王俊井，邵銀初，諶少波，李 浩

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊908醫(yī)院骨科，南昌 330002)

隨著年齡的逐漸增長，特別是婦女絕經(jīng)后雌激素的減少，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化的成骨細(xì)胞逐漸減少，破骨細(xì)胞生成增多，從而引起骨質(zhì)疏松癥，容易導(dǎo)致老年人病理性骨折，因此促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，對于骨質(zhì)疏松癥的防治具有重要意義[1]。香青蘭是蘭科青蘭屬植物，廣泛分布于我國西南地區(qū)，可入藥，具有清熱解毒、利咽止咳、涼肝止血之功效，主要用于呼吸道感染性疾病的治療，臨床上也用來治療原發(fā)性高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等心血管疾病[2]。近年來，隨著中醫(yī)的快速發(fā)展，對香青蘭的研究愈加深入，從中分離出的黃酮類化合物受到重點(diǎn)關(guān)注，因其廣泛的生物學(xué)功能，成為各研究學(xué)者的研究熱點(diǎn)[3]。香青蘭總黃酮具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)的功效，對該類疾病效果顯著，其內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能使其對骨髓微環(huán)境的改變成為可能[4]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)包括ERK1和ERK2，其能夠?qū)⑿盘枏募?xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核受體[5]。作為分裂原的活化抑制劑，MEK1、MEK2可通過調(diào)節(jié)Tyr和Thr雙位點(diǎn)的磷酸化來激活ERK的表達(dá)[6]。MEK/ERK信號通路還參與多種細(xì)胞功能的調(diào)控，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。本研究探討香青蘭總黃酮是否能夠通過調(diào)節(jié)MEK/ERK信號通路蛋白的表達(dá)來促進(jìn)BMSCs細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，為其作用機(jī)制提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Thermo ScientificTMMultiskanTMGO型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；BX53顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；胎牛血清(美國Sigma公司，批號：502198)；地塞米松(美國Sigma公司，批號：514984)；香青蘭總黃酮(南京建成生物工程研究所，純度：99.99%，批號：1248548)；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8 kit，南京宏哲生物有限公司，批號：201364)、堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒、ALP比活性試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司，批號：20184512、20184577)；MEK1、ERK1蛋白抗體(美國abcam公司，批號：201548、201574)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物

SPF級4周齡SD大鼠，雌性，體重60～90 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2018-0003，動物使用許可證號：SYXK(渝)2018-0027，動物質(zhì)量合格證號：10124584。本研究已獲得中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊908醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查和批準(zhǔn)，符合動物倫理學(xué)實驗標(biāo)準(zhǔn)要求。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

頸椎脫臼處死大鼠，70%酒精浸泡大鼠10 min，于超凈工作臺上無菌條件下取出雙側(cè)股骨和脛骨，骨剪剪去骨干骺端，采用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(含100 U·mL-1青霉素+100 μg·mL-1鏈霉素的雙抗)反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液收集到50 mL 離心管中，制成細(xì)胞懸液，在1000 r·min-1條件下離心10 min，棄上清，加入DMEM完全培養(yǎng)基，吹打混勻，以5×106個·cm-2的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中孵育48 h。待細(xì)胞鋪滿瓶底后給予傳代培養(yǎng)，取P3代細(xì)胞進(jìn)行實驗。將培養(yǎng)后的細(xì)胞分為空白對照組(完全培養(yǎng)基)、陽性對照組(50 μg·mL-1抗壞血酸+10 mmol·L-1β甘油磷酸鈉+10-8mol·L-1地塞米松)[8]、香青蘭總黃酮高濃度組(100 μg·mL-1)、香青蘭總黃酮中濃度組(50 μg·mL-1)、香青蘭總黃酮低濃度組(25 μg·mL-1)[9]。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

用CCK-8法檢測BMSCs細(xì)胞的活力：胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的BMSCs細(xì)胞2 min，充分吹打，制作成單細(xì)胞懸液，3000 r·min-1離心10 min后棄上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，輕微吹打，重懸細(xì)胞，以每孔100 μL接種到96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后更換新的培養(yǎng)基，按實驗分組，加入不同濃度的香青蘭總黃酮和陽性對照物，各組6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液后每孔加入10 μL CCK-8溶液，持續(xù)培養(yǎng)3 h，使用Bio-Rad微孔板閱讀器讀取450 nm處的吸光度，重復(fù)3次，通過吸光度計算各實驗組細(xì)胞存活率。

1.2.4 ALP比活性檢測

細(xì)胞處理及給藥同1.2.2，于6孔板上給藥培養(yǎng)7 d后，收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，每管加入400 μL 的10 mmol·L-1Tris-HCL(含0.1%Triton X-100)，吹打混勻，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，4 ℃下10 000 r·min-1離心10 min，取上清液于新的1.5 mL離心管中，根據(jù)ALP檢測試劑盒說明檢測細(xì)胞ALP活性，再根據(jù)蛋白測定試劑盒說明檢測蛋白含量，兩者比值即為ALP比活性。

1.2.5 ALP染色

細(xì)胞處理及給藥同1.2.2，6孔板上培養(yǎng)細(xì)胞7 d 后取出，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，將固定液加入孔板中，作用1 min，流水沖洗2 min，晾干。滴加孵育液，于37 ℃恒溫箱中孵育15 min，流水沖洗2 min，晾干，蘇木精染色5 min，流水沖洗2 min，晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察各孔細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 MEK1、ERK1蛋白表達(dá)水平的檢測

細(xì)胞處理及給藥同1.2.2，在無菌操作臺上取出24 h培養(yǎng)后細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，3000 r·min-1離心10 min后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP重懸，蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，收集于新的1.5 mL EP管中。經(jīng)SDS-PAGE分離后，蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，將膜放在5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h，然后用特異性抗體MEK1、ERK1和β-actin在4 ℃條件下孵育12 h，PBS溶液清洗3次，每次10 min，進(jìn)行二抗孵育2 h，然后在LAS 4000成像系統(tǒng)上顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 香青蘭總黃酮對BMSCs細(xì)胞存活率的影響

香青蘭總黃酮低、中、高濃度組和陽性對照組BMSCs細(xì)胞存活率顯著高于空白對照組，且呈濃度依賴性(均P<0.05)，高濃度組和陽性對照組作用相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 香青蘭總黃酮對BMSCs細(xì)胞存活率的影響

2.2 香青蘭總黃酮對BMSCs細(xì)胞ALP比活性的影響

香青蘭總黃酮低、中、高濃度組和陽性對照組BMSCs細(xì)胞ALP比活性顯著高于空白對照組，且呈濃度依賴性(均P<0.05)，高濃度組和陽性對照組作用相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 香青蘭總黃酮對BMSCs細(xì)胞ALP比活性的影響

2.3 各組BMSCs細(xì)胞ALP染色結(jié)果

隨著香青蘭總黃酮干預(yù)濃度的增加，BMSCs胞漿內(nèi)棕紅色逐漸加深，且咖啡色顆粒逐漸變大且增多，且香青蘭總黃酮高濃度組與陽性對照組染色結(jié)果相似。見圖1。

A：空白對照組；B：香青蘭總黃酮低濃度組；C：香青蘭總黃酮中濃度組；D：香青蘭總黃酮高濃度組；E：陽性對照組。

2.4 香青蘭總黃酮對BMSCs細(xì)胞MEK1、ERK1蛋白表達(dá)的影響

香青蘭總黃酮低、中、高濃度組和陽性對照組BMSCs細(xì)胞MEK1、ERK1蛋白表達(dá)量顯著高于空白對照組，且呈濃度依賴性(均P<0.05)，高濃度組和陽性對照組作用相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3，圖2。

表3 香青蘭總黃酮對BMSCs細(xì)胞MEK1、ERK1蛋白表達(dá)的影響

A：空白對照組；B：香青蘭總黃酮低濃度組；C：香青蘭總黃酮中濃度組；D：香青蘭總黃酮高濃度組；E：陽性對照組。

3 討論

BMSCs又稱骨髓源性多能間充質(zhì)干細(xì)胞，已被證實能向包括骨、軟骨、肌肉和脂肪在內(nèi)的所有間充質(zhì)組織分化[10]。由于其具有多潛能的分化特性，且細(xì)胞易于獲得和操作，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)成為組織工程應(yīng)用和再生研究領(lǐng)域的理想候選者[11]。當(dāng)上調(diào)與基質(zhì)發(fā)育和成熟相關(guān)的基因表達(dá)時，可導(dǎo)致BMSCs在增殖完成后發(fā)生成骨分化，在分化過程中，由于基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，BMSCs在細(xì)胞外基質(zhì)礦化開始之前，經(jīng)歷了形態(tài)和功能的改變[12]。目前香青蘭總黃酮是否具有成骨誘導(dǎo)作用尚不清楚，但是其可調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌功能、改善機(jī)體內(nèi)微環(huán)境的作用已被確定，這對BMSCs的分化可能具有促進(jìn)作用[13]。本研究結(jié)果顯示，在給予BMSCs不同濃度的香青蘭總黃酮干預(yù)后，均可導(dǎo)致BMSCs分化數(shù)量增加，且隨著香青蘭總黃酮干預(yù)濃度的增加，BMSCs分化數(shù)量呈顯著遞增趨勢，呈明顯濃度依賴性。活躍的成骨細(xì)胞可釋放出較多的ALP，因此ALP染色和ALP比活性可以反映出機(jī)體骨形成情況，本研究實驗組中ALP染色顆粒的明顯增加和ALP比活性的升高，均提示BMSCs向成骨分化。以上結(jié)果顯示香青蘭總黃酮可促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，其原因可能是香青蘭總黃酮改善機(jī)體骨髓微環(huán)境，使得BMSCs利于分化。

MEK信號通路是由ERK、c-junnh2末端激酶(JNK)和p38 3種蛋白激酶級聯(lián)而成的一種信號通路，它參與多種重要的細(xì)胞事件的進(jìn)程，尤其是細(xì)胞增殖、分化和凋亡[14-15]。ERK通常被有絲分裂原和生長因子激活，在細(xì)胞生長、防止凋亡和細(xì)胞分化等方面有著重要的調(diào)節(jié)作用[16]。有文獻(xiàn)[17]報道ERK和p38在在骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化過程被激活。本研究通過檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ALP比活性、MEK1和ERK1信號通路蛋白的表達(dá)，證明激活MEK/ERK信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖能力。然而，也有研究[18]表明，MEK/ERK信號通路抑制細(xì)胞成骨分化，因此，MEK/ERK信號通路在成骨細(xì)胞分化中的作用目前尚有爭議，使其成為本研究需要重點(diǎn)探討的內(nèi)容。本研究從細(xì)胞存活率、ALP比活性、MEK1及ERK1蛋白表達(dá)量等方面分析MEK/ERK信號通路在BMSCs成骨分化中的作用，闡明MEK/ERK信號通路在BMSCs成骨分化中的意義，結(jié)果顯示MEK/ERK信號通路的激活可能有助于BMSCs成骨分化。其機(jī)制可能是香青蘭總黃酮引起體內(nèi)骨髓微環(huán)境發(fā)生改變，從而導(dǎo)致MEK/ERK信號通路激活，MEK1、ERK1相關(guān)蛋白表達(dá)水平增加，促進(jìn)BMSCs成骨分化。且在本研究中，隨著香青蘭總黃酮干預(yù)濃度的增加，MEK1、ERK1蛋白表達(dá)水平呈顯著遞增趨勢，表明香青蘭總黃酮能夠有效地激活MEK/ERK信號通路，其蛋白表達(dá)效果與香青蘭總黃酮濃度密切相關(guān)，說明香青蘭總黃酮可能是一種有效的促成骨分化的藥物，而MEK/ERK信號通路就是其作用靶點(diǎn)之一。

綜上所述，本研究結(jié)果初步證明了香青蘭總黃酮可誘導(dǎo)BMSCs增殖及分化，其機(jī)制可能是香青蘭總黃酮通過激活MEK/ERK信號通路，上調(diào)MEK1、ERK1相關(guān)蛋白表達(dá)來實現(xiàn)的，MEK/ERK信號通路極可能是BMSCs增殖及分化的重要調(diào)控靶點(diǎn)。