蔣孟圓，陳俊秀，農(nóng)蕊瑜，申穎，李潔，胡琳，李文廷*

(1.云南民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，昆明 650500；2.昆明市疾病預(yù)防控制中心，昆明 650228)

芝麻醬和花生醬具有豐富的植物蛋白、維生素和礦物質(zhì),是大眾消費者普遍喜愛的香味調(diào)味品[1-2]。出于消費者口味的考量，商家會加入風(fēng)味獨特如板栗等上乘的食材，也有商家為了博取豐厚的利潤而添加大豆、玉米等廉價原材料[3-5]，另外不同的加工方式對芝麻醬和花生醬的粒徑和穩(wěn)定性均有不同影響，在儲存過程中，容易出現(xiàn)析油分層現(xiàn)象，對品質(zhì)保障具有一定的影響[6]。然而，由于原材料或者添加的輔料本身在種植、儲藏、轉(zhuǎn)運過程中以及成品在儲存售賣期間均可能受到霉菌的污染，給商家造成經(jīng)濟損失，給消費者的健康和食品安全形成嚴(yán)重威脅[7]。

黃曲霉毒素(aflatoxins，AFT)是在濕熱條件下主要由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，主要有黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFTB1)、黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFTB2)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFTG1)和黃曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFTG2)，其中AFTB1的毒性最強，污染程度也最嚴(yán)重，黃曲霉毒素的毒性作用主要表現(xiàn)為嚴(yán)重破壞人及牲畜的肝臟組織，導(dǎo)致肝癌或死亡[8-10]。近乎50%的霉菌品種如赭曲霉菌、黑曲霉菌、青霉屬等都能產(chǎn)生赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)。OTA的危害主要表現(xiàn)為腎臟及肝臟毒性, 引起致突變、致癌和致畸[11]。各國都致力于嚴(yán)格監(jiān)控這些毒素的含量，我國標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[12]規(guī)定花生制品的AFTB1限值為20 μg/kg，其他制品為5.0 μg/kg，OTA限值為5.0 μg/kg。

目前5種真菌毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-16]，酶聯(lián)免疫法雖然校測效率高，但靈敏度和準(zhǔn)確度較低。高效液相色譜法為常見的檢測方法，但只能檢測單一類毒素，對多毒素樣品的測定需要較大時限。而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度、準(zhǔn)確性及選擇性都較高。由于近些年昆明市售芝麻醬和花生醬存在一定霉菌污染情況[17-18]，本文針對云南市售芝麻醬、花生醬和黃豆醬樣品，通過優(yōu)化樣品前處理條件，采用內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確定量，建立5種真菌毒素同時檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，為政府相關(guān)職能部門提供了技術(shù)及數(shù)據(jù)支持，保障了居民的食用及健康安全。

1 材料與方法

1.1 材料

檢測樣品由云南紅河、曲靖、楚雄、大理和昆明5州市疾病預(yù)防控制中心進行采集提供，每個地方分別采集花生醬、芝麻醬和黃豆醬每類樣品2件，共計30件。

1.2 儀器與試劑

1290 InfinityⅡ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent Technologies公司；QTRAP 4500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國AB SCIEX公司；XS205DU分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；3H16RI智能臺式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、OTA和同位素內(nèi)標(biāo)13C17-AFTB1、13C17-AFTB2、13C17-AFTG1、13C17-AFTG2、13C20-OTA(10.2 μg/mL)以及質(zhì)控樣MRM-AC-2909和MRM-AW-0211：均購于Pribolab中國公司；甲醇和乙腈：均為色譜純，購于美國Sigma-Aldrich公司；質(zhì)控樣Lot#M15361A：購于Romer Labs公司。

1.3 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm), 柱溫為40 ℃, 流動相A相：甲醇∶乙腈混合體積比1∶1，B相：0.2%甲酸水溶液。流速為0.3 mL/min, 進樣體積為10 μL, 分析運行時間為6.0 min。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI)，采用正離子掃描模式，離子源溫度為550 ℃；離子噴霧電壓為5500 V；氣簾氣(curtain gas)為25 psi；霧化氣(gas 1)為55 psi；輔助氣(gas 2)為55 psi；多反應(yīng)監(jiān)測模式測定(MRM)。

1.5 實驗方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別將5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用乙腈稀釋至濃度為1.0 μg/mL儲備液，同位素內(nèi)標(biāo)液用乙腈稀釋為0.5 μg/mL工作液，再用乙腈水溶液(2∶8，體積比)配制標(biāo)準(zhǔn)系列，標(biāo)準(zhǔn)系列中每個溶液點內(nèi)標(biāo)含量均為1.0 μg/L，分別儲存于-20 ℃條件下。

1.5.2 樣品前處理

精確稱取試樣(2±0.01) g于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水-甲酸溶液(70∶29∶1，體積比)于多功能渦旋振蕩器上提取30 min，離心機10000 r/min離心5 min，取10 mL上清液用氮吹濃縮至近干，加入同位素內(nèi)標(biāo)工作液，使樣品中含量均為1.0 μg/L，乙腈水溶液(2∶8，體積比)定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測模式的選擇

通過對5種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和同位素內(nèi)標(biāo)的母離子和子離子進行尋找，在相同濃度條件的檢測中，負(fù)離子模式下響應(yīng)強度為104左右，而正離子模式下響應(yīng)強度可達106，并且AFTG2和OTA的子離子在負(fù)離子模式下較少分裂產(chǎn)生碎片離子峰，響應(yīng)強度基本在103附近，在正離子模式下5種真菌毒素有較好的二級質(zhì)譜碎片離子分裂情況，響應(yīng)強度較明顯，因此選擇正離子模式測定分析樣品。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

通過對流動相組成和配比進行考察，B相為純水時目標(biāo)峰的響應(yīng)強度較低甚至未出現(xiàn)目標(biāo)峰，加入甲酸后目標(biāo)峰的響應(yīng)強度有顯著加強。A相為單一有機相時目標(biāo)化合物的分離度較小，當(dāng)為混合有機相時能達到較好的分離效果，目標(biāo)化合物的總離子圖見圖1。因此確定了甲醇-乙腈按1∶1體積比混合為A相，0.2%甲酸水為B相，洗脫程序：0～1.0 min，60% B；1.0～2.0 min，60% B～30% B；2.0～3.0 min，30% B～0% B；3.0～3.5 min，0% B；3.5～4.5 min，0% B～30% B；4.5～5.5 min，30% B～60% B；5.5～6.0 min，60% B。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

依次將5種真菌毒素儲備液及同位素內(nèi)標(biāo)工作液稀釋至500.0 μg/L，在流動注射狀態(tài)下，利用Q1 MS全掃描以及Product Ion Scan(MS2)碎片離子掃描模式分別進行各真菌毒素的一級、二級質(zhì)譜碎片離子尋找，取響應(yīng)程度較高的前2個碎片離子作為定量和定性離子, 通過儀器MRM掃描模式優(yōu)化去簇電壓及碰撞能量參數(shù)，詳細(xì)參數(shù)見表1，在此條件下5種真菌毒素的總離子色譜圖見圖1，各真菌毒素的碎片離子MRM譜圖見圖2。

表1 5種真菌毒素及同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The mass spectrum parameters for five mycotoxins and isotope internal standard

圖1 5種真菌毒素在10 μg/L濃度的總離子色譜圖Fig.1 The TIC of five mycotoxins at 10 μg/L

圖2 5種真菌毒素在10 μg/L濃度的MRM色譜圖Fig.2 The MRM chromatograms of five mycotoxins at 10 μg/L

2.4 樣品提取凈化的優(yōu)化

考察了不同提取溶劑對5種真菌毒素回收率及質(zhì)控樣測定值的影響，70%乙腈-水具有96%的提取效率，為所對比提取溶劑中最高值，加入1%的甲酸可以加強5種真菌毒素的穩(wěn)定性，提高實驗測定值的重現(xiàn)性。由于樣品基質(zhì)復(fù)雜情況不同，而免疫親和柱對真菌毒素特異選擇性不同，且對于基層實驗室使用成本較高，采用物理吸附的多功能凈化柱，可吸附大部分干擾雜質(zhì)，操作步驟較為簡單，很大程度上提高了樣品的凈化效率，通過同位素內(nèi)標(biāo)的定量可以滿足實驗室的檢測要求。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系及檢出限

通過上述優(yōu)化的樣品前處理條件和色譜及質(zhì)譜條件，對樣品進行真菌毒素的測定，以定量離子峰的峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在所檢測的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.9990以上。以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)的濃度為方法檢出限，10倍信噪比對應(yīng)的濃度為方法定量限，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2。

表2 5種真菌毒素的線性關(guān)系、檢測限

2.5.2 方法的回收率

選取花生醬基質(zhì)樣品進行加標(biāo)回收實驗，分別添加混合真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液至濃度為1.0，2.0，10.0 μg/kg，按照樣品前處理條件進行處理并上機測定，每個添加濃度做6個平行實驗，5種真菌毒素的平均回收率為87.1%～103.4%，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)作為方法的精密度，結(jié)果為1.18%～5.26%，具體結(jié)果見表3。

表3 5種真菌毒素的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.6 質(zhì)量控制

分別精確稱取3種真菌毒素質(zhì)控樣,依據(jù)樣品前處理方法進行處理,檢測結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)證書要求，結(jié)果見表4。

表4 準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)Table 4 The accuracy data μg/kg

樣品的加標(biāo)回收率、精密度以及質(zhì)控樣品的測定數(shù)據(jù)表明，芝麻醬、花生醬和黃豆醬樣品按照此種方法提取凈化分析，具有較高的提取效率，準(zhǔn)確度較好。

2.7 樣品檢測分析

30件樣品中，真菌毒素的檢出情況根據(jù)樣品種類存在明顯的差異，花生醬樣品中有4件檢出AFTB1，檢出率為40%，其中2件檢測結(jié)果超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限值20 μg/kg，超標(biāo)率為20%，2件檢出AFTB2，檢出率為20%，其他毒素未檢出；芝麻醬樣品中有1件檢出AFTB1，且檢測結(jié)果超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限值5.0 μg/kg，檢出率和超標(biāo)率均為10%，其他毒素未檢出；黃豆醬樣品中真菌毒素均未檢出。從整批次樣品統(tǒng)計來分析，5件檢出AFTB1，檢出率為16.7%；3件超標(biāo)，超標(biāo)率為10%；2件檢出AFTB2，檢出率為6.7%；其余均為未檢出。云南市售芝麻醬和花生醬中真菌毒素的污染情況不容樂觀，應(yīng)引起相關(guān)政府職能部門的重視，檢出情況見表5。

表5 真菌毒素含量檢出詳情Table 5 The detecting details of mycotoxins' content

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定芝麻醬、花生醬和黃豆醬中5種真菌毒素的檢測方法，該方法的樣品前處理簡單、檢測便捷，整個實驗的靈敏度和準(zhǔn)確度高，回收率好，可以滿足日常監(jiān)測工作對多種調(diào)味制品中5種真菌毒素的同時定性定量檢測分析要求。