王致紅，王施元，曹 波，張銘予，李泰峰，李春雨，李國輝(國家癌癥中心，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院藥劑科，北京 000)

根據(jù)Chen等[1]發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，肺癌整體的發(fā)病率和死亡率在我國惡性腫瘤中均居首位，不僅有礙于我國人民的身體健康，并且對于經(jīng)濟發(fā)展和社會可持續(xù)發(fā)展極為不利。吉非替尼在我國被廣泛用于治療肺癌，但是，使用吉非替尼治療的患者的無進展生存期僅約1年，其繼發(fā)性耐藥會導致致命的疾病進展[2]。因此，腫瘤用藥如何達到預防、逆轉腫瘤患者耐藥是腫瘤治療亟待解決的關鍵問題。從中醫(yī)角度講，四君子湯能夠扶正培本，多項研究結果顯示，四君子湯及其加減方在治療肺癌、腸癌和胃癌等惡性腫瘤方面有顯著療效，在抑制腫瘤復發(fā)、轉移等方面的優(yōu)勢也極為突出[3]。本研究主要考察四君子湯聯(lián)合吉非替尼對非小細胞肺癌PC9細胞的協(xié)同抑制作用以及對細胞凋亡、細胞周期的影響，以期為中醫(yī)經(jīng)典名方逆轉分子靶向藥物的耐藥研究及中西藥聯(lián)合治療肺癌提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 肺癌細胞株

非小細胞肺癌細胞株PC9細胞購于湖南豐暉生物科技有限公司。PC9細胞培養(yǎng)于含新鮮DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中，DMEM培養(yǎng)液內(nèi)含青霉素(1×105U/L)、鏈霉素(100 mg/L)和10%胎牛血漿，將其放置于5%CO2、37 ℃恒溫全濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔24 h換液或傳代。

1.2 儀器

SA8型渦旋混合器(比比科技亞洲有限公司)；GloMax? Discover微孔板閱讀器(美國Promega公司)；777-7A型超凈工作臺(北京長城空氣凈化工程公司)；CO2培養(yǎng)箱(芬蘭Thermo公司)；Centrifuge 5427R型臺式冷凍離心機(德國Eppendorf有限公司)。

1.3 藥品與試劑

四君子湯由人參(6 g)、茯苓(6 g)、白術(6 g)、甘草(4 g)組成，以上藥物均購自北京華邈藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定皆為合格藥材。吉非替尼(批號為Lot#5-SXG-56-1，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS(美國Gibco公司)；CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability Assay試劑盒(美國Promega公司)；100×青霉素/鏈霉素混合液及0.05% EDTA-胰酶(美國Invitrogen公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；細胞周期檢測試劑盒(中國碧云天生物技術研究所)。

1.4 CellTiter-Glo(CTG)發(fā)光法檢測藥物對細胞增殖作用的影響

取處于對數(shù)生長期的PC9細胞進行消化、離心、混勻后再計數(shù)，根據(jù)所需體積，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，混勻，然后按照每孔100 μL接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察到細胞貼壁后按照實驗分組(空白組、對照組、四君子湯組、吉非替尼組和兩藥聯(lián)合給藥組)，加入含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基，給藥48 h后將96孔板中的液體吸凈，在每孔中加入60 μL配置好的CellTiter-Glo?試劑，在37 ℃條件下繼續(xù)孵育30 min，確保藥物與細胞完全反應，然后將96孔板中液體全部轉移至96孔白板中，期間不要產(chǎn)生氣泡，之后利用GloMax? Discover微孔板閱讀器上機檢測各組藥物在波長為450 nm處的吸光度值(A)，重復上述實驗過程3次，按照公式抑制率=[(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)]×100%進行分析。公式中，“A對照”表示對照組(含有細胞和CTG溶液)的吸光度值；“A實驗”表示加藥組(含有細胞、藥物和CTG溶液)的吸光度值；“A空白”表示空白組(只加CTG溶液)的吸光度值。

1.5 利用中效原理評價藥物聯(lián)合應用效應

根據(jù)“1.4”項下各藥單獨給藥和聯(lián)合給藥后對藥物的抑制率，應用中效原理(Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法)評價四君子湯和吉非替尼之間的相互作用，使用Calcusyn 1.0軟件計算出抑制率-聯(lián)合指數(shù)(Fa-CI)并繪制CI曲線，CI=D1/DX1+D2/DX2+αD1D2/DX1DX2，其中DX1、DX2為產(chǎn)生X效應時兩藥單獨使用所需的各自濃度，D1和D2為產(chǎn)生X效應時兩藥合用所需的各自濃度。兩種藥物相互排斥時α=0，反之α=1。根據(jù)上述公式計算兩藥聯(lián)合使用時的CI值，CI<1.0，協(xié)同效應；CI=1.0，相加效應；CI>1.0，拮抗效應[4]。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)正常的PC9細胞取出，消化、離心、混勻后再計數(shù)。根據(jù)所用細胞體積，稀釋細胞濃度至合適的體積，將調(diào)整好的細胞懸液按照每孔1 mL(2×105/mL)接種于六孔板中，以十字交叉法混勻細胞，24 h后待細胞貼壁后，根據(jù)“1.4”項下的實驗分組進行單獨或聯(lián)合用藥處理，48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化制成單細胞懸液進行收集。細胞凋亡檢測步驟參照細胞凋亡試劑盒說明書，將Binding Buffer稀釋成1×重新混懸細胞，向每組細胞都加入AnnexinV-FITC和PI染色，混勻后，將其置于暗處進行避光15 min，最好保證于1 h內(nèi)完成上機檢測。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期

細胞前期處理過程同“1.6”項下細胞凋亡的處理。細胞周期步驟檢測參照說明書，將提前預冷的70%乙醇1 mL加入至前期處理好的各組細胞內(nèi)，置于4 ℃冰箱中固定過夜，PBS重新潤洗，碘化丙啶染色，室溫(25 ℃)條件下避光孵育30 min，1 h內(nèi)上機進行檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法

運用Graphpad Primer 8.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用t-test檢驗，限定P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藥物對PC9細胞增殖的影響

用CTG法檢測藥物對PC9細胞的抑制作用，結果見圖1—3。由圖可見，四君子湯濃度為0.398 75 mg/mL時，其對PC9細胞基本無抑制作用，呈濃度依賴性。吉非替尼濃度為0.000 892 μg/L時，其對PC9細胞基本無抑制作用，吉非替尼單獨使用對PC9細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(0.75±0.26)μg/L。因此，選擇固定四君子湯基本無毒濃度(0.398 75 mg/mL)與吉非替尼一系列濃度梯度進行聯(lián)合給藥，使用CTG法觀察對細胞的抑制作用，結果顯示，聯(lián)合給藥對PC9細胞的IC50為(0.10±0.02) μg/L，與吉非替尼組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述結果表明，四君子湯和吉非替尼單獨或聯(lián)合給藥對PC9細胞皆具有抑制作用，且呈濃度依賴性，與單獨給藥相比，四君子湯與吉非替尼聯(lián)合給藥對PC9細胞的抑制效果更明顯。

圖2 吉非替尼對PC9細胞的抑制作用Fig 2 Inhibitory effects of gefitinib on PC9 cells

2.2 利用中效原理評價兩藥聯(lián)合應用效應

根據(jù)CTG實驗所得的結果，基于中效原理繪制不同效應Fa下的CI關系曲線，見圖4。兩藥聯(lián)合作用于PC9細胞，Calcusyn分析結果顯示，四君子湯濃度為0.398 75 mg/mL時，聯(lián)合不同濃度吉非替尼均有協(xié)同作用，CI<1。

圖4 四君子湯和吉非替尼聯(lián)合給藥的CI作用圖Fig 4 Combined index effect of Sijunzi decoction combined with gefitinib

2.3 凋亡作用分析

根據(jù)CTG法和Calcusyn的結果，本研究最終選擇了基本對PC9細胞無抑制作用的四君子湯濃度(0.398 75 mg/mL)和吉非替尼濃度(0.000 892 μg/L)進行細胞凋亡和細胞周期測定。PC9細胞經(jīng)過選定的各組藥物作用48 h后，進行AnnexinV-FITC/PI染色，利用流式細胞儀分析細胞凋亡，結果見圖5，圖中Q1、Q2、Q3和Q4分別代表壞死細胞、晚期細胞、早期細胞和活細胞的凋亡比率。各組的凋亡率見表1，分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合給藥組早期凋亡率和總凋亡率與對照組、吉非替尼組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；聯(lián)合給藥組晚期凋亡率只與對照組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此可見，聯(lián)合用藥能夠通過促進細胞凋亡抑制細胞增殖，且能促進細胞的早期凋亡，從誘導細胞凋亡角度證實了協(xié)同效應的存在。

A.對照組；B.四君子湯組；C.吉非替尼組；D.聯(lián)合給藥組A.control group; B.Sijunzi decoction group; C.gefitinib group; D.combined group圖5 對照組、四君子湯組、吉非替尼組及聯(lián)合給藥組作用48 h后PC9細胞凋亡情況Fig 5 Apoptosis of PC9 cells in the control group, Sijunzi decoction group, gefitinib group and the combined group after 48 h of treatment

表1 對照組、四君子湯組、吉非替尼組及聯(lián)合給藥組作用48 h后PC9細胞凋亡率比較Tab 1 Apoptosis of PC9 cells in the control group, Sijunzi decoction group, gefitinib group and combined group after

2.4 細胞周期作用分析

采用與細胞凋亡相同的給藥方案，進行單藥或聯(lián)合用藥對PC9細胞作用48 h后利用流式細胞儀分析細胞周期，結果見圖6、表2。結果顯示，聯(lián)合給藥組處于G2/M期細胞的百分比與單獨給藥組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A.對照組；B.四君子湯組；C.吉非替尼組；D.聯(lián)合給藥組A.control group; B.Sijunzi decoction group; C.gefitinib group; D.combined group圖6 對照組、四君子湯組、吉非替尼組及聯(lián)合給藥組作用48 h后PC9細胞周期情況Fig 6 Cell cycle of PC9 cells in the control group, Sijunzi decoction group, gefitinib group and combined group after 48 h of treatment

表2 對照組、四君子湯組、吉非替尼組及聯(lián)合給藥組作用48 h后PC9細胞周期百分比比較Tab 2 Percentage of cell cycle of PC9 cells in the control group, Sijunzi decoction group, gefitinib group and combined group after 48 h of

3 討論

吉非替尼治療表皮生長因子受體(EGFR)突變的非小細胞肺癌患者的效果很好[5]；但野生型EGFR患者和Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)突變對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)不敏感，且絕大部分患者使用吉非替尼約1年會出現(xiàn)獲得性耐藥[6-7]。吉非替尼耐藥機制包括經(jīng)過/不經(jīng)過EGFR通路、激活下游信號通路相關靶標等，各機制間也會相互影響，更增加了改善吉非替尼耐藥的復雜性[8-12]。因此，如何解決絕大部分腫瘤患者使用一段時間吉非替尼后就會出現(xiàn)耐藥性的問題，成為目前腫瘤用藥的一大難題。近年來，中醫(yī)藥在降低肺癌放化療的不良反應、調(diào)整機體免疫功能和穩(wěn)定瘤灶等方面發(fā)揮了獨到的優(yōu)勢及療效，并能改善患者生活質量[13]。中藥多復方用藥，且中藥單藥本身就含有多個成分，因此具有作用多個靶點的優(yōu)勢。中藥與EGFR-TKI聯(lián)合治療，不僅可減輕EGFR-TKI的不良反應，還可以產(chǎn)生協(xié)同作用以提高療效，經(jīng)過長期臨床實踐，中藥用于逆轉目前所知的EGFR-TKI耐藥的效果逐漸得到肯定[14]。

為明確四君子湯與吉非替尼是否具有協(xié)同增效作用，本研究使用CTG法測定了四君子湯和吉非替尼單獨或聯(lián)合應用對PC9細胞的抑制效果。結果顯示，兩藥單獨或聯(lián)合應用均能抑制PC9細胞增殖，且具有濃度依賴性。根據(jù)CTG結果，固定了四君子湯濃度(0.398 75 mg/mL)與一系列濃度梯度吉非替尼聯(lián)合給藥，利用中效原理研究兩藥的相互作用，經(jīng)Calcusyn軟件分析，該濃度的四君子湯與不同濃度吉非替尼均有協(xié)同作用。最后選擇對PC9基本無抑制作用的四君子湯濃度和吉非替尼濃度進行細胞凋亡和細胞周期實驗，結果顯示，聯(lián)合給藥組早期凋亡率和總凋亡率均較對照組、吉非替尼組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且絕大多數(shù)細胞屬于早期凋亡；兩藥聯(lián)合應用可將絕大部分細胞的細胞周期阻滯在G2/M期，但仍需進一步研究以確定具體機制。四君子湯對胃癌、肝癌和結直腸癌均有治療效果[15-16]。四君子湯能夠誘導肝癌細胞凋亡，并調(diào)控細胞周期以及抑制血管內(nèi)皮生長因子表達[17]；其能夠逆轉胃癌細胞的上皮間質轉化，進而抑制胃癌的侵襲和遷移[15]。本課題組前期研究[18]結果表明，四君子湯與吉非替尼在Lewis細胞構建小鼠肺癌轉移模型上給藥，在抑制腫瘤生長方面具有協(xié)同作用，并能改善惡性腫瘤細胞向肺部轉移，且兩藥聯(lián)合應用效果更強。

目前的研究結果表明，四君子湯與吉非替尼聯(lián)合應用可對非小細胞肺癌細胞發(fā)揮協(xié)同抑制作用，并有望成為一種新的肺癌治療策略。重要的是，吉非替尼和四君子湯常用于臨床，且有較好的治療效果。通過本研究，希望為臨床醫(yī)師提供一種新的用藥策略，從而提高患者對吉非替尼的敏感性，降低吉非替尼耐藥性，延長患者生存期。