林世鋒 王仁剛 潘飛 王自力 元野 李尊強 任學良 龍明錦 張吉順 曾吉凡 史躍偉

摘 ?要：為提高抗PVY煙草品種的分子育種效率，本研究針對抗病種質(zhì)資源半坤村曬煙中隱性抗病基因eIF4E1的SNP位點G149C建立一種簡單快速的雙向等位基因特異性PCR（Bi-directional PCR amplification of specific alleles，Bi-PASA）檢測方法，并對該檢測方法的特異性、準確度及實際應用效果進行驗證。結(jié)果表明，建立的Bi-PASA檢測方法能夠在一個PCR反應中有效區(qū)分eIF4E1基因G149C位點3種基因型：野生型GG、雜合突變型GC、純合突變型CC。利用Bi-PASA檢測方法可以對K326×半坤村曬煙F2分離群體的基因型進行有效鑒別，且鑒定結(jié)果與普通的等位基因特異性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）以及直接測序法的鑒定結(jié)果一致。綜上所述，本研究建立的Bi-PASA檢測方法特異性強、準確度高、操作簡便，可更好地應用于eIF4E1基因的分子標記輔助育種。

關鍵詞：煙草;eIF4E1基因;雙向等位基因特異性PCR;SNP分型

Abstract： In order to improve the efficiency of molecular marker assisted breeding for PVY-resistant tobacco varieties， we dedicated to establish a simple and rapid bi-directional PCR amplification of specific alleles （Bi-PASA） method for detecting the single nucleotide polymorphism （SNP） G149C of the recessive PVY resistance gene eIF4E1 of the resistant germplasm Bankuncunshaiyan， and to verify the specificity， accuracy and practicality of the established detection method. It turned out that the established Bi-PASA detection method can effectively distinguish the three different genotypes for the G149C SNP of the eIF4E1 gene in a single PCR reaction： wildtype （GG）， heterozygous mutant （GC） and homozygous mutant （CC）. The genotypes of eIF4E1 in the F2 population derived from K326/Bankuncunshaiyan were successfully identified by the Bi-PASA method. In addition， the genotypes of the F2 population identified by the established Bi-PASA method were all the same with that identified by the conventional allele-specific PCR （AS-PCR） and direct sequencing， which suggested that the established Bi-PASA method is characterized by strong specificity， high accuracy and simple operation. Therefore， it can be better applied in the eIF4E1 gene marker assisted breeding.

Keywords： tobacco; eIF4E1; bi-directional PCR amplification of specific alleles; SNP genotyping

由馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）引起的煙草馬鈴薯Y病毒病是煙草生產(chǎn)中的嚴重病害之一[1]?？剐曰虻耐诰蚝屠檬强筆VY育種的基礎[2-3]。研究顯示，在栽培煙草中，真核翻譯起始因子4E1（eukaryotic translation initiation factor 4E1，elF4E1）基因為煙草PVY隱性抗病基因，即感PVY基因，該基因的缺失或突變使煙草獲得PVY抗性[4]。2020年，本課題組[5]對抗PVY煙草品種半坤村曬煙中的PVY抗性基因進行等位性檢測，結(jié)果顯示半坤村曬煙的PVY抗性同樣由eIF4E1基因控制。進一步序列分析表明，相較于感病品種，半坤村曬煙的eIF4E1基因編碼區(qū)存在一個單核甘酸多態(tài)性（SNP）位點，即第149位堿基由G突變?yōu)镃，屬于錯義突變，編碼的氨基酸由色氨酸突變?yōu)榻z氨酸，進而造成半坤村曬煙對PVY產(chǎn)生抗病性，該單堿基突變?yōu)檫M行eIF4E1等位基因分型提供了依據(jù)。

SNP基因分型是進行SNP分子標記輔助選擇育種的首要條件[6]。目前，SNP基因分型的方法有基于PCR技術的傳統(tǒng)分型方法和基于大型儀器的高通量檢測方法[7]?；赑CR技術的傳統(tǒng)分型方法，如限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）、單核苷酸引物延伸法（single nucleotide primer extension，SNuPE）和等位基因特異性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）[7-8]。PCR-RFLP由于受限制性內(nèi)切酶識別位點的影響，其應用具有很大的局限性;PCR-SSCP和SNuPE技術操作繁瑣且重復性差?；诖笮蛢x器的高通量檢測方法，如高分辨率熔解曲線分析（high resolution melt，HRM）、變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）和基因芯片等技術[9-10]，檢測效率高，但儀器設備昂貴、成本高、較難普及。相比之下，利用AS-PCR技術對SNP進行分型快速、簡便、成本低[8]。2020年，本課題組[11]針對半坤村曬煙eIF4E1基因SNP G149C位點建立起AS-PCR分子標記檢測體系，利用該標記對K326×半坤村曬煙F2代抗感分離群體進行的基因分型結(jié)果與抗病表型鑒定結(jié)果完全一致，進一步說明半坤村曬煙的PVY抗性是由eIF4E1基因所控制，同樣利用該標記可以對PVY抗性供體親本回交轉(zhuǎn)育后代的基因型進行準確選擇，但每個單株基因型的檢測需要進行2個單一PCR擴增，操作步驟較為復雜。

雙向等位基因特異性PCR（bi-directional PCR amplification of specific alleles， Bi-PASA）是在等位基因特異性PCR的基礎上發(fā)展出來的一種更為簡捷的SNP分型方法，其依據(jù)的基本原理是：針對1個SNP位點設計2條延伸方向相反的內(nèi)側(cè)引物和2條外側(cè)引物，用這4條引物在同一PCR反應中進行擴增，即通過1次PCR反應即可檢測出已知突變位點的類型[12-13]。最近幾年，雙向等位基因特異性PCR技術在生命科學領域尤其是動植物遺傳育種領域的應用已經(jīng)越來越多地受到研究者的重視[14]，其中在與植物抗病性狀相關SNP研究中，研究者分別建立了辣椒[15]、水稻[16]、苦瓜[17]等抗病基因的雙向等位基因特異性PCR檢測方法。但雙向等位基因特異性PCR要求在同一反應體系中同時對不同的基因類型進行特異性擴增，因而影響其擴增效果的因素較多，對退火溫度差、引物配比、反應溫度等參數(shù)均具有較高的要求[18]。

本文在半坤村曬煙eIF4E1基因序列分析檢測到SNP G149C位點的基礎上，研究利用雙向等位基因特異性PCR技術進行eIF4E1基因SNP分型，為煙草抗PVY育種SNP標記的研究和應用提供一種更加省時、省力、經(jīng)濟有效的方法。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

本研究供試煙草材料均由貴州省煙草科學研究院新品種選育三組提供。以感PVY煙草品種K326、紅花大金元、云煙87作母本和抗PVY煙草品種半坤村曬煙作父本進行雜交獲得各自F1代雜交種材料，其中K326×半坤村曬煙組合F1代再通過自交產(chǎn)生F2及回交世代，經(jīng)汁液摩擦接種法[19]進行抗性鑒定后，用于標記分析。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?煙草基因組DNA的提取 ?采用AxyPrep基因組DNA小量制備試劑盒（Axygen）提取煙草基因組DNA，并通過紫外分光光度法（Nanodrop）和瓊脂糖凝膠電泳法初步檢測基因組DNA的提取質(zhì)量。

1.2.2 ?雙向等位基因特異引物設計 ?針對課題組先前在半坤村曬煙eIF4E1基因上發(fā)現(xiàn)的SNP位點，設計適合雙向等位基因特異性PCR擴增的4條引物（圖1，表1）。設計方法如下：在SNP位點設計特異引物，包括外引物2條，內(nèi)引物2條。先在SNP突變位點上下游200～500 bp處分別設計正、反向外引物（Outer primer），然后在所檢測的變異位點處設計2個包含變異堿基的正、反向內(nèi)引物（Inter primer），即2個內(nèi)引物的3′末端堿基分別與SNP位點的1個堿基相同（或互補），同時還在內(nèi)引物的3′末端倒數(shù)第2位（-2位）或第3位（-3位）人為引入了1個錯配堿基（表1引物序列中小寫字母是特別設計的錯配堿基）以提高擴增反應的特異性。將4個引物鏈組成的3對引物在1個PCR反應中進行擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)2條帶的是純合型（GG或CC），出現(xiàn)3條帶的是雜合型（GC），如圖1所示。

1.2.3 ?雙向等位基因特異性PCR擴增及產(chǎn)物檢測 ?雙向等位基因特異性PCR反應體系為20 μL，包括Primix Taq酶（TaKaRa公司）10 μL，正、反向內(nèi)、外引物（10 μmol/L）各0.4 μL，模板DNA 1 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（30個循環(huán)），最后72 ℃延伸10 min。取5 μL擴增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠（含GelRed核酸染料）上電泳，自動凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照測序。

1.2.4 ?F2單株的基因型鑒定及測序驗證 ?分別使用Bi-PASA及普通的AS-PCR方法[5]（引物序列見表1）對F2分離群體22個單株進行鑒定分型;同時，以22個單株的DNA為模板，使用Bi-PASA外側(cè)引物P和Q進行PCR擴增（退火溫度55 ℃），然后將擴增產(chǎn)物送至上海生工測序，驗證Bi-PASA分型結(jié)果的準確性。

1.2.5 ?Bi-PASA分子標記在煙草種質(zhì)資源中的有效性檢測 ?選取24個已知抗性的煙草品種（表2）制備基因組DNA（方法同1.2.1）;采用構(gòu)建的Bi-PASA分子標記體系進行PCR擴增（方法同1.2.3）;取5 μL擴增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠（含GelRed核酸染料）上電泳，自動凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照分析。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?煙草eIF4E1基因Bi-PASA遺傳標記的建立

引物設計是Bi-PASA分子標記成功的關鍵，根據(jù)Bi-PASA引物設計的基本原則，對煙草eIF4E1基因的SNP突變位點進行引物設計，共設計出45組Bi-PASA引物，經(jīng)PCR驗證篩選出1組引物擴增效果最好，特異性條帶最清晰、明亮，擴增產(chǎn)物含量最高（資料未列出）。從圖2a可以看出，P/B引物對在突變純合型個體（半坤村曬煙）和突變雜合型個體（K326×半坤村曬煙、紅花大金元×半坤村曬煙、云煙87×半坤村曬煙）中擴增出1條441 bp的電泳條帶，在野生純合型個體（K326、紅花大金元、云煙87）中沒有擴增出電泳條帶。從圖2b可以看出，A/Q引物對在突變純合型個體中沒有擴增出電泳條帶，在突變雜合型個體和野生純合型個體中擴增出1條337 bp的電泳條帶。圖2c為加入A/Q/P/B引物組合的Bi-PASA遺傳標記檢測結(jié)果，在突變純合型個體中擴增出441 bp和726 bp兩條電泳條帶，顯示標記個體基因型為CC型;在突變雜合型個體中擴增出337、441和726 bp 三條電泳條帶，顯示標記個體基因型為GC型;在野生純合型個體中擴增出1條337 bp的電泳條帶，顯示標記個體基因型為GG型，由于外引物組合擴增效率低（擴增不平衡）使外引物擴增產(chǎn)物電泳條帶（726 bp）未顯示，但并不影響SNP分型檢測結(jié)果。

上述結(jié)果表明，單引物A/Q和P/B具有很好的特異性和穩(wěn)定性，雙重引物A/Q/P/B擴增結(jié)果是單引物擴增結(jié)果的疊加，且能通過1次PCR反應和1次凝膠電泳，便能區(qū)分供試材料的3種基因型，因此成功建立了檢測煙草eIF4E1基因SNP位點基因型的Bi-PASA檢測方法。

2.2 ?F2群體的AS-PCR分型結(jié)果

分別使用一對等位基因特異性（allele-specific，AS）的正向引物（FW和Fm）與共用反向引物（RWm）對F2分離群體的22個隨機單株進行PCR擴增，通過電泳分析對應的PCR產(chǎn)物來判斷eIF4E1基因型。結(jié)果如圖3所示，4、6、10、14、21具有單一的ASM-m標記特異條帶，是突變純合型（CC）植株;3、7、11、16、17、18具有單一的ASM-W標記特異條帶，是野生純合型（GG）植株;其余單株同時具有ASM-m和ASM-W標記特異條帶，是突變雜合型（GC）植株。

2.3 ?F2群體的Bi-PASA分型結(jié)果

利用Bi-PASA方法對F2分離群體的22個隨機單株進行分型，結(jié)果如圖4所示，1、2、5、8、9、12、13、15、19、20和22號單株擴增出337 bp、441 bp和726 bp三條電泳條帶，為突變雜合型單株（GC）;4、6、10、14和21號單株擴增出441 bp和726 bp兩條電泳條帶，為突變純合型單株（CC）;3、7、11、16、17和18號單株擴增出1條337 bp的電泳條帶，為野生純合型單株（GG）。所有單株的等位基因特征條帶明亮、清晰，分型結(jié)果與AS-PCR法的結(jié)果一致，說明所建立的Bi-PASA方法完

全可以取代AS-PCR法，用于eIF4E1基因G149C多態(tài)性位點的分型檢測。

2.4 ?測序結(jié)果

為了驗證Bi-PASA分子標記檢測到的F2代煙株基因型的正確性，對22個Bi-PASA分型單株進行測序，利用Chromas 2.3查看測序結(jié)果。測序結(jié)果表明（圖5），Bi-PASA分型結(jié)果與測序結(jié)果的一致性達到100%，說明Bi-PASA方法準確、可靠。

2.5 ?Bi-PASA分子標記在煙草種質(zhì)資源中的有效性檢測

利用Bi-PASA分子標記引物組合對24個煙草品種進行PCR擴增（圖6），在17個PVY感病品種中擴增出337 bp特異條帶，而在半坤村曬煙中擴增出441 bp特異條帶，與預期結(jié)果一致。除半坤村曬煙外，在其他PVY抗病品種中均未顯示出任何電泳條帶，這是因為在這些PVY抗病品種中eIF4E1基因發(fā)生了完全缺失，在此情況下，本研究所構(gòu)建的Bi-PASA分子標記作為顯性分子標記將這些抗病品種與半坤村曬煙及其他感病品種區(qū)分開來。

2.6 ?分子標記在煙草PVY抗性回交改良中的應用

為了使煙草PVY抗性回交改良子代鑒定工作簡單高效可重復，并盡可能區(qū)分純合、雜合基因型，采用Bi-PASA遺傳標記引物組合對K326×半坤村曬煙雜交后代回交群體進行PCR擴增，并進行水平電泳，照相記錄結(jié)果。然后按照如下標準判斷煙草回交后代單株是否攜帶突變型PVY隱性抗病基因：電泳結(jié)果出現(xiàn)441 bp特異條帶，初步判斷該單株攜帶突變型PVY隱性抗病基因。如圖7所示，回交后代單株有2種基因型：1、4、5、7、8、11、14、16、17、19、21、22單株為雜合突變型（GC），電泳結(jié)果出現(xiàn)337 bp和441 bp特異條帶;其余單株為純合野生型（GG），電泳結(jié)果只出現(xiàn)337 bp特異條帶而沒有出現(xiàn)441 bp特異條帶。篩選出的雜合突變型單株可與受體親本繼續(xù)回交或供下一步育種利用，表明所構(gòu)建的Bi-PASA分子標記可用于煙草PVY抗性回交改良。

3 ?討 ?論

采用Bi-PASA技術進行SNP分型，僅需一次PCR擴增和一次瓊脂糖電泳即可達到目的，是一種快速經(jīng)濟的SNP檢測方法。本研究基于品種資源半坤村曬煙中隱性抗病基因eIF4E1序列上的SNP位點成功設計并開發(fā)了1個Bi-PASA標記，用于eIF4E1抗病等位基因的分子標記輔助選擇，以期為煙草抗PVY分子標記輔助育種提供更加有力的技術支持。

目前煙草PVY抗病育種利用的抗源多數(shù)衍生自VAM，利用VAM及其衍生種育成的抗病品種往往圍繞eIF4E1基因發(fā)生大片段缺失，帶來的基因組變異尺度遠遠大于SNP或小片段缺失[20]。上述原因不僅造成上百個功能基因的缺失，而且由于無法獲得缺失連接片段信息造成eIF4E1突變位點共顯性分子標記無法開發(fā)，不利于隱性突變基因的連續(xù)回交定向轉(zhuǎn)育。半坤村曬煙的PVY抗性是由eIF4E1基因發(fā)生SNP突變產(chǎn)生的，本研究針對該SNP位點建立了Bi-PASA分子標記作為共顯性分子標記，能夠快速區(qū)分純合子和雜合子SNP分型，因此利用該標記在煙草PVY抗性分子標記輔助選擇育種中能夠縮短選擇時間，對隱性突變基因可以進行不間斷的回交轉(zhuǎn)移，從而提高基因回交轉(zhuǎn)移速度，加快育種進程。與其他分子檢測方法相比，Bi-PASA還具有許多優(yōu)點。Bi-PASA作為以普通PCR為基礎的簡單方法，實施過程中僅需一臺PCR擴增儀、一套電泳設備和一些其他常用的PCR操作工具。與PCR-RFLP和傳統(tǒng)的AS-PCR不同，Bi-PASA只需一次PCR擴增和一次瓊脂糖電泳即可達到分型的目的[12-13]。此外，盡管目前出現(xiàn)的基于大型儀器的高通量檢測方法比Bi-PASA效率高，如基因芯片技術、DHPLC、TaqMan MGB和高分辨溶解曲線分析法，但由于這些方法成本較高，無法常規(guī)使用[9-10]。

Bi-PASA引物設計是決定該技術檢測靈敏度和準確性的關鍵。YE等[13]研究認為，在內(nèi)引物的3′末端第2位引入錯配堿基，并且通過選擇錯配堿基類型，可以提高擴增反應的特異性。衛(wèi)波等[21]分別在第2位和第3位引入錯配堿基，發(fā)現(xiàn)對于不同的SNP突變類型，加入錯配堿基的位置和類型不同擴增效果不同。本研究在Bi-PASA引物設計時，在各個內(nèi)引物3′末端的第2位或第3位分別引入不同類型錯配堿基，然后通過PCR引物組合篩選獲得1組引物擴增效果較好。結(jié)合已有研究報道和前期積累發(fā)現(xiàn)，在Bi-PASA內(nèi)引物3′末端引入錯配堿是增加SNP基因分型準確性的必要措施。

內(nèi)外引物的濃度比是反應體系優(yōu)化的重要內(nèi)容，不同研究中優(yōu)化結(jié)果差別比較大。王齊旭等[17]在苦瓜抗白粉病分子標記開發(fā)中優(yōu)化內(nèi)外引物濃度比為10∶1;鄭煒佳等[22]在棉花SNP分型的研究中優(yōu)化內(nèi)外引物濃度比為4∶1;KOU等[23]在甘薯的研究中優(yōu)化內(nèi)外引物濃度比為2∶1;郝志明等[24]在小麥研究中，內(nèi)外引物濃度比為3∶2;田孟祥等[25]、姚姝等[26]和陳國鑫等[27]在水稻的研究中均將內(nèi)外引物的濃度比確定為1∶1，這與本試驗的設置的內(nèi)外引物濃度比一致。對于本試驗煙草SNP的檢測，在Bi-PASA反應體系中4條引物濃度比設置為1∶1∶1∶1便獲得了滿意的特異性條帶，這可能還與引物的位置、Tm值和擴增片段大小等有關。

退火溫度也是影響PCR特異性的重要因素，溫度過高擴增不出特異性條帶，過低則雜帶多。本研究前期從大量引物組合中篩選出1組引物組合進行更加深入的PCR反應條件優(yōu)化，通過不斷提高退火溫度，可以有效降低非特異性條帶的擴增，當退火溫度達到58 ℃時，等位基因特征條帶清晰、明亮，擴增產(chǎn)物含量最高，盡管外側(cè)引物擴增產(chǎn)物電泳條帶減弱或消失（圖2、4、5、6、7），但并不影響SNP分型檢測結(jié)果。

4 ?結(jié) ?論

本研究針對煙草PVY隱性抗病基因eIF4E1已知的G149C SNP位點建立了一種雙向等位基因特異性PCR分型方法，同時與傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR方法進行了比較分析。研究結(jié)果表明，引物的合理設計和擴增條件的優(yōu)化是成功建立雙向等位基因特異性PCR檢測方法的關鍵。相較于傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR方法，本研究建立的雙向等位基因特異性PCR方法能夠在1個PCR反應中檢測出eIF4E1基因SNP位點的3種基因型（GG、GC、CC），操作簡便，省時省力，可以更好地促進煙草抗PVY種質(zhì)資源的利用和新品種選育。

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