范二紅 魯 平

1 西華第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南省周口市 466600； 2 河南省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科

2型糖尿病是我國最常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，具有發(fā)病率逐年升高但血糖控制達(dá)標(biāo)率較低的流行病學(xué)特點(diǎn)。心腦血管并發(fā)癥是2型糖尿病常見的并發(fā)癥，血管內(nèi)皮損傷是與糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生密切相關(guān)的病理環(huán)節(jié)，長期血糖升高能夠通過細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等途徑來引起內(nèi)皮損傷[1-2]。因此，減輕高糖環(huán)境所引起的血管內(nèi)皮損傷是防治糖尿病血管并發(fā)癥的重要靶點(diǎn)。紅景天苷是中藥紅景天中的活性成分，具有改善微循環(huán)、保護(hù)細(xì)胞等生物學(xué)作用。國內(nèi)姜曉斐等研究報(bào)道紅景天苷能夠減輕低氧引起的內(nèi)皮損傷[3]，但紅景天苷對高糖引起內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用及機(jī)制尚未明確。為此，本研究具體分析了紅景天苷對高糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs，ATCC公司)，紅景天苷(中國藥品生物制品檢定所)，凋亡檢測試劑盒(TUNEL法，上海碧云天公司)，mRNA表達(dá)檢測試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)，Bax、Bcl-2、Caspase-3、NOX2、NOX4的第一抗體購自Abcam公司，丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：HUVEC在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞密度生長至85%～90%時(shí)，用0.25%的胰酶對細(xì)胞進(jìn)行消化，離心收集消化后的細(xì)胞并進(jìn)行常規(guī)傳代。傳代后接種在培養(yǎng)板中的細(xì)胞分為三組：對照組用低糖培養(yǎng)基(5.5mmol/L葡萄糖)處理，高糖組用高糖培養(yǎng)基(33mmol/L葡萄糖)處理，紅景天苷組用含有10μg/ml紅景天苷的高糖培養(yǎng)基處理。

1.2.2 細(xì)胞凋亡率的檢測：不同條件處理24h后，棄去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞2遍，用TUNEL法進(jìn)行凋亡檢測，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作后在顯微鏡下觀察TUNEL陽性細(xì)胞、DAPI陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)后計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 基因mRNA及蛋白表達(dá)的檢測：不同條件處理24h后，棄去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞2遍，加入Trizol裂解液提取RNA后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)曲線計(jì)算Bcl-2、Bax、Caspase-3、NOX2、NOX4的mRNA表達(dá)水平；加入RIPA裂解液提取蛋白后進(jìn)行western blot檢測，完成電泳、封閉、抗體孵育后通過ECL系統(tǒng)檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、NOX2、NOX4的蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 氧化應(yīng)激產(chǎn)物的檢測：不同條件處理24h后，取細(xì)胞培養(yǎng)基采用MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒測定MDA、SOD、GSH-Px的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件處理數(shù)據(jù)，三組間計(jì)量資料的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組間細(xì)胞凋亡率比較 對照組的細(xì)胞凋亡率為(9.82±1.35)%、高糖組的細(xì)胞凋亡率為(33.58±6.61)%、紅景天苷組的細(xì)胞凋亡率為(15.23±2.24)%。與對照組比較，高糖組的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與高糖組比較，紅景天苷組的細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

2.2 三組間凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較 與對照組比較，高糖組細(xì)胞中Bax、Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；與高糖組比較，紅景天苷組細(xì)胞中Bax、Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 三組間凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3比較

2.3 三組間氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)比較 與對照組比較，高糖組細(xì)胞中NOX2、NOX4的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與高糖組比較，紅景天苷組細(xì)胞中NOX2、NOX4的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組間氧化應(yīng)激相關(guān)基因NOX2、NOX4比較

2.4 三組間氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量比較 與對照組比較，高糖組細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA的含量明顯升高，SOD、GSH-Px含量明顯降低(P<0.05)；與高糖組比較，紅景天苷組細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA含量明顯降低，SOD、GSH-Px含量明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 三組間氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、SOD、GSH-Px比較

3 討論

2型糖尿病患者血糖控制不佳會增加心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生率。血糖控制不佳會導(dǎo)致患者長期處于高糖環(huán)境，血管內(nèi)皮細(xì)胞在高糖的刺激下會發(fā)生損害并參與血管并發(fā)癥的發(fā)生。近年來，血管內(nèi)皮損害與心腦血管疾病間的密切關(guān)系受到了越來越多的關(guān)注，血管內(nèi)皮作為血液與血管壁之間的機(jī)械屏障，發(fā)生損害后會造成血小板、炎癥細(xì)胞等在損傷局部浸潤并逐步形成血栓，不加以干預(yù)會最終發(fā)展為血栓栓塞[4-5]。紅景天苷是我國傳統(tǒng)中藥材紅景天中的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，已經(jīng)被證實(shí)能夠減輕過氧化氫所引起的視網(wǎng)膜色素水平細(xì)胞損害、缺氧引起的神經(jīng)元損害、糖基化終末產(chǎn)物引起的內(nèi)皮損害[6]。本研究將紅景天苷用于高糖引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)，通過觀察細(xì)胞凋亡情況可知：高糖組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，而紅景天苷組的細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組，提示紅景天苷能夠減輕高糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑的過度激活是與高糖、缺氧、氧自由基增多等病理?xiàng)l件引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的病理環(huán)節(jié)[7]。Bax和Bcl-2是線粒體膜上通過改變細(xì)胞色素C通透性來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一對分子，Bax能夠通過形成同源二聚體來促進(jìn)細(xì)胞色素C的通透、使線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C大量進(jìn)入細(xì)胞漿并通過激活Caspase-3來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]；Bcl-2能夠與Bax形成異源二聚體、阻礙細(xì)胞色素C的通透，進(jìn)而抑制細(xì)胞色素C對Caspase-3的激活、阻礙細(xì)胞凋亡的發(fā)生[9]。本研究分析顯示：高糖處理后細(xì)胞中Bax、Caspase-3表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，表明高糖激活了線粒體途徑凋亡；高糖處理的同時(shí)加用紅景天苷后，細(xì)胞中Bax、Caspase-3表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增加，表明紅景天苷能夠抑制高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體途徑凋亡的激活。

線粒體途徑凋亡的過度激活是線粒體功能在高糖環(huán)境下發(fā)生紊亂的表現(xiàn)之一，除此之外，線粒體功能紊亂還會影響氧化呼吸鏈中的電子傳遞發(fā)生障礙、游離電子向氧分子轉(zhuǎn)移并產(chǎn)生氧自由基，進(jìn)而通過氧自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)來造成細(xì)胞損傷[10]。NOX2和NOX4是NOXs家族中參與內(nèi)皮細(xì)胞線粒體內(nèi)電子轉(zhuǎn)移過程的成員，高表達(dá)的NOX2和NOX4能促進(jìn)游離電子及氧自由基的產(chǎn)生，與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)并造成細(xì)胞損傷，同時(shí)使氧化產(chǎn)物MDA的生成及抗氧化酶SOD及GSH-Px的消耗增多[11]。本研究對高糖條件下HUVEC中以上氧化應(yīng)激基因及產(chǎn)物的分析顯示：高糖處理后細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA的含量及NOX2、NOX4的表達(dá)水平增加，SOD、GSH-Px的含量降低，表明高糖激活了氧化應(yīng)激反應(yīng)；高糖處理的同時(shí)加用紅景天苷后，培養(yǎng)基中MDA的含量及NOX2、NOX4的表達(dá)水平降低，SOD、GSH-Px的含量增加，表明紅景天苷對高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活具有抑制作用。

綜上所述，紅景天苷對高糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激具有抑制作用，未來可進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證紅景天苷對糖尿病大鼠內(nèi)皮功能的保護(hù)作用。