧桐科植物之間的關(guān)系，分類學(xué)家們依據(jù)形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)、解剖學(xué)等特征將梧桐科植物劃分了亞科或（和）族（Cronquist & Takhtajan， 1992; Takhtajan， 2009; 徐頌軍和徐祥浩， 2012）。然而，對于梧桐科所包含的范圍和屬種數(shù)目，不同學(xué)者看法不一。據(jù)Takhtajan （2009） 統(tǒng)計(jì)，全世界有梧桐科植物62屬1 500種，而徐頌軍和徐祥浩（2012）則認(rèn)為梧桐科有60屬1 548種。分子系統(tǒng)學(xué)證據(jù)表明傳統(tǒng)梧桐科是一個(gè)多系，隨后將梧桐科與錦葵科、木棉科及椴樹科合并為廣義錦葵科，并將其內(nèi)部劃分為9個(gè)亞科，而傳統(tǒng)的梧桐科被劃分到5個(gè)亞科之中（Bayer et al.， 1999; Alverson et al.， 1999）。其中，梧桐亞科僅保留了原來蘋婆族和蝴蝶樹族的屬，其單系性得到了形態(tài)和分子證據(jù)的較好支持（Bayer & Kubitzki， 2003; Wilkie et al.， 2006）。然而基于葉綠體片段的系統(tǒng)發(fā)育分析，不足以提供足夠的分辨率以解決梧桐亞科內(nèi)部屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本研究基于葉綠體基因組重建了梧桐亞科屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果與基于梧桐亞科13個(gè)屬的葉綠體ndhF基因進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致（Wilkie et al.， 2006），均在梧桐亞科內(nèi)部識別到四個(gè)分支。與之相比，本研究的分析結(jié)果進(jìn)一步支持可樂果屬為其他屬的姐妹群以及梧桐屬和舟翅桐-胖大海屬的姐妹關(guān)系。此外，蘋婆屬分支和銀葉樹屬分支的姐妹關(guān)系也得到了各數(shù)據(jù)集（除IR數(shù)據(jù)集外）的強(qiáng)烈支持。而酒瓶樹屬分支有如下3個(gè)位置：（1）蘋婆屬-銀葉樹屬的姐妹群（BSWCG=68%， BSLSC=98%， BSCDS=92%）;（2） 可樂果屬分支（Cola clade）的姐妹群（BSSSC=67%）;（3）梧桐亞科余下屬的姐妹群（BSIR=80%）。酒瓶樹屬位置在IR區(qū)和SSC區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中發(fā)生變動(dòng)，可能的原因是IR區(qū)和SSC區(qū)較短，包含的變異位點(diǎn)較少。

3.3 梧桐屬的范圍與界定

在梧桐屬內(nèi)部，一類是花于葉前開放，花萼5淺裂，萼筒遠(yuǎn)長于裂片，如火桐、廣西火桐等;另一類則花葉同放，花萼5裂至近基部，如梧桐、丹霞梧桐等（Tang et al.， 2007）。因此，Ridley （1934） 主張將與火桐開花習(xí)性與花部形態(tài)一致的幾個(gè)種從梧桐屬中分出，獨(dú)立為火桐屬（Erythropsis Lindley ex Schott & Endlicher）。同時(shí)，蓇葖果中種子的數(shù)量也作為劃分兩屬的依據(jù)，Ridley指出火桐屬每蓇葖果含種子2枚，而梧桐屬每蓇葖果具種子4枚。這一觀點(diǎn)得到了徐頌軍和徐祥浩（2012）的認(rèn)同，且凡強(qiáng)等（2011）基于ITS序列進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析也為這一處理提供了分子證據(jù)。然而，Kostermans （1954， 1957） 指出花萼筒長度變異的現(xiàn)象普遍存在于梧桐科（Sterculiaceae）多個(gè)屬中，而每蓇葖果種子數(shù)的不同則體現(xiàn)了種間差異，而非屬間差異，因而不贊成將梧桐屬分為兩屬。在Flora of China（Tang et al.， 2007）及《中國維管植物科屬志》（李德銖等，2020）中均未將火桐屬從梧桐屬中分出。

此外，中國境內(nèi)的新記錄種克氏梧桐[Firmiana kerrii（Craib） Kosterm]及新發(fā)表的大圍山梧桐（Firmiana daweishanensis Gui L. Zhang & J. Y. Xiang）的花在展葉前開放，萼片深裂近基部（王文廣等，2019; Zhang et al.， 2020），兼具火桐的開花習(xí)性與梧桐的花部特征，處在二者的過渡狀態(tài)。由此可見，開花習(xí)性及形態(tài)的差異不足以作為分屬的依據(jù)。這種差異可能是由于快速分化造成的，可考慮與地理分布等信息結(jié)合起來，進(jìn)一步探究梧桐屬的物種形成問題。另外，與僅使用ndhF基因進(jìn)行最大似然法分析的結(jié)果一致（Wilkie et al.， 2006），我們使用ndhF、matK和rbcL聯(lián)合矩陣構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中也顯示梧桐屬與閉果桐屬的樣本未能各自形成單系。閉果桐屬Hildegardia barteri和同樣具有管狀花萼的火桐等聚為一支，而花萼深裂至近基部的H. populifolia則和梧桐等分在一支。Kostermans （1954） 曾依據(jù)蓇葖果的開裂與否作為兩屬劃分的依據(jù)，但顯然分子證據(jù)并不支持這樣的分類界定。因此，基于開花習(xí)性，花的形態(tài)特征差異，以及蓇葖果的開裂與否劃分狹義梧桐屬、火桐屬和閉果桐屬并沒有系統(tǒng)發(fā)育證據(jù)的支持。因此，現(xiàn)采用的梧桐屬定義包括火桐屬和閉果桐屬物種在內(nèi)。

3.4 梧桐屬研究展望

根據(jù)最新的資料，我國有廣義梧桐屬植物10種，多半是中國特有種（Tang et al.， 2007; 王文廣等，2019; Zhang et al.， 2020）。除梧桐在園林中廣泛栽培外，大多種均分布狹窄，甚至處于瀕危狀態(tài)。如丹霞梧桐僅在廣東省仁化縣及南雄市的丹霞地貌及英德的石灰?guī)r山體上發(fā)現(xiàn)（繆紳裕等，2020）;大圍山梧桐僅在云南大圍山地區(qū)分布（Zhang et al.， 2020）。早在1999年頒布的《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（第一批）》中，丹霞梧桐、海南梧桐及廣西火桐就被評為國家二級保護(hù)植物，而云南梧桐因于1998年被《IUCN瀕危物種紅色名錄》認(rèn)定野外滅絕未被收錄。后來云南梧桐在金沙江流域被重新發(fā)現(xiàn)，但總數(shù)不超過4 000株，且暴露于人類的干擾之中，仍具有高度的滅絕風(fēng)險(xiǎn)（王大紹， 2001; Li et al.， 2020）。名錄近二十年未有更新，直至2018年國家林業(yè)和草原農(nóng)業(yè)農(nóng)村部才啟動(dòng)了重點(diǎn)保護(hù)名錄的調(diào)整和修訂工作，并于2020年共同形成了《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（征求意見稿）》。在該名錄中，梧桐屬（除梧桐外）所有種均被列為國家二級保護(hù)植物。目前（截至收稿）正式版尚未頒布，但其關(guān)于梧桐屬植物保護(hù)等級的調(diào)整和修訂，足以反映出梧桐屬植物保護(hù)的迫切性與重要性。

梧桐屬植物數(shù)量較少，對環(huán)境的反應(yīng)較為敏感，更容易喪失遺傳多樣性，滅絕風(fēng)險(xiǎn)極高，對梧桐屬植物的保護(hù)刻不容緩。雖然閉果桐屬物種我國不產(chǎn)，但從文獻(xiàn)和標(biāo)本記錄來看很多物種分布區(qū)非常狹窄，同樣急需保護(hù)（Zaborsky， 2009; Rao et al.， 2011;Darbyshire & Rokni 2020;）。本研究中獲取的閉果桐屬物種只是基于NCBI上兩個(gè)物種的序列，未能很好地澄清閉果桐屬與狹義梧桐屬和火桐屬關(guān)系。同時(shí)，本研究中梧桐屬物種取樣不足，內(nèi)部種間的關(guān)系也沒有厘清。在未來的研究中，需要獲取更多的樣本，使用信息更為豐富的基因組數(shù)據(jù)來對廣義梧桐屬的關(guān)系做進(jìn)一步探究，同時(shí)從更廣泛的物種和居群取樣探討梧桐屬的物種演化關(guān)系，以便更好地解析梧桐屬物種多樣化的形成機(jī)制。

致謝 本研究得到了中國西南野生生物種質(zhì)資源庫大科學(xué)工程項(xiàng)目、國家重要野生植物種質(zhì)資源庫、中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園園林園藝部及公共技術(shù)服務(wù)中心超算平臺(tái)的支持;中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園林露湘老師、譚運(yùn)洪老師、丁洪波老師，中國科學(xué)院植物研究所劉冰老師為本研究提供材料，在此一并致謝。

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（責(zé)任編輯 何永艷）

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