張寶雪，牛曉曉，金珊

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

無機磷酸鹽的吸收在整個生物世界中是一種普遍的生物現(xiàn)象.磷在動物的骨骼、牙齒和細(xì)胞膜等都是極其重要的組成成分.無機磷酸鹽參與了生物體內(nèi)大多數(shù)的生化反應(yīng)，因此嚴(yán)格控制細(xì)胞內(nèi)外無機磷酸鹽的水平對生物的生長和發(fā)育都非常重要.近年來的研究發(fā)現(xiàn)，人體中xpr1基因發(fā)生突變會導(dǎo)致原發(fā)性家族性腦鈣化疾病(PFBC)[1].PFBC是一種罕見的神經(jīng)退行性疾病，以雙側(cè)大腦鈣化為病變特征，鈣化主要分布在透鏡核、尾狀核、丘腦、小腦半球和皮層下白質(zhì)等部位，臨床癥狀表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、步態(tài)紊亂、運動障礙、精神異常和癲癇等.迄今為止研究者們發(fā)現(xiàn)了6個PFBC的致病基因，包括PDGFRB、PDGFB、slc20a2、xpr1、myorg和jam2[2-4].其中slc20a2編碼無機磷酸輸入蛋白PiT2，而xpr1是哺乳動物中目前唯一已知的編碼磷酸鹽輸出蛋白的基因[5].在小鼠中xpr1突變導(dǎo)致腎的磷吸收功能嚴(yán)重受損，主要原因就是xpr1的功能缺陷影響了磷的外排.XPR1一開始是作為小鼠異嗜型或多嗜型的逆轉(zhuǎn)錄病毒(XMRV)受體被研究者發(fā)現(xiàn)，也是第四個被發(fā)現(xiàn)的具有多個跨膜結(jié)構(gòu)域分子的哺乳動物C型癌逆轉(zhuǎn)錄病毒受體.XPR1是一種非典型G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，與G蛋白的β亞基結(jié)合從而參與cAMP信號通路.據(jù)報道XMRV在小鼠體內(nèi)就是由XPR1介導(dǎo)入侵的，結(jié)果就導(dǎo)致cAMP信號減弱，造成細(xì)胞感染死亡引起神經(jīng)疾病[6].除了作為磷酸鹽輸出蛋白、GPCR以及異嗜型或多嗜型的逆轉(zhuǎn)錄病毒受體之外，XPR1還有別的功能，這里就不一一贅述.綜上所述，不難發(fā)現(xiàn)xpr1突變?nèi)菀滓l(fā)神經(jīng)疾病，所以我們以果蠅為實驗材料，在果蠅幼蟲的神經(jīng)肌肉接頭中去探索xpr1在突觸前神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能的調(diào)控作用.人類的xpr1在果蠅中的同源基因為CG10481、CG7536、CG2901和CG10483(見圖1)，其中CG10481和CG2901在幼蟲的神經(jīng)系統(tǒng)里并不表達(dá)，雖然CG7536在幼蟲神經(jīng)系統(tǒng)也有表達(dá)，但其集中表達(dá)在幼蟲腸道中.而CG10483主要在幼蟲神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá).所以本研究主要使用與人類的xpr1相似性高達(dá)55%的CG10483為基因背景的果蠅.

圖1 人類xpr1與果蠅xpr1氨基酸序列對比圖

大多數(shù)生物的腦、脊髓和腺體中存在著豐富的突觸，突觸是兩個神經(jīng)元或者兩個細(xì)胞相互接觸聯(lián)系的場所.突觸前細(xì)胞在這里組裝釋放神經(jīng)遞質(zhì)，突觸后細(xì)胞在這里接收整合神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的信息.根據(jù)突觸形成的部位及突觸傳遞的性質(zhì)，突觸又分為電突觸和化學(xué)突觸，本文中用到的體系主要為化學(xué)突觸，以下直接稱為突觸.一個完整的突觸包括突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜.神經(jīng)支配肌肉的突觸—神經(jīng)肌肉接頭(Neuromuscular junction NMJ)又稱為運動終板，是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)與骨骼肌組成，人和動物能在環(huán)境中有目的的移動與NMJ的功能是分不開的.運動神經(jīng)元末端釋放化學(xué)信號作用于鄰近的肌肉細(xì)胞表面，引起局部電流去極化引起肌肉收縮，損壞這一行為會導(dǎo)致肌肉無力或者癱瘓[7].與腦神經(jīng)和脊髓神經(jīng)突觸相比，NMJ具有相似的結(jié)構(gòu)特征，但是體積更大，更容易制備，是一個優(yōu)秀的突觸功能研究模型[8].

果蠅作為典型的模式生物，擁有眾多遺傳學(xué)操作工具.神經(jīng)肌肉接頭的形態(tài)特征和功能調(diào)控在果蠅及脊椎動物之間是高度保守的，因此果蠅是研究突觸發(fā)育分子機制和神經(jīng)傳遞的重要模型.果蠅幼蟲的神經(jīng)肌肉接頭是谷氨酸能的，一個成熟的谷氨酰胺突觸模型形成于胚胎時期，但是突觸的發(fā)育貫穿了整個幼蟲階段[9](胚胎晚期有32個運動神經(jīng)元支配肌肉).果蠅幼蟲有8個體節(jié)，A2～A7體節(jié)幾乎相同[10]，在每節(jié)體壁上都排列著左右對稱的運動神經(jīng)元和由一系列由多核肌細(xì)胞組成的肌肉[11]，且每塊肌肉都由固定的神經(jīng)元支配.許多參與果蠅及脊椎動物突觸發(fā)育的細(xì)胞是相似的，傳遞的分子也是保守的，參與果蠅突觸發(fā)育的一些動物細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞排斥分子的結(jié)構(gòu)或功能也與脊椎動物突觸中的相似[12]等.NMJ中蛋白種類豐富，這些蛋白分子會影響神經(jīng)和肌肉間化學(xué)遞質(zhì)的釋放和接收，它們在運動神經(jīng)元和突觸后的肌膜上分布復(fù)雜[13].編碼這些蛋白的基因發(fā)生突變可能會導(dǎo)致NMJ的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響NMJ的功能，嚴(yán)重可致死.經(jīng)我們發(fā)現(xiàn)磷酸鹽輸出蛋白XPR1在果蠅幼蟲的NMJ中也有表達(dá)，考慮到XPR1的多項重要功能，我們在NMJ這一體系中對XPR1的功能進(jìn)行探究.

1 材料與方法

1.1 實驗所用果蠅品系如表1所示.

表1 實驗所用果蠅

1.2 免疫染色所用抗體及染料如表2所示.

表2 實驗所用抗體

1.3 實驗方法

1.3.1 果蠅三齡幼蟲的獲取 取發(fā)育時間相同的雄性果蠅和處女蠅.為了控制幼蟲的生長密度，將果蠅按照10∶5雌雄比例放置在25 ℃ 條件下養(yǎng)殖，培養(yǎng)基內(nèi)加入少量干酵母(可促進(jìn)果蠅產(chǎn)卵).管內(nèi)雌雄果蠅交配產(chǎn)卵48 h后倒出成蟲讓培養(yǎng)基內(nèi)的卵繼續(xù)發(fā)育，待生長為三齡晚期幼蟲后，取材實驗.

1.3.2 果蠅三齡幼蟲的解剖 用解剖鑷從培養(yǎng)管內(nèi)輕輕取出發(fā)育好的三齡幼蟲，然后放入解剖液(HL3)中洗去幼蟲身上的培養(yǎng)基.取出幼蟲吸干解剖液放置于解剖盤上，使幼蟲背部朝上漏出背部的兩根氣管，然后用解剖針固定頭部和尾部.在固定好的幼蟲身上滴一滴解剖液，用解剖剪在幼蟲尾部剪一小口，然后從尾部沿兩根氣管之間剪至頭部.夾取解剖針將幼蟲的皮在頭尾各取兩個角使幼蟲成片狀伸展開呈六邊形，最后用解剖鑷將內(nèi)臟和氣管清除干凈保留幼蟲大腦及腹側(cè)神經(jīng)節(jié).

1.3.3 免疫染色[14]解剖完成之后吸去幼蟲樣本的解剖液，吸干之后用PFA(4%多聚甲醛)浸住整個樣品，室溫固定40 min.固定過后，取下解剖針，將樣本用0.2% PBST(1% PBS+0.2% Triton X 100)洗脫液進(jìn)行漂洗，每10 min更換一次洗脫液，連續(xù)漂洗90 min.吸干洗脫液，用移液器加入一抗(0.2%的PBST配制)，4 ℃過夜.吸走一抗，加入0.2% PBST洗脫液連續(xù)洗脫1 h，每10 min更換1次洗脫液.吸干洗脫液，用移液器加入二抗(0.2%的PBST配制)，室溫避光孵育3 h，漂洗樣本，方法同一抗.將染色完成的樣本置于載玻片上，吸干洗脫液，用Vectorshield封片油浸住樣品，蓋上蓋玻片(注意樣品內(nèi)不出現(xiàn)氣泡，否則會影響圖片采集)后用指甲油密封.

1.3.4 圖片采集和數(shù)據(jù)處理 實驗中樣本免疫染色圖片的均由蔡司710共聚焦顯微鏡采集，圖片處理主要由ZEN(black)和Photoshop CS完成.樣本數(shù)據(jù)主要由Graphpad Prism 5.01和Image J處理完成.兩組實驗比較采用T檢驗(Student’sttest)進(jìn)行統(tǒng)計分析，3組及其以上采用F檢驗(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計分析.為了減小誤差，我們統(tǒng)一檢測第3體節(jié)4號肌肉的NMJ.

2 結(jié)果

2.1 XPR1分布定位于果蠅三齡幼蟲的NMJ免疫染色結(jié)果顯示GFP標(biāo)記的XPR1在NMJ的神經(jīng)軸突、突觸前(圖2A)和突觸后(圖2B)都有分布 (見圖2).

圖2 XPR1的免疫染色分布圖A：HRP標(biāo)記突觸前神經(jīng)細(xì)胞膜.GFP標(biāo)記的XPR1在NMJ的軸突和突觸前都有分布. 左圖為NMJ神經(jīng)軸突，中間圖及右圖分別為NMJ的突觸及單個突觸扣結(jié)放大圖. B：DLG(洋紅)標(biāo)記NMJ突觸后的肌肉細(xì)胞膜，GFP標(biāo)記XPR1(綠色)的分布.由圖可知XPR1在NMJ的突觸后也有分布.

2.2xpr1-果蠅的三齡幼蟲的NMJ形態(tài)出現(xiàn)缺陷為了更好地觀察xpr1-果蠅三齡幼蟲的NMJ,我們用HRP和DLG進(jìn)行標(biāo)記.共聚焦圖像顯示，與野生型相比，xpr1-果蠅的NMJ在形態(tài)上出現(xiàn)顯著差異，如圖3A和3B.xpr1-果蠅的NMJ的扣結(jié)明顯變小且不平滑，甚至出現(xiàn)衛(wèi)星扣結(jié)(環(huán)繞在正常突觸扣節(jié)周圍的略小的扣節(jié))，如圖3B箭頭所示所示.雖然xpr1-果蠅幼蟲NMJ的扣結(jié)變小(圖3D)，但其扣結(jié)數(shù)目(圖3C)、長度(圖3E)及伸展度(圖3F)沒有明顯變化.

圖3 xpr1-果蠅幼蟲的NMJ出現(xiàn)形態(tài)缺陷A，野生型果蠅(w1118)的NMJ染色圖.HRP(洋紅)，DLG(綠).B，xpr1-果蠅的NMJ染色圖.圖C、D、E及F分別為果蠅NMJ扣結(jié)數(shù)目、平均大小、NMJ長度以及覆蓋面積統(tǒng)計圖(n>20個NMJs, ***P<0.001)， Error bars 代表 s.e.m

2.3xpr1在NMJ發(fā)育中的功能主要集中在突觸前為了驗證xpr1-三齡幼蟲NMJ變小的結(jié)果，我們對xpr1-的NMJ分別進(jìn)行突觸前和突觸后挽救實驗.我們在xpr1突變的背景下用elav-Gal驅(qū)動UAS-xpr1-進(jìn)行突觸前挽救(elav-Gal4/+;UAS-xpr1/+;xpr1-)，結(jié)果顯示，與野生(圖4A)型相比，NMJ的表型恢復(fù)至正常水平(圖4C).當(dāng)在xpr1突變的背景下，使用C57-Gal4驅(qū)動UAS-xpr1進(jìn)行突觸后挽救(UAS-xpr1/+;C57-Gal,xpr1-/xpr1-)，結(jié)果顯示NMJ并沒有恢復(fù)至正常水平(圖4B)，NMJ的扣結(jié)呈緊密排列，與野生型對照相比扣結(jié)面積明顯較小(圖4F).然后我們又用elav-Gal4驅(qū)動UAS-xpr1進(jìn)行XPR1的高表達(dá)(圖4D)，結(jié)果顯示XPR1的高表達(dá)并不會影響幼蟲NMJ的形態(tài)發(fā)育.我們同樣對這些基因型的果蠅NMJ的扣結(jié)數(shù)目(圖4E)、長度(圖4G)和覆蓋面積(圖4H)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示均與對照組無顯著差異.突觸后挽救結(jié)果顯示NMJ扣結(jié)數(shù)目(圖4E)無顯著變化，大小(圖4F)明顯變小，這與圖片中顯示的結(jié)果一致.這些結(jié)果可能表明xpr1雖然在幼蟲NMJ的突觸前后均有表達(dá)，但在神經(jīng)肌肉接頭發(fā)育中的主要功能集中在突觸前的神經(jīng)系統(tǒng).

圖4 xpr1在NMJ中的功能主要集中在突觸前A，野生型果蠅(w1118)的NMJ染色圖(左).HRP(洋紅)，DLG(綠). B，使用C57-Gal4驅(qū)動UAS-xpr1對無功能突變體進(jìn)行突觸后挽救(UAS-xpr1/+;C57-Gal4, xpr1-/xpr1-)的NMJ染色圖片(C57 Rescue).C,使用elav-Gal4驅(qū)動UAS-xpr1對xpr1-進(jìn)行突觸前挽救(elav-Gal4/+;UAS-xpr1/+;xpr1-)的NMJ染色圖片(elav Rescue).D，使用elav-Gal4驅(qū)動UAS-xpr1對XPR1進(jìn)行高表達(dá)(elav-Gal4/+;UAS-xpr1/+)的NMJ染色圖片(elav UAS). 圖E、F、G及H分別為果蠅NMJ扣結(jié)數(shù)目、平均大小、NMJ長度以及覆蓋面積統(tǒng)計圖 (n>25個NMJs,***P<0.001)，Error bars 代表s.e.m.

3 結(jié)果與討論

xpr1-在果蠅三齡幼蟲NMJ中出現(xiàn)了NMJ扣結(jié)變小、排列緊密且不平滑等形態(tài)缺陷，說明該基因在NMJ具有較重要的功能.實驗中利用在突變體背景下用C57-Gal4在突觸后進(jìn)行回補表達(dá)xpr1, 發(fā)現(xiàn)并不能挽救xpr1-的缺陷表型；然而在突變體背景下用elav-Gal4在突觸前進(jìn)行回補表達(dá)xpr1，發(fā)現(xiàn)幼蟲NMJ的缺陷表型被挽救恢復(fù)至野生型水平，因此我們推測xpr1-在NMJ發(fā)育中的功能主要集中在突觸前.

人類xpr1與果蠅及其他動植物和單細(xì)胞生物編碼xpr1的同源基因具有高度的保守性，表明了其在細(xì)胞中發(fā)揮著重要的基礎(chǔ)功能.在人體中若xpr1發(fā)生突變會導(dǎo)致PFBC.我們的結(jié)果顯示在xpr1-果蠅的三齡幼蟲中其NMJ突觸后表達(dá)時不能挽救其突變體表型,說明xpr1在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用.

有研究表明XPR1參與cAMP信號通路的調(diào)節(jié)，影響cAMP的水平的主要原因為XPR1是一種非典型G蛋白偶聯(lián)受體.cAMP作為細(xì)胞的第二信使在許多細(xì)胞功能中都很重要，如細(xì)胞代謝、生長、凋亡及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和神經(jīng)傳遞等[6,15].cAMP通過與靶蛋白PKA結(jié)合，使蛋白激酶K(PKA)磷酸化激活調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá).cAMP水平增加會增強果蠅神經(jīng)肌肉連接結(jié)構(gòu)和功能.果蠅幼蟲的NMJ是谷氨酸能的突觸，NMJ發(fā)育過程的生命活動及突觸可塑性的調(diào)節(jié)是cAMP依懶性的. FasII(細(xì)胞粘連分子)能夠控制NMJ結(jié)構(gòu)而非功能的可塑性，在調(diào)控突觸前后發(fā)育中都發(fā)揮著重要作用，并且FasII還可以通過CREB(cAMP的應(yīng)答元件結(jié)合蛋白)與cAMP共同調(diào)節(jié)NMJ結(jié)構(gòu)與功能.CREB是cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，它是單個基因d(creb2)編碼的，d(creb2)根據(jù)需求可以通過選擇性的剪切和拼接成為激活因子dCREB2-a和抑制因子dCREB2-b.CREB可以啟動上游調(diào)控區(qū)含有cAMP反應(yīng)元件(CRE位點)的基因的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)它的抑制因子dCREB2-b在dunce(編碼cAMP特異性磷酸二酯酶，負(fù)責(zé)cAMP降解)突變體中表達(dá)時，會抑制CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄從而阻斷突觸的功能但不影響其活動.當(dāng)激活因子(dCREB2-a)的在FasII突變體表達(dá)時會激活CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，引起突觸的扣結(jié)數(shù)目增加，也就是說dCREB2-a 的表達(dá)重塑了突觸的cAMP依賴的可塑性[16].xpr1突變時磷酸鹽輸出功能受損，在人體中會導(dǎo)致PFBC，病人的大腦中發(fā)生羥基磷酸鈣沉淀的鈣化現(xiàn)象.有研究發(fā)現(xiàn)，給三周大的小鼠喂食缺鈣的食物時NMJ的結(jié)構(gòu)和功能會發(fā)生細(xì)微變化，肌肉缺乏持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)[17].由此可見xpr1對NMJ發(fā)育的影響是多方面的，后期我們將進(jìn)一步研究xpr1對NMJ發(fā)育的影響機制.