王夢龍，陳文慧，李曉詩，連麗媛，陳煒宏，張翠琳，陳兆貴，彭小群

（惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007）

火龍果原產(chǎn)于墨西哥中部熱帶地區(qū)和南美洲，屬于仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬多年生攀緣性肉質(zhì)植物［1］?；瘕埞鳛闊釒Ш蛠啛釒涔麡渖L的最適溫度為25～35 ℃，在泰國、菲律賓、馬來西亞和中國南部種植較為廣泛，具有耐旱、耐高溫、喜光耐陰和耐貧瘠的特點［2-3］。目前，紅皮白肉和紅皮紅肉火龍果已經(jīng)作為新興的水果在中美洲、東南亞和中國進行商業(yè)栽培和大規(guī)模生產(chǎn)［4-5］?；瘕埞且环N速生型果樹，在種植第2年即可開花結(jié)果，且具有多次開花結(jié)果的習性，單株全年可采6～12批次果，具有巨大的商業(yè)價值和經(jīng)濟價值。火龍果果實可以用于鮮食、釀酒、制作面條、冰淇淋和凍干品等［6］；火龍果的花可以用于觀賞、制作花茶和煲湯食用；而火龍果的果皮由于含有大量的花青素，可用于提煉食用色素［7-8］?；瘕埞麑崰I養(yǎng)豐富，富含植物蛋白、水溶性膳食纖維和其他有益化合物，具有美容養(yǎng)顏、抗氧化和增強免疫力等多種功效［1，9］。

目前，火龍果大田生產(chǎn)主要采用扦插的方法進行育苗。扦插繁殖能保持母本的優(yōu)良性狀，不易產(chǎn)生遺傳異型，但是扦插育苗需要高質(zhì)量的插條和一定規(guī)模的采穗圃，前期投入成本大［10-11］。另外，隨著火龍果種植業(yè)的不斷發(fā)展，火龍果種苗的需求不斷增大，從田間采集的種苗往往出現(xiàn)來源不明或者品種雜亂等現(xiàn)象，甚至攜帶病蟲害，使火龍果的產(chǎn)量受到嚴重的損害［7，12］。火龍果種子播種能獲得大量實生苗，但是直接播種存在種子發(fā)芽慢、出芽不齊、繁殖的植株性狀分化較大的問題，且種子發(fā)芽所長的植株幼年期長，果實生產(chǎn)延遲數(shù)年［8］?？焖?、優(yōu)質(zhì)和高效的擴繁方法對火龍果商業(yè)化生產(chǎn)非常重要。植物組織培養(yǎng)可以在短時間內(nèi)獲得大量健康的無菌苗，且不受外界環(huán)境的影響。近年來，火龍果組織培養(yǎng)研究取得一定的進展，文章將從外植體的選擇、外植體的消毒種類和方法、組培再生途徑以及生根培養(yǎng)等方面對火龍果組織培養(yǎng)技術(shù)進行綜述，以期為建立高效的火龍果組織培養(yǎng)提供理論依據(jù)，為火龍果的推廣應(yīng)用提供幫助。

1 外植體的選擇

植物組織培養(yǎng)中外植體的選擇會影響無菌體系的建立，是組培成敗的關(guān)鍵因素之一。目前用于火龍果組織培養(yǎng)的外植體主要有幼嫩的莖段、子葉、胚軸和花藥等。

DAHANAYAKE 和RANAWAKE［13］研究認為外植體的類型對火龍果不定芽再生能力的影響很大。在相同的培養(yǎng)基中，以莖為外植體誘導(dǎo)不定芽比以葉為外植體誘導(dǎo)不定芽效果好。王云山等［14］以火龍果不同長度帶刺座幼嫩莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷，發(fā)現(xiàn)以長度為3 cm幼嫩莖為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率可達100%。洪青梅等［15］研究發(fā)現(xiàn)以健壯無病害的紅皮紅肉火龍果‘金都一號’近成熟莖段為外植體，愈傷誘導(dǎo)率為80%。

另外，黃紅梅等［16］利用紅皮白肉火龍果種子發(fā)苗，利用幼苗的莖段、子葉和胚軸為外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)胚軸在所有供試的培養(yǎng)基中均沒有形成愈傷組織；莖段誘導(dǎo)的愈傷組織后期生長緩慢甚至停止生長，不能分化出不定芽；而子葉誘導(dǎo)的愈傷組織量大、長勢好，且能分化出不定芽和生長成植株，因此初步認為子葉是紅皮白肉火龍果誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體。彭思維［17］用紅皮紅肉火龍果‘紫紅龍’種子無菌發(fā)苗長出幼嫩植株，分別以幼嫩植株的莖段、子葉和胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。研究發(fā)現(xiàn)子葉誘導(dǎo)的愈傷組織褐化嚴重，不能成功分化；而莖段和胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織能成功分化出不定芽，但是芽苗呈黃綠色、細弱，不利于生根培養(yǎng)；只有以成熟‘紫紅龍’火龍果植株幼嫩莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)出新莖段為外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)的效率較高，分化能力強，且最終能獲得火龍果再生植株。

范建新［18］以紅皮紫紅肉‘紫紅龍’火龍果花藥為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)過4 ℃低溫預(yù)處理48 h 后愈傷組織誘導(dǎo)率可達32.8%。以上研究說明不同火龍果品種可用于誘導(dǎo)愈傷組織的外植體不同。此外，不同外植體的內(nèi)源激素不同，而內(nèi)源激素對愈傷組織的誘導(dǎo)率影響較大。范建新［18］研究發(fā)現(xiàn)‘紫紅龍’火龍果的莖段之所以易于誘導(dǎo)愈傷組織，與其莖段內(nèi)源IAA和ZT含量較高密切相關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)添加高濃度TDZ 有利于‘紫紅龍’莖段愈傷組織的形成，但不利于不定芽的再生［19］。

2 外植體的消毒種類和方法

選定外植體后，需要對外植體進行消毒處理。外植體的消毒方式與火龍果組織培養(yǎng)的成活率密切相關(guān)，消毒時間過長會導(dǎo)致外植體產(chǎn)生毒害，而消毒時間過短會使得外植體表面滅菌不徹底而導(dǎo)致污染。合適的消毒劑既需要將表面的細菌微生物徹底殺死，又不能對外植體造成毒害。目前組培上常用體積分數(shù)為75%酒精［7］、w=0.1%升汞［19-20］或者低質(zhì)量分數(shù)的次氯酸鈉［8］對外植體進行消毒。根據(jù)不同外植體的情況需選擇不同的消毒方式和消毒時間進行處理。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，對火龍果莖段的消毒可采用75%酒精消毒30～60 s，用無菌蒸餾水沖洗3次，然后用w=0.1%升汞消毒8～15 min，最后用無菌蒸餾水沖洗3～5 次［7，21］。王云山等［14］以生長健壯母莖的新生莖段為外植體，采用w=0.1%的升汞消毒處理15 min后外植體污染率最低，但大部分外植體材料的刺座及莖棱會出現(xiàn)褐化和壞死現(xiàn)象，說明用w=0.1%的升汞消毒15 min時間過長，會導(dǎo)致莖段組織細胞壞死。有研究發(fā)現(xiàn)儲存在10 ℃條件下，3 個月的火龍果種子其活力顯著下降，而剛從果肉中分離的種子更適合用于生產(chǎn)外植體［13］?；瘕埞N子的消毒需要將種子清洗干凈，用w=0.1%升汞消毒4 min再用無菌蒸餾水沖洗3～5次，或者用w=3%次氯酸鈉消毒12 min后再用無菌蒸餾水沖洗3～5 次［17］。DAHANAYAKE 和 RANAWAKE［13］則通過將種子單獨浸泡過夜后先用70%酒精消毒2 min，再在含有體積分數(shù)為6%吐溫20 和質(zhì)量分數(shù)為1%的次氯酸鈉中浸泡10 min 進行表面消毒，最后用無菌水洗數(shù)次。細菌污染以及對次氯酸鈉消毒的高組織敏感性是目前仙人掌科植物組培常見的問題。有研究認為在消毒過程中可使用內(nèi)吸性殺菌劑與廣譜防腐劑相結(jié)合的方法［3］。TRIVELLINI 等［3］研究發(fā)現(xiàn)添加廣譜抗生素頭孢噻肟至培養(yǎng)基中有助于去除內(nèi)源性污染，而且可能對連續(xù)誘導(dǎo)階段的外植體增殖產(chǎn)生有益的影響。另外有研究報道可通過添加吐溫20 以及抽真空的方式增強消毒效果［3，13］。

3 組織培養(yǎng)再生途徑

目前火龍果組織培養(yǎng)體系的建立主要通過直接器官發(fā)生和間接器官發(fā)生2種方式。直接器官發(fā)生是指外植體不經(jīng)過愈傷組織階段，直接分化不定芽，生根成苗。間接器官發(fā)生是指外植體脫分化形成愈傷組織，愈傷組織再分化形成不定芽，繼而生根成苗。直接器官發(fā)生周期短，且不易發(fā)生變異，是火龍果組織培養(yǎng)研究常用的方法。

3.1 直接器官發(fā)生途徑

在火龍果組織培養(yǎng)過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑雖然用量少，但是對外植體直接器官發(fā)生起著至關(guān)重要的作用。在組培中，TDZ、ZT、6-BA和2，4-D常用于不定芽誘導(dǎo)再生［7］。

HUA等［7］研究發(fā)現(xiàn)火龍果外植體對TDZ的敏感性比對 ZT，6-BA 和 2，4-D 高。低至 0.11 μmol/L 的 TDZ可誘導(dǎo)外植體近端基部形成綠色致密愈傷組織，從而顯著抑制已經(jīng)形成的枝條生長。增加6-BA、TDZ 或ZT 的濃度，可使每個外植體枝條數(shù)顯著增加，但枝條高度會顯著降低。當 2，4-D 濃度小于 0.45 μmol/L 時有利于枝條繁殖，而較高濃度（≥0.45 μmol/L）則會導(dǎo)致產(chǎn)生易碎的愈傷組織。

火龍果不定芽的形成受細胞分裂素和生長素相互作用調(diào)控。MOHAMED-YASSEEN［22］研究報道火龍果不定芽增殖最佳的培養(yǎng)基為含有0.5 mmol/L TDZ 和0.5 mmol/L NAA的MS培養(yǎng)基；FAN等［21］發(fā)現(xiàn)火龍果不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基是具有2.0 mmol/L 6-BA 和0.5 mmol/L NAA 的 MS 培養(yǎng)基；DAHANAYAKE 和 RANAWAKE［13］研究發(fā)現(xiàn)以幼莖為外植體，在MS+2.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后可產(chǎn)生愈傷組織，隨后3周產(chǎn)生多個芽原基，并進一步分化為不定芽；而HUA等［7］研究發(fā)現(xiàn)每個外植體的最佳芽數(shù)是在培養(yǎng)基中添加13.68 μmol/L ZT和2.46 μmol/L IBA獲得的。

在火龍果不定芽誘導(dǎo)中，細胞分裂素6-BA具有重要的調(diào)控作用［13，21］。彭綠春等［23］研究發(fā)現(xiàn)用保留小刺和絨毛的莖段誘導(dǎo)不定芽，不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為 MS+2～4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 或者為 MS+0.4～0.6 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA；而不定芽增殖最適培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，增殖系數(shù)可達6.4。牟海飛等［12］研究發(fā)現(xiàn)，以紅皮紅肉火龍果‘桂紅龍1號’莖段為外植體，在培養(yǎng)基中添加4 mg/L 6-BA，不定芽誘導(dǎo)效率最高。但是隨著6-BA 質(zhì)量濃度的增加，雖然不定芽誘導(dǎo)增殖倍數(shù)也增高，但是會出現(xiàn)玻璃化的現(xiàn)象。洪青梅等［15］以‘金都1號’成熟莖為外植體誘導(dǎo)不定芽，發(fā)現(xiàn)不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，不定芽誘導(dǎo)率可達80%。李清香和吳紅英［24］研究發(fā)現(xiàn)以‘金都1號’新萌芽莖段誘導(dǎo)不定芽，不定芽誘導(dǎo)最適合培養(yǎng)基中也是只需含少量NAA（0.1 mg/L），但是6-BA的質(zhì)量濃度需要達到8 mg/L。何小帆等［25］以紅心火龍果幼嫩莖段為外植體誘導(dǎo)不定芽，發(fā)現(xiàn)不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+3 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA，誘導(dǎo)率可達87.03%。鄧仁菊等［26］以‘紫紅龍’成年火龍果1年生植株莖段為外植體，研究不同生長調(diào)節(jié)劑及配比對莖段不定芽誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)‘紫紅龍’火龍果不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.1～0.2 mg/L NAA，不定芽增殖系數(shù)最高的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+500 mg/L 胰蛋白胨。NIE 等［2］研究發(fā)現(xiàn) 4 個火龍果品種‘Zihonglong’‘Honglongguo’‘B4’和‘ZY’均可在含有 0.1 mmol/L NAA 和2 mmol/L 6-BA 的MS 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽。由于在細胞分裂素中，6-BA 的價格是最便宜的，并且能進行高壓滅菌?？紤]到操作的便利性和成本，火龍果不定芽的誘導(dǎo)可優(yōu)先在培養(yǎng)基中使用6-BA。

3.2 間接器官發(fā)生途徑

通過間接器官發(fā)生途徑建立火龍果的再生體系可對火龍果進行遺傳轉(zhuǎn)化研究，改善火龍果品質(zhì)，提高種苗質(zhì)量。黃紅梅等［16］研究發(fā)現(xiàn)以火龍果子葉為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，最適培養(yǎng)基為1/2 MS+2 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA，以莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA。彭思維等［19］以紅皮紅肉火龍果‘紫紅龍’幼嫩莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)最佳誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA。高質(zhì)量濃度的TDZ 有利于莖段愈傷組織形成，但是不利于不定芽的再生。李羽佳等［27］以黃皮白肉火龍果種子萌發(fā)的莖段為外植體，發(fā)現(xiàn)最適合誘導(dǎo)的愈傷組織的培養(yǎng)基為1/2 MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA。

目前，關(guān)于火龍果遺傳轉(zhuǎn)化體系研究的報道極少。范建新［18］以紅皮紅肉火龍果‘紫紅龍’組培苗的幼嫩莖段（變態(tài)葉）為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將LTP（Liquid transfer protein）基因?qū)牖瘕埞崮矍o段獲得25株轉(zhuǎn)LTP基因的再生植株，轉(zhuǎn)化效率可達37.5%，且轉(zhuǎn)基因植株抗寒性顯著提高。但是以‘紫紅龍’火龍果花藥培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)化抗寒基因LTP，雖然能獲得抗性愈傷，但是不能成功分化出不定芽。彭思維［17］雖然能以‘紫紅龍’火龍果的莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織并分化獲得組培苗，但是并沒有對莖段的愈傷組織進行遺傳轉(zhuǎn)化實驗。

4 生根培養(yǎng)與移栽

火龍果生根的基本培養(yǎng)基一般為MS或者是1/2 MS。NIE 等［2］通過在1/2 MS 培養(yǎng)基中添加 0.1 mmol/L NAA對于 4 個火龍果品種‘Zihonglong’‘Honglongguo’‘B4’和‘ZY’的生根均有促進作用。DAHANAYAKE 和RANAWAKE［13］研究發(fā)現(xiàn)火龍果生根的最佳培養(yǎng)基為MS+0.01 mg/L NAA。

有研究發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一定濃度的活性炭（AC）有利于促進根的生長，而添加一定量的矮壯素（CCC）有利于苗的粗壯［19，26］。彭思維等［19］誘導(dǎo)火龍果莖段形成愈傷組織后對從生芽進行生根培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在含有200 mg/L AC以及0.5 mg/L CCC的MS培養(yǎng)基中從生芽的生根率可達97%，平均根數(shù)為7.0，平均根長可達10.3 cm。鄧仁菊等［26］以火龍果成年莖段誘導(dǎo)不定芽進行生根擴繁，發(fā)現(xiàn)最佳的生根培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1～0.2 mg/L NAA+0.5～1.0 mg/L CCC+0.03%～0.05%AC，不定芽的生根率可達98%。值得注意的是，AC的吸附能力很強，但是其吸附不具選擇性，除了可以吸附培養(yǎng)基中的有毒物質(zhì)外，也會吸附營養(yǎng)物質(zhì)，對組培苗產(chǎn)生影響，因此在實際操作過程中應(yīng)根據(jù)材料的狀況摸索出合適的濃度。

有研究認為低無機鹽濃度有利于根系生長，黃彩枝［28］以海南紅心火龍果為研究對象，發(fā)現(xiàn)其最佳的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1 mg/L IBA+0.8 mg/L ABT，生根率可達100%。黃紅梅等［16］研究發(fā)現(xiàn)當火龍果在生根培養(yǎng)基1/2 MS+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA中培養(yǎng)，平均根數(shù)可達5.14，根長4 cm。值得一提的是，F(xiàn)AN等［21］研究發(fā)現(xiàn)：與瓊脂相比，珍珠巖促進了體外芽的根誘導(dǎo)和新根的形成。將發(fā)育良好的枝條轉(zhuǎn)移到含有1 μmol/L NAA的1/2MS液體培養(yǎng)基中，用珍珠巖代替瓊脂生根，生根率達100%；在3周內(nèi)可從每個芽中獲得6～10個白根，每根根長達5～8 cm。成苗后的火龍果移栽較為方便，將生根良好的火龍果苗去除瓊脂，用自來水洗凈之后可置于v（土壤）∶v（珍珠巖）=1∶1 的混合物中，在生長室下蓋上塑料7～10 d，隨后移至溫室大棚生長或者轉(zhuǎn)移到含有v（土壤）∶v（沙子珍珠巖）=1∶1的混合物的盆中以適應(yīng)環(huán)境即可［3，21］。

5 討論及展望

火龍果組織培養(yǎng)體系的建立能在短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)的無菌苗，可以滿足日益增大的市場需求，但是也存在一些問題：一是火龍果品種繁多，不同研究學(xué)者針對不同品種或者同一品種不同外植體的火龍果進行研究得出的組織培養(yǎng)各階段最佳的生長條件和最適的植物生長調(diào)節(jié)劑種類以及配比均有差異，這可能與不同品種的材料以及同一品種不同外植體的內(nèi)源激素含量不同有關(guān)，也可能與不同品種的不同的遺傳背景有關(guān)［7-8］，因此，實際操作需要通過實驗篩選出最合適的條件。二是關(guān)于火龍果的組織培養(yǎng)研究大部分集中于直接器官發(fā)生途徑，對于通過外植體誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)不定芽從而生根成苗的研究報道極少。目前，火龍果的遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未成熟，所以在火龍果的遺傳改良和種質(zhì)資源保存等方面的研究較少。例如由真菌Neoscytalidium dimidiatum引起的潰瘍病是火龍果行業(yè)最具破壞性的疾病之一，難以像模式植物一樣通過轉(zhuǎn)基因的方法研究火龍果的基因功能對其進行改良育種［29］；另外，對火龍果調(diào)控鹽脅迫相關(guān)的基因功能研究只能通過異源表達至其他模式植物中進行研究，火龍果的抗逆品種的培育還任重道遠［30］。近年來科研工作者關(guān)注到火龍果中參與非生物脅迫和抗氧化酶相關(guān)基因的功能［1-2］，通過遺傳轉(zhuǎn)化手段將相關(guān)基因?qū)牖瘕埞仓赀M行研究將對火龍果的保鮮具有一定的指導(dǎo)意義。隨著火龍果產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對火龍果進行遺傳改良獲得品質(zhì)優(yōu)良、抗性好的火龍果種質(zhì)將是未來的研究熱點之一。