孫玉琴，張睿，高磊，鄒淑花

(1.淄博市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，淄博 255029；2.青島市婦女兒童醫(yī)院生殖中心，青島 266000；3. 上海國(guó)際和平婦幼保健院生殖中心，上海 200030)

隨著全球不孕不育人群數(shù)量的增加，越來(lái)越多的人選擇輔助生殖技術(shù)(ART)進(jìn)行助孕治療。體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的妊娠結(jié)局受到多種因素的影響，子宮內(nèi)膜容受性是影響其成功率的主要因素之一[1]。雌激素有促進(jìn)子宮內(nèi)膜表面上皮、腺體、間質(zhì)、血管呈增殖性變化的作用[2]，是控制性促排卵(COH)中重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。在COH過(guò)程中，超生理水平的雌二醇(E2)會(huì)降低黃體生成素(LH)的生成，進(jìn)而影響黃體功能[3]。此外，取卵過(guò)程中對(duì)顆粒細(xì)胞的損傷也會(huì)減弱黃體功能及降低雌孕激素的生成，在ART周期的黃體期，血清雌孕激素均會(huì)降低至較低的水平[4]。目前關(guān)于人絨毛膜促性腺激素(HCG)日至黃體中期激素水平的變化對(duì)臨床結(jié)局的影響已有較多研究[5-8]，但是取卵(OPU)日至ET日E2濃度如何變化及是否對(duì)妊娠結(jié)局有預(yù)測(cè)價(jià)值目前尚無(wú)相關(guān)研究。本研究通過(guò)分析行IVF-ET助孕治療并連續(xù)監(jiān)測(cè)OPU日至ET日E2水平變化患者的妊娠結(jié)局，探討取卵術(shù)后E2濃度變化對(duì)妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值，以期為臨床診療決策提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2017年1月至2021年6月在淄博市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF-ET治療的不孕癥患者92例(92個(gè)周期)為研究對(duì)象，根據(jù)妊娠結(jié)局不同分為妊娠組(n=44)和非妊娠組(n=48)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<40歲；(2)COH方案為黃體期長(zhǎng)方案，且卵巢反應(yīng)正常；(3)行ET時(shí)，子宮內(nèi)膜厚度>8 mm，均為鮮胚移植周期；(4)自愿接受OPU日至ET日連續(xù)測(cè)定血清E2濃度者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)OPU日至ET日期間服用雌激素或相關(guān)藥物者；(2)存在子宮結(jié)構(gòu)性病變、子宮內(nèi)膜炎、宮腔積液者；(3)夫妻任何一方染色體檢查異常者。

二、研究方法

1.COH方案及ET、黃體支持：采用黃體期長(zhǎng)方案促排卵，在黃體中期每日注射0.1 mg促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，達(dá)菲林，F(xiàn)erringg GmbH公司，德國(guó))降調(diào)，14～21 d達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)(無(wú)功能性囊腫，內(nèi)膜厚度<4～5 mm，E2<183.5 pmol/L，LH<5 U/L)時(shí)，給予促性腺激素(Gn)促排卵，并根據(jù)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育情況及激素水平調(diào)整Gn用量。當(dāng)B超檢查提示3個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm或平均每個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡的E2濃度在734～1 101 pmol/L時(shí)停用Gn，當(dāng)晚肌肉注射HCG(珠海麗珠)8 000～10 000 U，HCG注射后36～38 h行取卵術(shù)。卵母細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)一步成熟后加入精液繼續(xù)培養(yǎng)。OPU后第3天對(duì)子宮內(nèi)膜厚度在8～11 mm之間的患者移植優(yōu)質(zhì)胚胎1～2枚。給予常規(guī)黃體支持：黃體酮軟膠囊(浙江愛生)0.2 g口服，1次/d，以及黃體酮注射液(浙江仙琚)40 mg肌肉注射，1次/d。黃體支持至移植后14 d，再根據(jù)妊娠情況決定是否繼續(xù)。

優(yōu)質(zhì)胚胎判斷標(biāo)準(zhǔn)：取卵后第1天正常受精(可觀察到原核)，第3天評(píng)級(jí)為Ⅰ、Ⅱ級(jí)，卵裂球數(shù)目7～8個(gè)且碎片率<20%的胚胎。

2.觀察指標(biāo)：收集患者的一般資料，包括年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(bAFC)、基礎(chǔ)生殖激素水平(bFSH、bLH、bP)等；自O(shè)PU日起連續(xù)4 d檢測(cè)血清E2濃度并分別記為d0E2、d1E2、d2E2和d3E2(ET日)；記錄患者獲卵數(shù)、正常受精率及胚胎發(fā)育情況。

妊娠結(jié)果判定：胚胎移植后28～30 d經(jīng)陰道B超檢查宮腔內(nèi)可見孕囊者為臨床妊娠。

OPU后不同時(shí)間點(diǎn)血E2濃度變化率的計(jì)算：d1-0E2%=(d1-d0)E2/d0E2×100%；d2-1E2%=(d2-d1)E2/d1E2×100%；d2-0E2%=(d2-d0)E2/d0E2×100%；d3-1E2%=(d3-d1)E2/d1E2×100%；d3-0E2%=(d3-d0)E2/d0E2×100%；d3-2E2%=(d3-d2)E2/d2E2×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、妊娠組與非妊娠組一般資料比較

92例患者中，妊娠組44例(47.83%)，非妊娠組48例(52.17%)。兩組患者的年齡、不孕年限、BMI、AFC、基礎(chǔ)生殖激素水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較[(-±s)，M(P25，P75)]

二、兩組患者E2動(dòng)態(tài)變化及促排卵情況比較

OPU日(d0)妊娠組血E2濃度為7 136.32 pmol/L，非妊娠組為7 169.34 pmol/L；OPU后第1天(d1)妊娠組血E2濃度及非妊娠組血E2濃度均較OPU日下降；OPU后第2天(d2)妊娠組血E2濃度顯著高于非妊娠組(P<0.05)，且兩組均呈上升趨勢(shì)直至ET日(d3)。ET日妊娠組的血E2水平較非妊娠組略高，差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。妊娠組的d2-1E2%顯著高于非妊娠組(P<0.05)。妊娠組的正常受精率亦顯著高于非妊娠組(P<0.05)。妊娠組的可用胚胎數(shù)較非妊娠組略多，但尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)。兩組間其余指標(biāo)如獲卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、優(yōu)胚率及d3-0E2%等比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者E2動(dòng)態(tài)變化及促排卵情況比較[M(P25，P75)，%]

三、d2E2、d2-1E2%及聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的價(jià)值

由前述可知，d2E2和d2-1E2%兩項(xiàng)指標(biāo)在妊娠組與非妊娠組兩組間存在顯著性差異，推斷其可能有預(yù)測(cè)IVF-ET周期妊娠結(jié)局的意義。d2-1E2%、d2E2及聯(lián)合檢測(cè)的AUC分別為0.63[95%CI(0.52，075)，P<0.05]、0.67[95%CI(0.55，0.78)，P<0.05]、0.72[95%CI(0.61，0.83)，P<0.05](表3、圖1)。根據(jù)最大Youden指數(shù)，計(jì)算出可預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的d2-1E2%臨界值為74.41%，d2E2為4 159.95 pmol/L，診斷敏感度分別為52.30%、65.90%，特異度分別為75.00%、64.60%，聯(lián)合檢測(cè)的敏感度為88.60%，特異度為56.20%。

表3 d2E2、d2-1E2%及聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的敏感度和特異度

圖1 d2E2、d2-1E2%及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線

討 論

不孕癥是全球范圍內(nèi)的普遍問(wèn)題，育齡人群的不孕率高達(dá)15%～20%，在中國(guó)有超過(guò)2 000萬(wàn)對(duì)夫婦存在生育問(wèn)題[6]。IVF-ET技術(shù)是不孕癥患者的主要治療手段，為便于早期診斷、干預(yù)及提高妊娠率，目前研究的重點(diǎn)是尋找有效預(yù)測(cè)IVF-ET妊娠結(jié)局的方法。在正常非妊娠婦女的月經(jīng)周期，排卵后卵泡壁的卵泡顆粒細(xì)胞和卵泡內(nèi)膜細(xì)胞向內(nèi)侵入，周圍由結(jié)締組織的卵泡外膜包圍，共同形成黃體，分泌雌孕激素，使子宮內(nèi)膜發(fā)生分泌期變化。在IVF-ET周期中需進(jìn)行COH，GnRH-a和GnRH拮抗劑(GnRH-ant)可抑制內(nèi)源性LH峰，異常升高的雌、孕激素也可以負(fù)反饋抑制LH分泌，低水平的LH促進(jìn)溶黃體的發(fā)生，造成黃體發(fā)育不良；另外由于取卵時(shí)卵母細(xì)胞及大量顆粒細(xì)胞被同時(shí)吸出(每個(gè)卵泡被吸出的顆粒細(xì)胞數(shù)可達(dá)1×105～2×106個(gè))，降低了雌孕激素的分泌[7]，導(dǎo)致E2濃度急劇改變，繼而影響內(nèi)膜容受性、胚胎著床及最終的妊娠結(jié)局。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，自HCG日至ET日連續(xù)6 d血清E2濃度呈曲線變化，即HCG日后1 d血清E2濃度上升至高峰，OPU后1 d血清E2濃度在妊娠組與非妊娠組均降至最低，當(dāng)0.44≤OPU日E2/HCG日E2≤0.68時(shí)有更多的獲卵數(shù)及正常受精數(shù)，當(dāng)0.41≤ET日E2/HCG日E2≤0.52時(shí)會(huì)有較高的正常受精率[5]。目前關(guān)于HCG日與ET日或取卵日血E2濃度變化比率與妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究較多，但是尚無(wú)OPU后至ET日血E2濃度變化對(duì)妊娠結(jié)局預(yù)測(cè)價(jià)值的研究。本研究結(jié)果顯示，在OPU后第1天(d1)兩組的血E2濃度均下降至最低，OPU后第2天(d2)起兩組E2濃度均開始上升，且妊娠組的d2-1E2%顯著高于非妊娠組(P<0.05)。d2-1E2%、d2E2及聯(lián)合檢測(cè)的AUC分別為0.63、0.67、0.72，d2-1E2%、d2E2的最佳臨界值分別為74.41%、4 159.95 pmol/L，聯(lián)合檢測(cè)的敏感度為88.60%，特異度為56.20%，提示d2-1E2%及d2E2變化可以預(yù)測(cè)鮮胚移植的妊娠結(jié)局。

目前關(guān)于HCG日E2濃度對(duì)鮮胚移植妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值觀點(diǎn)不一[8-9]。Kondapalli等[10]研究認(rèn)為，在HCG日后10～12 h血清E2濃度較HCG日下降>10%時(shí)臨床妊娠率和活產(chǎn)率降低40%～50%。2017年Bai等[11]的一項(xiàng)單中心回顧性隊(duì)列研究認(rèn)為，在卵巢高反應(yīng)人群中，OPU后第2天血清E2濃度下降>80%時(shí)，妊娠率從 51.33%降至36.72%，著床率從30.93%降至21.70%。另有研究認(rèn)為，ET日血清E2較HCG日下降≥30%時(shí)，胚胎種植率和臨床妊娠率的下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[12]。在黃體中期當(dāng)血清E2濃度>1 835 pmol/L時(shí)可預(yù)測(cè)較高的生化妊娠率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率[13]。提示HCG日至黃體中期不同的E2濃度可能預(yù)測(cè)不同的妊娠結(jié)局。

臨床妊娠率是研究IVF-ET臨床結(jié)局的主要指標(biāo)，但不是最佳指標(biāo)。在IVF-ET周期中，COH是首要環(huán)節(jié)，其目的是促進(jìn)多個(gè)卵泡成熟，增加妊娠機(jī)會(huì)，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致母體和卵母細(xì)胞處于高生理劑量的E2環(huán)境中，這種超生理劑量的激素環(huán)境對(duì)胎兒和胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育、表觀遺傳及近遠(yuǎn)期健康都可能產(chǎn)生影響。目前國(guó)內(nèi)外已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，不同的E2峰值對(duì)活產(chǎn)率及子代出生結(jié)局有影響[14-20]。受雌孕激素的協(xié)同作用，子宮內(nèi)膜僅在窗口期內(nèi)允許胚胎著床，因此在COH過(guò)程中E2峰值有一個(gè)合適的范圍。2019年Zhang等[14]對(duì)1 141例卵巢功能正常的非PCOS患者HCG日高E2濃度對(duì)累計(jì)活產(chǎn)率(cLBR)的影響開展研究，利用平滑曲線擬合的方法發(fā)現(xiàn)E2峰值對(duì)cLBR的影響存在閾值效應(yīng)，當(dāng)E2峰值<8 018.95 pmol/L時(shí)，E2每增加367 pmol/L，cLBR升高約12%，且該趨勢(shì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而當(dāng) E2峰值>22 519.12 pmol/L時(shí)，E2每增加367 pmol/L，cLBR降低約10%，這個(gè)趨勢(shì)雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但具有一定臨床意義，且未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因可能與高E2組樣本量較小有關(guān)。2021年楊櫻之等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HCG日不同E2濃度患者的死胎死產(chǎn)、胎兒畸形及新生兒低血糖、新生兒窒息、低體重兒發(fā)生率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。Li等[16]的研究認(rèn)為，在鮮胚移植周期中HCG日血清E2濃度>11 553.16 pmol/L與低體重兒出生相關(guān)，其AUC為0.72，敏感度71.4%，特異度68.3%。另有多項(xiàng)研究也得出了相似的結(jié)論[17-19]。HCG日E2濃度對(duì)子代的影響大于刺激方案的選擇和Gn應(yīng)用劑量的影響[20]。與自然周期中生理狀態(tài)下的內(nèi)膜環(huán)境相比，通過(guò)Gn促排卵的IVF-ET周期中，超生理劑量的E2環(huán)境可能引起子宮內(nèi)膜水腫進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞分化和胎盤形成[21]。另有動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，高E2水平抑制絨毛滋養(yǎng)層內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及子宮螺旋動(dòng)脈的生成[22]，這可能是子代不良出生結(jié)局的原因之一。實(shí)驗(yàn)室操作及不孕夫婦本身也是發(fā)生不良圍產(chǎn)結(jié)局的影響因素[23-24]。但2021年Wessel等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在不明原因不孕患者中通過(guò)IVF技術(shù)分娩單胎者(138 例)與自然受孕后分娩單胎者(125 例)相比，新生兒體重及圍產(chǎn)結(jié)局差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Liu等[26]對(duì)通過(guò)IVF-ET技術(shù)分娩3 659例單胎嬰兒的患者進(jìn)行了一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，HCG日血E2峰值的高低與新生兒出生體重不相關(guān)，且隨著血清E2濃度的升高并不增加低出生體重兒的風(fēng)險(xiǎn)，分析其可能的原因在于ET過(guò)程中優(yōu)先移植優(yōu)質(zhì)胚胎，優(yōu)質(zhì)胚胎可以耐受超生理劑量E2濃度下非理想狀態(tài)的子宮內(nèi)環(huán)境，因而不會(huì)對(duì)胎兒體重有直接影響。提示在鮮胚移植中優(yōu)先選擇優(yōu)質(zhì)胚胎可以降低子代不良出生結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究結(jié)果提示，E2濃度的變化可能影響妊娠結(jié)局，但在黃體期添加雌激素后能否提升臨床妊娠率目前仍存在爭(zhēng)議[2，4，27-29]。一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)10年的隨訪調(diào)查提到，有16.6%的學(xué)者認(rèn)為在黃體支持中應(yīng)常規(guī)添加雌激素，有38.1%的學(xué)者認(rèn)為不需添加，有45.3%的學(xué)者認(rèn)為可以在某些條件下添加[30]。Zhao等[29]研究認(rèn)為，當(dāng)HCG日血E2濃度<5 000 pmol/L時(shí)添加雌激素有利于提升活產(chǎn)率；毛麗華等[31]研究認(rèn)為，鮮胚移植后采用補(bǔ)充雌激素、添加小劑量HCG或單純使用孕激素三種黃體支持方案的臨床妊娠率、活產(chǎn)率無(wú)顯著性差異，但是補(bǔ)充雌激素組或添加小劑量HCG組較單純使用孕激素組能顯著提高著床率。關(guān)于黃體支持中添加雌激素后不良圍產(chǎn)結(jié)局的研究，早期有文獻(xiàn)報(bào)道孕早期高雌激素暴露與一些妊娠期并發(fā)癥有關(guān)[32]。2017年一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究認(rèn)為黃體期加用雌激素不是影響臨床妊娠的獨(dú)立因素，對(duì)于HCG日E25 000～10 000 pmol/L的患者添加雌激素是早產(chǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[OR=1.436，95%CI(1.028，2.008)]，前置胎盤、妊娠期高血壓的發(fā)病率更高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[33]。因此，黃體期個(gè)體化的添加雌激素可能會(huì)改善臨床結(jié)局。本研究后續(xù)將完善研究設(shè)計(jì)，增加OPU后第2天低雌激素組，探討適量添加雌激素后對(duì)臨床妊娠率及圍產(chǎn)結(jié)局的影響。

本研究亦存在不足之處，樣本量較小，可能存在一定的地域限制；且資料收集中尚未納入IVF-ET周期中OPU后E2水平變化對(duì)母兒圍產(chǎn)結(jié)局的影響，研究結(jié)論存在一定的局限性，后續(xù)需要進(jìn)行更大樣本、多中心的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來(lái)深入探討。

綜上所述，在IVF-ET周期中OPU后E2水平的變化與妊娠結(jié)局有關(guān)，當(dāng)d2-1E2%≥74.41%或d2E2≥4 159.95 pmol/L時(shí)有預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的價(jià)值，聯(lián)合檢測(cè)的敏感度優(yōu)于單一指標(biāo)。