馬 亮,孫一鳴,張語涵,王若瀾,孔令提,劉 哲(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥劑科,蚌埠 33004;蚌埠醫(yī)學院藥學院;通訊作者,E-mail:liuzhe@bbmc.edu.cn;共同通訊作者,E-mail:875368@qq.com)

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見的胃腸道惡性腫瘤,據(jù)國際癌癥研究機構編制的癌癥發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計,結直腸癌發(fā)病率在全球范圍內排名第五(10.0%)、致死率排名第五(9.4%)[1]。

信號轉導及轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3, STAT3)是信號轉導和轉錄激活子家族(signal transduction and activator of transcription,STATs)的成員之一,能夠參與細胞增殖、分化和凋亡,調節(jié)血管生成等生物活動,具有多種重要的生物功能[2]。STAT3在正常生理條件下短暫激活,能夠調節(jié)一系列細胞生物學過程[3]。然而,STAT3在腫瘤細胞中持續(xù)激活,影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4]。研究表明,STAT3參與腫瘤惡性轉化的重要途徑是作為轉錄因子,調節(jié)下游腫瘤相關基因表達[2]。此外,STAT3參與調控血管生成的關鍵步驟,STAT3高表達往往預示較差的預后以及較低的5年生存率[5]。因此,STAT3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。

結直腸癌的主要治療手段包括手術治療和放化療[6],目前公認的治療方案為FOLFIRI(伊立替康、亞葉酸鈣、5-氟尿嘧啶聯(lián)用)、mFOLFOX6(奧沙利鉑、四氫葉酸、5-氟尿嘧啶聯(lián)用)、CapeOX(奧沙利鉑、卡培他濱聯(lián)用),配合手術治療[7]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種合成的氟嘧啶類似物,5-FU及其衍生物是臨床上最常用的化療藥物。通過抑制結直腸癌細胞DNA合成和抑制胸苷酸合成酶活性發(fā)揮作用,5-FU可以改變結直腸癌細胞的主要細胞生物學功能(如凋亡、自噬、細胞周期等等)[8]。盡管5-FU能夠在癌癥早期治療中起到較好的效果,但是長期使用5-FU會導致腫瘤耐藥,且結直腸癌復發(fā)患者往往對5-FU敏感性不高[9]。耐藥在很大程度上限制了5-FU的化療效果,其治療患者生存中位數(shù)約為20個月[10]。研究表明STAT3與結直腸癌耐藥性有相關性,并且高表達STAT3可導致結直腸癌細胞對5-FU敏感性降低。LL1是新型STAT3小分子抑制劑,通過計算機輔助藥物設計,特異性靶向STAT3的SH2結構域。研究表明LL1具有很高的特異性和安全性[11],有望應用于結直腸癌的臨床治療。本研究通過5-FU與新型STAT3抑制劑LL1聯(lián)用,觀察其對于結直腸癌細胞生長的影響,以期對于LL1與5-FU聯(lián)用治療結直腸癌提供新的思路和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司;胎牛血清、Trizol購于南京邁克沃德生物公司;CCK-8試劑盒(碧云天C0038);Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于貝博公司(BB-4101);RIPA裂解液購于碧云天公司,STAT3、p-STAT3(tyr705)、Bcl-2、c-Myc、Survivin一抗購于武漢三鷹公司,二抗購于南京邁克沃德生物公司,LL1{4-((2-(piperazin-1-yl)phenyl)amino)-5H-naphtho[1,8-cd]isothiazol-5-one 1,1-dioxide},由中國藥科大學余文穎課題組提供;人結直腸癌細胞株HT-29由蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院鄭海倫課題組提供。

1.2 細胞培養(yǎng)

HT29細胞使用含10%胎牛血清,1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)并傳代。

1.3 PCR法檢測基因表達

使用不同濃度LL1(2,4 μmol/L)處理HT-29細胞24 h,使用Trizol從細胞中分離總mRNA,使用Hiscrip Q RT SuperMix進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)合成cDNA,在安裝有IQ5多色實時PCR檢測系統(tǒng)的實時定量PCR儀上使用SYBR GREEN進行定量RT-PCR(qRT-PCR)分析,比較組間細胞c-Myc、Survivin和Bcl-2 mRNA表達水平。

1.4 CCK-8法測定細胞存活

使用CCK-8法測定細胞存活率,按照其說明書進行使用。體外培養(yǎng)結直腸癌HT-29細胞,取對數(shù)生長期的HT-29細胞使用胰蛋白酶進行消化,以5×103cells/孔的密度接種于96孔板中,每組設5個平行復孔。24 h后,觀察細胞貼壁良好,密度適宜。對照組使用新鮮培養(yǎng)液,而實驗組使用含藥培養(yǎng)液處理,實驗組濃度設置如下:LL1(0,1,2,4,6,8 μmol/L),5-FU(0,0.1,1,10,100,1 000 μmol/L),5-FU(0,0.1,1,10,100,1 000 μmol/L)+LL1(2 μmol/L),然后將其放回37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育。24 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中孵育1 h,使用多功能酶標儀于450 nm波長處檢測其吸光度A值,記錄數(shù)據(jù),使用空白孔調零,以對照組為100%,計算各組細胞存活率(細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%)。

1.5 集落克隆實驗

體外培養(yǎng)結直腸癌HT-29細胞,取對數(shù)生長期的HT-29細胞使用胰蛋白酶進行消化,使用血細胞計數(shù)板法進行計數(shù),隨后稀釋成所需濃度的細胞懸液,以2×103cells/孔的密度接種于6孔板中,待其貼壁后對照組使用新鮮培養(yǎng)液,而實驗組使用含藥培養(yǎng)液處理,實驗組分別用0.8 μmol/L 5-FU或0.8 μmol/L 5-FU+0.1 μmol/L LL1處理,放置于培養(yǎng)箱中,15 d后使用顯微鏡觀察其集落形成情況。棄去培養(yǎng)液后,使用PBS沖洗一遍。隨后使用4%多聚甲醛進行固定0.5 h,棄去多聚甲醛,使用PBS沖洗一遍后,加入結晶紫染液染色0.5 h,棄去結晶紫,倒扣在紙上待其干后進行拍照,比較不同處理組集落形成能力差別。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

體外培養(yǎng)結直腸癌HT-29細胞,取對數(shù)生長期的HT-29細胞使用胰蛋白酶進行消化,使用血細胞計數(shù)板法進行計數(shù),隨后稀釋成所需濃度的細胞懸液,以2×105cells/孔的密度接種于6孔板中,待其貼壁后對照組使用新鮮培養(yǎng)液,而實驗組使用含藥培養(yǎng)液處理,實驗組分別用1 μmol/L 5-FU或1 μmol/L 5-FU+2 μmol/L LL1處理,放置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,PBS洗滌一遍后使用不含EDTA的胰酶進行消化,細胞懸液以1 000g,4 ℃離心5 min收集細胞,棄去上清,用冷PBS洗滌兩次,用400 μl 1×Binding Buffer懸浮細胞,濃度大約為1×106cells/ml。按照說明書在細胞懸液中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC,輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育15 min,加入5 μl PI后輕輕混勻于2～8 ℃避光條件下孵育5 min。在1 h內使用流式細胞儀檢測,記錄相關數(shù)據(jù),比較不同組凋亡率。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達

體外培養(yǎng)結直腸癌HT-29細胞,取對數(shù)生長期的HT-29細胞使用胰蛋白酶進行消化,使用血細胞計數(shù)板法進行計數(shù),隨后稀釋成所需濃度的細胞懸液,以2×105cells/孔的密度接種于6孔板中,待其貼壁后對照組使用新鮮培養(yǎng)液,而實驗組使用含藥培養(yǎng)液處理,實驗組分別用1 μmol/L 5-FU或1 μmol/L 5-FU+2 μmol/L LL1處理,放置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,使用胰酶消化收集HT-29細胞,提取細胞總蛋白,BCA(bicinchoninic acid)法校正不同組別蛋白濃度,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis PAGE)后半干法轉膜至PVDF膜;快速封閉液封閉30 min后4 ℃過夜孵育STAT3總蛋白,p-STAT3(tyr705)蛋白,Bcl-2,c-Myc,Survivn蛋白抗體,TBST洗膜15 min后加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗,孵育2 h。Bio-rad成像系統(tǒng)曝光。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結果

2.1 LL1影響STAT3下游基因mRNA表達水平

RT-PCR檢測結果表明,與0 μmol/L組相比,2,4 μmol/L LL1組結直腸癌HT-29細胞c-Myc,Survivin和Bcl-2 mRNA表達水平均顯著下降(P<0.05,見表1)。

表1 RT-PCR檢測LL1對c-Myc,Survivin和Bcl-2基因表達水平的影響

2.2 LL1增強5-FU對結直腸癌細胞存活的抑制作用

CCK-8結果顯示,LL1可抑制結直腸癌HT-29細胞增殖(見表2)。與相應濃度的5-FU組相比,5-FU+LL1聯(lián)用組結直腸癌HT-29細胞存活率明顯降低(P<0.05,見表3)。

表2 不同濃度LL1對HT-29細胞存活的影響

2.3 LL1增強5-FU對結直腸癌細胞集落克隆形成的抑制作用

細胞集落克隆實驗結果顯示,與空白對照組相比,低濃度聯(lián)用組和低濃度5-FU組集落數(shù)均顯著減

表3 不同濃度5-FU單用及與LL1聯(lián)用對HT-29細胞存活的影響

少(P<0.05),且低濃度聯(lián)用組集落數(shù)小于低濃度5-FU組(P<0.05,見圖1)。

與對照組相比,*P<0.05;與低濃度5-FU相比,#P<0.05圖1 5-FU對HT-29細胞集落克隆形成的影響Figure 1 Effect of 5-FU on colony formation of HT-29 cells

2.4 LL1增強5-FU對結直腸癌細胞誘導凋亡的作用

PI/Annexin Ⅴ雙染實驗顯示,與對照組相比,高濃度聯(lián)用組和高濃度5-FU組細胞凋亡率均顯著增加(P<0.05),且高濃度聯(lián)用組凋亡率大于高濃度5-FU組(P<0.05,見圖2)。

與對照組相比,*P<0.05;與高濃度5-FU組相比,#P<0.05圖2 LL1增強5-FU誘導HT-29細胞凋亡的能力Figure 2 LL1 enhances the induction of 5-FU to apoptosis of HT-29 cells

2.5 LL1與5-FU聯(lián)用抑制STAT3及下游蛋白表達水平

Western blot檢測結果表明,與高濃度5-FU組相比,高濃度聯(lián)用組p-STAT3及下游蛋白c-Myc,Survivin和Bcl-2表達水平均顯著下降(P<0.05,見圖3)。

與高濃度5-FU組相比,#P<0.05圖3 Western blot檢測LL1與5-FU聯(lián)用對STAT3及下游蛋白表達水平的影響Figure 3 The effect of LL1 combined with 5-FU on the expression of STAT3 and downstream proteins by Western blot

3 討論

近年來,世界范圍內結直腸癌發(fā)病率和致死率逐步攀升。數(shù)據(jù)調查顯示,在歐美國家,結直腸癌是第三常見的癌癥。而在亞洲國家,其發(fā)生率也在逐步上升。在中國,結直腸癌的發(fā)病率近十年幾乎翻了一倍,其發(fā)病越來越趨向于低齡化、年輕化[12],約50%的結直腸癌患者在數(shù)年內死亡[13,14]。

結直腸癌常用的治療方法有手術治療、放療、化療等。其中,手術治療對于早期患者有著較好的療效,可以顯著改善患者的生存質量[15]。然而,隨著病程的進展,結直腸癌的治療難度急劇上升,單一的手術治療已難以達到令人滿意的效果。此時,需要根據(jù)患者實際情況采用化療、放療聯(lián)合手術治療的綜合治療方法。5-FU作為最常見的結直腸癌化療藥物之一,擁有良好的治療效果。其作用機制包括干擾RNA的合成和功能,抑制胸苷酸合酶等。隨著化療的深入,耐藥性的產(chǎn)生不可避免。5-FU的耐藥機制較為復雜,耐藥性會限制化療效果,最終導致治療失敗[16]。

STAT3是STATs蛋白家族成員之一,參與細胞的增殖分化、凋亡、侵襲遷移等等過程。在惡性腫瘤中,其最主要參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的途徑是作為轉錄因子參與調控下游腫瘤基因表達,同時參與血管基底膜重構[2]。研究發(fā)現(xiàn),STAT3在神經(jīng)膠質瘤、惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸部癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌以及前列腺癌等多種實體瘤組織與細胞中異常表達或活性增強[17]。研究表明,STAT3下游的Bcl-2、Survivn與結直腸癌產(chǎn)生的5-FU耐藥性相關[18],且c-Myc基因與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關[19]。在本研究中,我們分別使用了RT-PCR法以及Western blot法檢測LL1對于結直腸癌HT-29細胞Bcl-2、c-Myc、Survivn mRNA表達情況的影響以及與高濃度5-FU組相比,LL1與5-FU聯(lián)用對于STAT3以及其下游Bcl-2、c-Myc、Survivn蛋白表達情況的影響。結果表明,LL1可以抑制HT-29細胞Bcl-2、c-Myc、Survivn mRNA表達,且高濃度聯(lián)用組相比較高濃度5-FU組,p-STAT3以及Bcl-2、c-Myc、Survivn蛋白表達均顯著下降。同時,CCK-8法結果顯示5-FU+LL1聯(lián)用組對HT-29細胞增殖抑制較5-FU組較強,而集落克隆實驗結果顯示低濃度聯(lián)用組較低濃度5-FU組集落數(shù)目顯著減少。此外,Bcl-2是經(jīng)典的抗凋亡基因,Cory等[20]報道,在許多腫瘤中存在Bcl-2的過度表達。在本研究中,我們進行了PI & Annexin Ⅴ雙染實驗,實驗結果顯示,高濃度聯(lián)用組細胞凋亡率顯著高于高濃度5-FU組,結合Western blot以及PCR結果,猜想可能是通過抑制STAT3進而抑制Bcl-2表達,從而促進細胞凋亡。因此,LL1可能通過抑制STAT3并影響其下游基因Bcl-2、c-Myc、Survivn等表達,從而實現(xiàn)增加結直腸癌HT-29細胞對5-FU的敏感性。

綜上,本研究表明LL1可增加結直腸癌對于5-FU化療的敏感性,其機制可能是抑制STAT3并影響其下游基因表達。本研究為臨床治療結直腸癌及逆轉5-FU耐藥提供新的思路。