蔡鐵城 劉俊仙 張沖 劉菁 陽太億 蔣菁 賀梁瓊 韓柱強(qiáng) 唐榮華 莊偉建 熊發(fā)前

摘 要：? 該研究旨在克隆Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT（reverse transcriptase）基因，為分離花生屬Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子全長序列和研究其功能提供序列基礎(chǔ)。根據(jù)RT基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物，以兩份AA染色體組野生種花生Arachis duranensis為試材，利用PCR擴(kuò)增其基因組DNA，回收、克隆和測序目的條帶后，對所獲得序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：（1）目的條帶大小約為260 bp，分別從兩份野生種花生材料中克隆到41條和27條RT基因序列，68條序列的長度變化范圍為256 ～270 bp，AT所占比例范圍為55.86%～68.42%，AT與GC比例范圍為1.27～2.17，核苷酸序列間相似性范圍為49.8%～99.2%，存在較高異質(zhì)性。（2）68條序列被分為6個(gè)家族，家族Ⅰ和Ⅳ為主要家庭。（3）68條序列中的19條發(fā)生了無義突變，A. duranensis（PI219823）要比A. duranensis（PI262133）的無義突變率高。（4）氨基酸序列間相似性為4.7%～100%，呈現(xiàn)高度異質(zhì)性。（5）各家族中代表序列的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)在整體構(gòu)型上一致，但在螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)、折疊結(jié)構(gòu)數(shù)、轉(zhuǎn)角數(shù)和氫鍵數(shù)上存在較大差別。（6）序列間保守基序總體一致，但也存在一定變異，呈現(xiàn)一定異質(zhì)性;系統(tǒng)進(jìn)化樹將68條序列分為10類，大部分序列都聚在A和B兩大類中。（7）另有部分AA染色體組野生種花生的RT基因序列與其他物種植物的RT基因序列親緣關(guān)系較近，推測不同物種植物間可能發(fā)生過Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的橫向傳遞。該研究為花生屬基于Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的新分子標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 花生， Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子， 反轉(zhuǎn)錄酶， 野生種， 異質(zhì)性

中圖分類號：? Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）01-0100-13

收稿日期：? 2021-07-15

基金項(xiàng)目：? 國家自然科學(xué)基金（31960409，32072103，31960416）;廣西自然科學(xué)基金（2018GXNSFDA281027，2018GXNSFDA294004，2020GXNSFAA297081）;福建省科技廳農(nóng)業(yè)引導(dǎo)性（重點(diǎn)）項(xiàng)目（2018N0004）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金（桂農(nóng)科2018YM06，桂農(nóng)科2017JZ13，桂農(nóng)科31960409，桂農(nóng)科2021YT052）? [Supported by the National Natural Science Foundation of China （31960409， 32072103， 31960416）; Guangxi Natural Science Foundation （2018GXNSFDA281027， 2018GXNSFDA294004， 2020GXNSFAA297081）; Guiding Key Project of Department of Science and Technology of Fujian Province? （2018N0004）; Scientific and Technological Development Foundation of Guangxi Academy of Agricultural Sciences （GNK2018YM06， GNK2017JZ13， GNK31960409， GNK2021YT052]。

第一作者： 蔡鐵城（1983-），碩士，助理研究員，主要從事花生遺傳育種和分子生物學(xué)研究，（E-mail）caitiecheng1027@163.com。

*通信作者：? 熊發(fā)前，博士，研究員，主要從事花生種質(zhì)資源和遺傳育種及分子生物學(xué)研究，（E-mail）xfq2002@126.com。

Cloning and sequence analysis of reverse transcriptase

genes of Ty1-copia-like retrotransposons in wild

peanut species with AA genome

CAI Tiecheng1， LIU Junxian3， ZHANG Chong1， LIU Jing2， YANG Taiyi2，

JIANG Jing2， HE Liangqiong2， HAN Zhuqiang2， TANG Ronghua2，

ZHUANG Weijian1， XIONG Faqian2*

（ 1. College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China; 2. Cash

Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China;? 3. Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Sugarcane Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement， Nanning 530007 ）

Abstract：? The purpose of this study was to clone the reverse transcriptase （RT） genes of Ty1-copia-like retrotransposons， and to provide sequences basis for isolating the full-length sequences of Ty1-copia-like retrotransposons and studying their function in genus Arachis. Degenerate primers were designed according to the conserved region of RT genes， the genomic DNA of wild peanut species Arachis duranensis with AA genome was amplified by PCR using the degenerated primers. The amplified targeted bands were recovered， cloned and sequenced， and then the sequences were analyzed through bioinformatics analysis. The results were as follows： （1） The amplified targeted bands were all about 260 bp in size. Forty-one and twenty-seven RT genes sequences were cloned from the two wild peanut species respectively. The length of sixty-eight sequences varied from 256 to 270 bp.? The proportion of AT， AT/GC and the similarity between nucleotide sequences ranged from 55.86% to 68.42%， 1.27 to 2.17， and 49.8% to 99.2% respectively， showing a higher heterogeneity. （2） The sixty-eight sequences were divided into six families， Family I and Family IV were the main families. （3） Nineteen of sixty-eight sequences had nonsense mutations， and Arachis duranensis （PI219823） had a higher nonsense mutations rate than Arachis duranensis （PI262133）. （4） The similarity between amino acid sequences ranged from 4.7% to 100%， showing a high heterogeneity. （5） The tertiary structures of proteins representing sequences in each family were basically similar in overall configuration， but there were great differences in the number of helix structures， folding structures， turns and hydrogen bonds. （6） The conserved motifs among sequences were generally consistent， but there were also some variations， showing a certain degree of heterogeneity. The phylogenetic tree divided sixty-eight sequences into ten classes. Most of sequences were clustered in A and B classes. （7） Some of RT genes sequences from two wild peanut species with AA genome were closely related to RT genes sequences from other plant species， which indicated that there might be transposon horizontal transmission between them. This study provides? reference for the development and application of new molecular markers based on Ty1-copia-like retrotransposons in genus Arachis.

Key words： peanut， Ty1-copia-like retrotransposons， reverse transcriptase （RT）， wild species， heterogeneity

花生被譽(yù)為“長生果”，全世界有106個(gè)國家種植?；ㄉ俏覈饕秤糜驮?，我國是世界上重要的花生生產(chǎn)國。當(dāng)前我國選育出的花生品種主要是利用傳統(tǒng)雜交育種，但存在周期長、效率低、目的性不強(qiáng)等缺點(diǎn)，而分子育種可以加速育種進(jìn)程，但是缺少簡單實(shí)用高效的DNA分子標(biāo)記。在花生上，傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)想檢測出豐富多態(tài)性十分困難（熊發(fā)前等，2010;王強(qiáng)等，2010;Xiong et al.， 2011），雖然近幾年在花生上也有利用SNP標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)及連鎖分析的研究報(bào)道（Zhang et al.， 2017;Han et al.， 2018;Wang et al.， 2018），但當(dāng)前在花生上使用最廣泛的是SSR標(biāo)記，然而能在任意兩個(gè)栽培種花生品種間檢測出DNA多態(tài)性的SSR標(biāo)記引物對還比較匱乏（熊發(fā)前等，2010;Xiong et al.， 2011）。

LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子主要包括Ty1-copia和Ty3-gypsy兩大類（Kumar & Bennetzen， 1999;Feschotte et al.， 2002;Bonchev & Parisod， 2013），這兩類LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中的RT基因序列都可以通過簡并PCR技術(shù)擴(kuò)增克?。╒oytas et al.， 1992;Kumekawa et al.， 1999）。LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的普遍性、高拷貝、高度異質(zhì)性和插入位點(diǎn)多態(tài)性等特性使其非常適合開發(fā)分子標(biāo)記。

但到目前為止，在花生上尚未見到基于LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子開發(fā)分子標(biāo)記的研究報(bào)道。而分離和鑒定LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是分子標(biāo)記開發(fā)利用的前提?；ㄉ鶯TR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的研究報(bào)道較少，Nielen等（2010， 2012）先后分離出花生Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的FIDEL和Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的Matita，對FIDEL和Matita的特性和作用進(jìn)行了分析。筆者曾系統(tǒng)對花生LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和MITE轉(zhuǎn)座子的分離及其應(yīng)用的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及進(jìn)展進(jìn)行了歸納（熊發(fā)前等，2017）。

本研究擬從兩份AA染色體組野生種花生材料Arachis duranensis中克隆Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因，分析其序列特征和多樣性，為分離花生屬Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子全長序列和研究其功能提供序列基礎(chǔ)，為花生屬基于Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的新分子標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院武鳴里建科研基地的花生野生圃里隨機(jī)摘取兩份AA染色體組野生種花生材料Arachis duranensis（PI262133）和Arachis duranensis（PI219823）各5株健康植株的頂端芯葉進(jìn)行混合。

1.2 基因組DNA的提取

花生高質(zhì)量基因組DNA的提取采用改良CTAB法（熊發(fā)前等，2019）。

1.3 RT基因的PCR擴(kuò)增

上游引物為RTp1：5′-ACNGCNTTYYTNCAYGG-3′，下游引物為RTp2：5′-ARCATRTCRTCNACRTA-3′，其中，R=A/G，Y=C/T，N=A/T/C/G（Kumar et al.，1997）。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序以及PCR產(chǎn)物的分離檢測參考熊發(fā)前等（2019）的方法。

1.4 PCR產(chǎn)物的回收、克隆及測序

參考陽太億等（2019）的方法進(jìn)行。

1.5 RT基因的序列分析

序列相似性檢索、序列統(tǒng)計(jì)分析、序列圖及Logo圖的生成、蛋白二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測、蛋白三級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角數(shù)和氫鍵數(shù)統(tǒng)計(jì)、保守基序預(yù)測等參考陽太億等（2019）進(jìn)行。運(yùn)用MEGA 6.0軟件的鄰接法（No. of differences模型）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值設(shè)置為1 000，所用其他物種的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因序列信息見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT基因的PCR擴(kuò)增及測序

對AA染色體組野生種花生材料A. duranensis（PI262133）和A. duranensis（PI219823）的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 結(jié)果顯示，在2份花生材料中都擴(kuò)增出了大小約260 bp的特異條帶（圖1）。將目的條帶進(jìn)行回收、克隆和測序，從A. duranensis（PI262133）和A. duranensis（PI219823）中分別獲得了42條和38條序列。利用DNAMAN軟件去除相同序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行同源性分析進(jìn)而去除非目標(biāo)序列，最后從A. duranensis（PI262133）和A. duranensis（PI219823）中分別獲得了41條和27條目標(biāo)序列，并分別命名為AdRT1-X和AdRT2-X（表2）。對這些RT基因序列進(jìn)行多重比對（圖2），利用weblogo生成了序列l(wèi)ogo圖以展示每個(gè)位置上堿基的保守性（圖3）。

2.2 RT基因序列分析

利用BioEdit軟件對RT基因序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表2，從中可以看出，所有序列長度都在256 ～270 bp之間，存在缺失或插入突變。在A. duranensis（PI262133）的41條序列中，AdRT1-47的序列長度最短，為256 bp，AdRT1-11的序列長度最長，為267 bp，長度為266 bp的序列占總序列數(shù)的90.24%;A、T、C、G數(shù)量變化范圍分別為65～88、78～94、29～61和49～67，AT所占比例范圍為55.86%～68.42%，AT與GC比例為1.27～2.17;核苷酸序列間相似性范圍為50%～99.2%，其中，AdRT1-26與AdRT1-25之間的相似性最高，達(dá)99.2%，AdRT1-47與AdRT1-7以及AdRT1-47與AdRT1-29之間的相似性最低，均為50%，氨基酸序列間相似性范圍為4.7%～100%。在A. duranensis（PI219823）的27條序列中，AdRT2-24的序列長度最短，為257 bp，AdRT2-7的序列長度最長，為270 bp，長度為266 bp的序列占總序列數(shù)的74.07%;A、T、C、G數(shù)量變化范圍分別為62～93、71～93、32～56和66～68，AT所占比例范圍為57.20%～67.29%，AT與GC比例為1.34～2.06;核苷酸序列間相似性范圍為49.8%～99.2%，其中，AdRT2-3與AdRT2-4之間的相似性最高，達(dá)99.2%，AdRT2-13與AdRT2-27之間的相似性最低，為49.8%，氨基酸序列間相似性范圍為14.6%～100%。

2.3 RT基因核苷酸序列聚類分析

利用MEGA 6.0軟件對RT基因序列進(jìn)行聚類分析（圖4）。遺傳進(jìn)化樹顯示，68條序列被劃分為6個(gè)家族，家族Ⅰ包含28條序列，其中，18條來自A. duranensis（PI262133），10條來自A. duranensis（PI219823），所含序列數(shù)占總序列數(shù)的41.18%;家族Ⅱ包含9條序列;家族Ⅲ只包含AdRT1-29，該序列與家族Ⅰ親緣關(guān)系較遠(yuǎn)而單獨(dú)聚為一類，造成該序列單獨(dú)為一類的原因可能是堿基替換;家族Ⅳ包含23條序列，其中，有17條來自A. duranensis（PI262133），6條來自A. duranensis（PI219823），所含序列數(shù)占總序列數(shù)的33.82%;家族Ⅴ包含3條序列;家族Ⅵ包含4條序列。家族Ⅴ和家族Ⅵ與另外4個(gè)家族遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因?yàn)檫@兩個(gè)家族中的序列存在堿基缺失的現(xiàn)象。

2.4 RT基因氨基酸序列分析

利用MEGA 6.0軟件對RT基因氨基酸序列進(jìn)行分析（圖5）。結(jié)果顯示，68條序列中有19條發(fā)生無義突變，其中，9條序列來自A. duranensis（PI262133），占該材料序列總數(shù)的21.95%，10條序列來自A. duranensis（PI219823），占該材料序列總數(shù)的37.04%，就無義突變發(fā)生率來說，A. duranensis（PI219823）要比A. duranensis（PI262133）高。無義突變在2份花生材料中的具體表現(xiàn)如下：AdRT2-21發(fā)生了8個(gè)無義突變，分別在第31、第34、第65、第66、第71、第75、第76和第77個(gè)氨基酸處;AdRT2-5發(fā)生了7個(gè)無義突變，分別在第51、第58、第74、第75、第76、第77和第87個(gè)氨基酸處;AdRT1-47發(fā)生了6個(gè)無義突變，分別在第18、第26、第30、第37、第79和82個(gè)氨基酸處;AdRT1-11發(fā)生了5個(gè)無義突變，分別在第41、第71、第75、第76和第77個(gè)氨基酸處;AdRT1-16發(fā)生了5個(gè)無義突變，分別在第54、第58、第80、第81和第84個(gè)氨基酸處;AdRT2-10發(fā)生了5個(gè)無義突變，分別在第54、第58、第81、第82和第84個(gè)氨基酸處;AdRT1-4發(fā)生了2個(gè)無義突變（分別在第26和第41個(gè)氨基酸處）;AdRT1-23發(fā)生了2個(gè)無義突變（分別在第8和第39個(gè)氨基酸處）;AdRT1-7、AdRT1-22、AdRT1-34、AdRT1-48、AdRT2-7、AdRT2-11、AdRT2-27、AdRT2-37、AdRT2-38

和AdRT2-42都只發(fā)生了1個(gè)無義突變;部分序列存在連續(xù)無義突變的現(xiàn)象，無義突變會影響到反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性。

2.5 RT基因的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

將獲得的68條Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因序列統(tǒng)一翻譯成氨基酸后，根據(jù)核苷酸聚類結(jié)果，分別選擇兩份花生材料中每個(gè)家族中的代表序列，利用在線程序Phyre2預(yù)測其蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)（表3，圖6，圖7），代表序列蛋白三級結(jié)構(gòu)匹配覆蓋度最高的模板為d1hara、c4rs7R、d1sqwa1、c5xvnM，置信度均為16.5～86.2，其中只有d1hara屬于逆轉(zhuǎn)錄酶家族，其余蛋白均未匹配到逆轉(zhuǎn)錄蛋白模板。二級結(jié)構(gòu)包含2～3個(gè)α-螺旋和5個(gè)β-折疊; 三級結(jié)構(gòu)包含2～6個(gè)轉(zhuǎn)角和9～30個(gè)氫鍵，還存在1個(gè)明顯的螺旋結(jié)構(gòu)和2個(gè)不明顯的折疊結(jié)構(gòu)。

2.6 RT基因保守基序預(yù)測

RT基因保守基序預(yù)測結(jié)果顯示， 68條序列共存在11種保守基序，其中，有57條序列同時(shí)包含motif 1、motif 2和motif 3， 占總序列數(shù)的83.82%，說明這3種保守基序是AA染色體組野生種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因的主要保守基序，這也從保守基序角度表明兩個(gè)AA染色體組野生種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因具有非常高的保守性與相似性。AdRT2-27和AdRT2-38同時(shí)包含motif 3、motif 4和motif 6，motif 4和motif 6這兩個(gè)保守基序在位置上與motif 1和motif 2相同，但氨基酸的排列和組成并不相同;AdRT1-11包含motif 1、motif 3和motif 7;AdRT1-16和AdRT2-10同時(shí)包含motif 1和motif 5，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，這2條序列為同一類;AdRT2-19包含motif 1和motif 10;AdRT2-24包含motif 8、motif 9和motif 10;AdRT2-21包含motif 1和motif 7，這3條序列在系統(tǒng)進(jìn)化樹中均單獨(dú)歸類;AdRT1-47包含motif 8和motif 9;AdRT2-5包含motif 7、motif 8和motif 11;AdRT1-23只包含motif 11，這3條序列在系統(tǒng)進(jìn)化樹中歸為同一類，其中，motif 8和motif11的長度較短，位于序列上游部分。部分保守基序在所克隆序列中出現(xiàn)的頻率較低且長度較短，說明這些序列在進(jìn)化過程中發(fā)生了突變（圖8）。

2.7 RT基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖9），所有RT基因序列可分為10類，大部分RT基因序列都聚在A和B兩大類中，表明本研究中AA染色體組野生種花生的RT基因序列具有相當(dāng)高的保守性與相似性。A類包含20條來自A. duranensis（PI262133）的序列和15條來自A. duranensis（PI219823）的序列，這35條序列與來自葡萄（Vitis vinifera，CAN67451.1）、綠豆（Vigna radiata，AAT90460.1、AAT90479.1）、鷹嘴豆（Cicer arietinum，CAD59770.1）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，CAA13067.1）、西洋參（Panax quinquefolius，ABU94811.1）、野茶樹（Camellia sinensis，CAJ09751.1）、李子（Prunus salicina，AGX45518.1）、蘋果（Malus domestica，ABS11062.1）、煙草（Nicotania tabacum，AAA03507.1）的序列之間具有較高相似性，親緣關(guān)系較近。B類包含17條來自A. duranensis（PI262133）的序列和5條來自A. duranensis（PI219823）的序列，說明這22條序列之間具有較高相似性。C類只有AdRT1-29，該序列與來自油菜（Brassica napus，AAA32987.1）、梅花（Prunus mume，ABF57071.1）、大豆（Glycine max，E47759）、藜麥（Chenopodium quinoa，AEX61031.1）、番茄（Lycopersicon esculentum，AAC34611.1）、大狗尾草（Setaria faberi，AAL36472.1）、水稻（Oryza sativa，AAA33902.1）和玉米（Zea mays，AAK84849.1）的序列之間具有較高相似性，親緣關(guān)系較近。D類中是來自綠豆、歐洲云杉和石蒜的3條序列，這3條序列與大多數(shù)AA染色體組野生種花生和其他物種植物的序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。E類只包含2條序列，分別是來自AA染色體組野生種花生的AdRT2-24和擬南芥的S71291，說明這2條序列之間親緣關(guān)系最近。F-J類中的3條和7條序列分別來自Arachis duranensis（PI262133）和A. duranensis（PI219823），均不包含其他物種植物的序列。

3 討論與結(jié)論

本研究用同一簡并引物從同一種野生花生種質(zhì)中克隆獲得的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因的核苷酸和氨基酸序列在序列長度、序列組成及序列相似性等方面存在較大差異和多態(tài)性，表明同一種野生花生種質(zhì)內(nèi)同一類群反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子存在較高異質(zhì)性。另外，兩份野生種花生材料中RT基因序列均富含AT堿基，富含AT導(dǎo)致呈現(xiàn)較高異質(zhì)性;RT基因核苷酸序列間相似性呈現(xiàn)較高異質(zhì)性; 有19條氨基酸序列發(fā)生了無義突變， 導(dǎo)致呈現(xiàn)較高異質(zhì)性;RT基因氨基酸序列間相似性呈現(xiàn)高度異質(zhì)性;68條RT基因序列間保守基序也呈現(xiàn)一定異質(zhì)性;家族Ⅴ和家族Ⅵ中的代表序列在螺旋結(jié)構(gòu)、折疊結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)角數(shù)、氫鍵數(shù)上與其他家族代表序列存在較大差別，呈現(xiàn)較高異質(zhì)性和多態(tài)性?？傊瑑煞菀吧N花生材料中RT基因序列在AT堿基含量、核苷酸序列間相似性、氨基酸序列間相似性、氨基酸無義突變率、保守基序、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)上均呈現(xiàn)異質(zhì)性。

家族Ⅰ-Ⅳ中代表序列的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)在整體構(gòu)型上基本類似，但在螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)、折疊結(jié)構(gòu)數(shù)、轉(zhuǎn)角數(shù)和氫鍵數(shù)上存在較大差別，家族Ⅴ中的AdRT1-16只存在2個(gè)明顯的螺旋結(jié)構(gòu)，其轉(zhuǎn)角數(shù)和氫鍵數(shù)也明顯少于其他序列;家族Ⅵ中的AdRT1-47的氫鍵數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于其他序列，其轉(zhuǎn)角數(shù)也少于其他序列，且其螺旋結(jié)構(gòu)較短;AdRT2-27相較于其他序列存在2個(gè)明顯的折疊結(jié)構(gòu)和1個(gè)不明顯的折疊結(jié)構(gòu)，其轉(zhuǎn)角數(shù)和氫鍵數(shù)都少于其他序列，推測這些差別可能會影響到Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄活性及轉(zhuǎn)座效率等。

遺傳進(jìn)化樹顯示，6個(gè)家族中的Ⅰ和Ⅳ是主要家族，表明AA染色體組野生種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因序列具有非常高的保守性與相似性。另外，各家族內(nèi)部成員越復(fù)雜，序列相似性越高，存在有轉(zhuǎn)錄活性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的可能性也越大，其轉(zhuǎn)座發(fā)生的時(shí)間可能越近（Tang et al.， 2005），由此推測，家族Ⅰ和家族Ⅳ很有可能是存在具有轉(zhuǎn)錄活性的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的家族，存在的歷史也更為久遠(yuǎn)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，A類中的35條AA染色體組野生種花生RT基因序列與葡萄、綠豆、鷹嘴豆、馬鈴薯、西洋參、野茶樹、李子、蘋果、煙草的序列之間相似性較高;C類中的AdRT1-29與來自油菜、梅花、大豆、藜麥、番茄、大狗尾草、水稻、玉米的序列之間相似性較高;E類中的AdRT2-24與擬南芥的S71291之間的相似性較高，推測AA染色體組野生種花生Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子曾可能與這些物種植物間發(fā)生過橫向傳遞。F-J類中的RT基因序列均來自AA染色體組野生種花生，且與AA染色體組野生種花生和其他物種植物的RT基因序列遺傳距離最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，表明這幾類中的RT基因序列在起源和進(jìn)化上可能較為古老，特異性比較強(qiáng)，有可能為A. duranensis（PI262133）和A. duranensis（PI219823）所特有。

總之，本研究從AA染色體組野生種花生中成功克隆到Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因序列，對花生屬基于LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記開發(fā)及花生分子育種具有重要意義，將為下一步分離其全長序列、研究其轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座活性及功能提供序列基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

BONCHEV G， PARISOD C， 2013. Transposable elements and microevolutionary changes in natural populations [J]. Mol Ecol Resour， 13（5）： 765-775.

FESCHOTTE C， JIANG N， WESSLER SR， 2002. Plant transposable elements：where genetics meets genomics [J]. Nat Rev Genet， 3（5）： 329-341.

HAN SY， YUAN M， CLEVENGER JP， et al.， 2018. A SNP-based linkage map revealed QTLs for resistance to early and late leaf spot diseases in peanut （Arachis hypogaea L.） [J]. Front Plant Sci， 9： 1012.

KUMAR A， BENNETZEN JL， 1999. Plant retrotransposons [J]. Ann Rev Genet， 33（1）： 479-532.

KUMEKAWA N， OHTSUBO E， OHTSUBO H， 1999. Identification and phylogenetic analysis of gypsy-type retrotransposons in the plant kingdom [J]. Genes Genet Syst， 74（6）： 299-307.

NIELEN S， CAMPOS-FONSECA F， LEAL-BERTIOLI S， et al.， 2010. FIDEL—a retrovirus-like retrotransposon and its distinct evolutionary histories in the A- and B-genome components of cultivated peanut [J]. Chrom Res， 18（2）： 227-246.

NIELEN S， VIDIGAL BS， LEAL-BERTIOLI SCM， et al.，2012. Matita， a new retroelement from peanut：characterization and evolutionary context in the light of the Arachis A-B genome divergence [J]. Mol Genet Genom， 287（1）： 21-38.

TANG YM， MA YZ， LI LC， et al.， 2005. Identification and characterization of reverse transcriptase domain of transcriptionally active retrotransposons in wheat genome [J]. J Integr Plant Biol， 47（5）： 604-612.

VOYTAS DF， CUMMINGS MP， KONIECZNY A， et al.， 1992. Copia-like retrotransposons are ubiquitous among plants [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 89（15）： 7124-7128.

WANG LF， ZHOU XJ， REN XP， et al.， 2018. A major and stable QTL for bacterial wilt resistance on chromosome B02 identified using a high-density SNP-based genetic linkage map in cultivated peanut Yuanza 9102 derived population [J]. Front Genet， 9： 652.

WANG Q， ZHANG XY， TANG FS， et al.， 2010. Construction of genetic linkage map of peanut （Arachis hypogaea L.） based on SRAP markers [J]. Chin J Oil Crop Sci， 32（3）： 374-378. [王強(qiáng)， 張新友， 湯豐收， 等， 2010. 基于SRAP分子標(biāo)記的栽培種花生遺傳連鎖圖譜構(gòu)建 [J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)， 32（3）： 374-378.]

XIONG FQ， JIANG J， ZHONG RC， et al.， 2010. Application of SCoT molecular markers in genus Arachis [J]. Acta Agron Sin， 36（12）： 2055-2061.? [熊發(fā)前， 蔣菁， 鐘瑞春， 等， 2010.目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）分子標(biāo)記技術(shù)在花生屬中的應(yīng)用 [J]. 作物學(xué)報(bào)， 36（12）： 2055-2061.]

XIONG FQ， LIU JX， HE LQ， et al.， 2017. Recent advances on the development and utilization of molecular markers based on LTR retrotransposons and MITE transposons from peanut（Arachis hypogaea L.） [J]. Mol Plant Breed， 15（2）： 640-647.? [熊發(fā)前， 劉俊仙， 賀梁瓊， 等， 2017. 花生LTR和MITE轉(zhuǎn)座子及其分子標(biāo)記開發(fā)利用研究進(jìn)展 [J]. 分子植物育種， 15（2）： 640-647.]

XIONG FQ， LIU JX， LIU J， et al.， 2019. Comparative analysis and application of five improved CTAB extraction methods for peanut DNA [J]. Mol Plant Breed，17（7）： 2207-2216.? [熊發(fā)前， 劉俊仙， 劉菁， 等， 2019. 花生DNA的五種改良CTAB提取方法的比較分析及其應(yīng)用 [J]. 分子植物育種， 17（7）： 2207-2216.]

XIONG FQ， ZHONG RC， HAN ZQ， et al.， 2011. Start codon targeted polymorphism for evaluation of functional genetic variation and relationships in cultivated peanut （Arachis hypogaea L.） genotypes [J]. Mol Biol Rep， 38（5）： 3487-3494.

YANG TY， LIU JX， LIU J， et al.， 2019. Cloning and analysis of reverse transcriptase of Ty1-copia-like retrotransposons in Arachis monticola [J]. Shandong Agric Sci， 51（9）： 9-20. [陽太億， 劉俊仙， 劉菁， 等， 2019. 四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的克隆與分析 [J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 51（9）： 9-20.]

ZHANG XG， ZHANG JH， He XY， et al.， 2017. Genome-wide association study of major agronomic traits related to domestication in peanut [J]. Front Plant Sci， 8： 1611.

（責(zé)任編輯 李 莉）

1488501186226