李仕偉,蔡 爽,馬小平,鄭 琪,趙凌宇(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系,西安 7006;陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科;通訊作者,E-mail:zhaolingyu@xjtu.edu.cn)

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見癌癥,也是全球癌癥死亡的第二大常見原因。據(jù)統(tǒng)計(jì),2008年全世界發(fā)生了748 300例肝癌新病例和695 900例癌癥相關(guān)死亡,是危害人類健康的重要問題。肝細(xì)胞癌(HCC)占所有原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的90%。因?yàn)槠浒l(fā)病的機(jī)制尚不清楚,且治療效果很差,需要投入更大的人力物力進(jìn)行研究。正常人體細(xì)胞大部分停滯于靜息期,但癌細(xì)胞打破正常細(xì)胞周期,進(jìn)入活躍分裂期,加快癌細(xì)胞的分裂增殖及對周圍組織的侵襲。研究肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)基因、調(diào)節(jié)因子等的表達(dá)對研究肝癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。叉頭盒(forkhead box,FOX)家族蛋白參與細(xì)胞生長和分化以及胚胎發(fā)生和壽命,是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)的DNA結(jié)合蛋白。FOX基因家族至少包括43個(gè)成員,其在細(xì)胞周期進(jìn)行中具有重要作用,FOXF1是FOX家族成員之一[1]。FOXF1可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路、細(xì)胞周期蛋白等相關(guān)分子基因表達(dá)進(jìn)而影響人體脈管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)發(fā)育和肺的再生[2-4]。因此，研究FOXF1在肝癌中的表達(dá)及其在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白等方面的機(jī)制具有重要意義。本研究通過觀察FOXF1基因在肝癌中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響,探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)分析FOXF1 在肝癌中表達(dá)與無病生存期(DFI)的相關(guān)性

通過TCGA數(shù)據(jù)(https://xena.ucsc.edu)分析FOXF1在肝癌組織中表達(dá)的臨床意義,FOXF1表達(dá)與肝癌無病生存期(DFI)的相關(guān)性分析數(shù)據(jù)來源于癌癥基因組數(shù)據(jù)可視化UCSCXena平臺(tái)(doi:https://doi.org/10.1101/326470)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

本研究自2017年3月至2018年10月間于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科收集肝癌患者術(shù)后的肝癌組織和癌旁正常肝組織樣本46例,患者年齡為45 ～82歲,27例男性,19例女性;MHCC-97H和Huh7細(xì)胞由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院教育部環(huán)境與基因相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI-1640和血清購于杭州四季青公司;MTT、RnaseA、碘化丙啶(PI)購于美國Sigma公司;FOXF1 siRNA由上海吉瑪公司合成;Annexin Ⅴ-FITC凋亡試劑盒購于美國BD Bioscience公司;FOXF1一抗、Cyclin D1一抗、GAPDH一抗及二抗均購于美國Abcam公司;ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購于武漢三鷹公司;RIPA裂解液購于美國Sigma公司;Lipofec-tamine2000和TRIzol Reagent購自于美國Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa Ex Taq HS和SYBRR Premix Ex TaqTM kit購于中國TaKaRa公司。

低速離心機(jī)TDL-5(上海安亭科學(xué)儀器廠);二氧化碳培養(yǎng)箱Galaxy S(英國RS Biotech公司);高通量多功能微板測試系統(tǒng)(德國BMG Labtechnologies公司);FASCalibar流式細(xì)胞儀(美國FALS CALIBAR BD公司);GBOX-HR全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(英國SYNGENE公司);濕法蛋白電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)DYCZ-40D(美國Bio-Rad公司);水平電泳儀DYCZ-31N(美國Bio-Rad公司);垂直電泳系統(tǒng)SE260(美國Amersham公司);iQ5 Multicolor Real-Time PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞的培養(yǎng)

MHCC-97H細(xì)胞和Huh7細(xì)胞分別分為3組:陰性對照組、siRNA-1組和siRNA-2組,分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA(70 nmol/L)、FOXF1 siRNA-1(70 nmol/L)和FOXF1 siRNA-2(70 nmol/L)。肝癌MHCC-97H和Huh7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.5 siRNA合成與轉(zhuǎn)染

依照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作,將MHCC-97H細(xì)胞和Huh7細(xì)胞用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度接種于96孔板中,置37 ℃孵箱中培養(yǎng)過夜。將FOXF1 siRNA-1、FOXF1 siRNA-2和negative siRNA(NC-siRNA)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MHCC-97H細(xì)胞和Huh7細(xì)胞,培養(yǎng)24,48,72 h后進(jìn)行檢測。具體序列見表1。

表1 siRNAs序列

1.6 MTT比色法檢測FOXF1 siRNAs對肝癌細(xì)胞增殖的影響

以1.4分組進(jìn)行培養(yǎng),MHCC-97H細(xì)胞和Huh7細(xì)胞以5×104/孔分別接種于96孔板,每孔200 μl培養(yǎng)基。每組5個(gè)復(fù)孔,轉(zhuǎn)染后再分別培養(yǎng)24,48,72 h,再每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清并加入150 μl DMSO,在POLARstar+OPTIMA微板測試儀上檢測光吸收值,檢測波長為492 nm。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測FOXF1 siRNAs對肝癌細(xì)胞周期的影響

以1.4分組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染,收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞,用預(yù)冷PBS洗滌2次。加入250 μl PBS重懸細(xì)胞,再逐滴加入750 μl無水乙醇并同時(shí)不斷搖動(dòng)離心管,其終濃度為75%,在4 ℃過夜固定;PBS洗滌1次;加入0.3 ml濃度為100 μg/ml的無DNase的RNaseA,重懸細(xì)胞;再加入0.3 ml濃度為100 μg/ml PI染液,混合均勻,室溫下避光孵育15 min;用流式細(xì)胞儀(FACS)通過檢測細(xì)胞內(nèi)PI含量,反應(yīng)DNA含量的變化情況,進(jìn)而分析細(xì)胞周期不同時(shí)相細(xì)胞比例;用BD FACSort Cellquect軟件獲取數(shù)據(jù)。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測FOXF1 siRNAs對肝癌細(xì)胞凋亡的影響

以1.4分組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染,收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,PBS洗滌3次。用300 μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,使其濃度為1×105/ml。加100 μl的細(xì)胞懸液入5 ml流式管中,再加入5 μ1 Annexin Ⅴ/FITC和5 μl 20 μg/ml的碘化丙錠,避光混勻,孵育15 min。在流式管中加入400 μl PBS。用流式細(xì)胞儀檢測,結(jié)果用隨機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染FOXF1 siRNAs時(shí)肝癌細(xì)胞中FOXF1mRNA表達(dá)

以1.4分組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染,細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h時(shí)加入Trizol。用氯仿、異丙醇等提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加樣,37 ℃ 90 min,70 ℃ 10 min,終止反應(yīng)。real-time PCR反應(yīng),按照人FOXF1序列,設(shè)計(jì)real time PCR引物。FOXF1上游引物:5′-ATAAACTCAGATTGGAACACAG-3′,下游引物:5′-GTACTCTAAGCTTCCTGGCA-3′;GAPDH上游引物:5′-GCCACATTACTCAGACAC-3′,下游引物:5′-GCCCAATACGGTCAAATCC-3′。擴(kuò)增條件:94 ℃變性2 min,按94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s×30個(gè)循環(huán),于72 ℃延伸10 min。用2-ΔΔCt法對real-time PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.10 免疫蛋白印跡(Western blot)分析FOXF1 siRNAs對FOXF1表達(dá)和Wnt5a/β-catenin信號(hào)通路的影響

以1.4分組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染,收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞,應(yīng)用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。變性后電泳,轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入兔抗人FOXF1單克隆抗體(1 ∶1 000稀釋)、兔抗人Wnt5a/β-catenin單克隆抗體(1 ∶1 000稀釋)、小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1 ∶3 000稀釋),4 ℃孵育過夜,洗膜,用HRP標(biāo)記的羊抗兔/羊抗鼠二抗(1 ∶2 000稀釋)室溫孵育2 h,洗膜。加入ECL化學(xué)發(fā)光底物,應(yīng)用Syngene G Box系統(tǒng)拍照及分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。TCGA數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)。應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 FOXF1在肝癌組織中低表達(dá)且與生存期相關(guān)

與癌旁組織相比,肝癌組織中FOXF1 mRNA及其蛋白表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖1A和1B)。TCGA數(shù)據(jù)表明FOXF1高表達(dá)的肝癌患者生存率顯著增高(見圖1C)。

圖1 FOXF1在肝癌組織中的表達(dá)及生存分析Figure 1 Expression and survival analysis of FOXF1 in liver cancer tissues

2.2 FOXF1 siRNAs在肝癌細(xì)胞中的沉默效率

在Huh7細(xì)胞和MHCC-97H細(xì)胞中,與轉(zhuǎn)染NC-siRNA相比,siRNA-1和siRNA-2均可使FOXF1 mRNA表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖2)。同時(shí)與NC-siRNA組相比,siRNA-1組和siRNA-2組FOXF1蛋白表達(dá)也均明顯下調(diào)(見圖2)。表明siRNA有效沉默Huh7和MHCC-97H細(xì)胞中FOXF1表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)染FOXF1 siRNAs對肝癌細(xì)胞增殖的影響

通過MTT比色法分析了沉默F(xiàn)OXF1表達(dá)24,48,72 h時(shí)對Huh7細(xì)胞和MHCC-97H細(xì)胞增殖能力的影響。在Huh7細(xì)胞和MHCC-97H細(xì)胞中,與轉(zhuǎn)染NC-siRNA相比,轉(zhuǎn)染siRNAs 24 h時(shí)細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)染siRNAs 48,72 h時(shí)細(xì)胞增殖能力均顯著地提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明沉默F(xiàn)OXF1表達(dá)可促進(jìn)Huh7和MHCC-97H細(xì)胞增殖。

2.4 轉(zhuǎn)染FOXF1 siRNAs對肝癌細(xì)胞周期的影響

在Huh7和MHCC-97H細(xì)胞中分別用FOXF1 siRNA-1和siRNA-2轉(zhuǎn)染48 h時(shí),通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。與陰性對照組相比,siRNA-1組和siRNA-2組G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01),S期細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01),而G2/M期細(xì)胞數(shù)量無顯著變化(P>0.05,見圖4);表明沉默F(xiàn)OXF1可促使Huh7和MHCC-97H細(xì)胞進(jìn)入S期。

與陰性對照組比較,* *P<0.01圖2 在不同肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FOXF1 siRNAs后FOXF1表達(dá)變化Figure 2 Changes of FOXF1 expression after transfection of FOXF1 siRNAs in liver cancer cells

與陰性對照組比較,* *P<0.01圖3 FOXF1 siRNAs對不同肝癌細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of FOXF1 siRNAs on the proliferation of liver cancer cells

2.5 轉(zhuǎn)染FOXF1 siRNAs對肝癌細(xì)胞凋亡的影響

在Huh7和MHCC-97H細(xì)胞中分別用FOXF1 siRNA-1和siRNA-2轉(zhuǎn)染48 h時(shí),采用Annexin Ⅴ/PI試劑盒染色,運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測沉默F(xiàn)OXF1表達(dá)對Huh7和MHCC-97H細(xì)胞凋亡的影響。與陰性對照組相比,siRNA-1組、siRNA-2組Huh7和MHCC-97H細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖5)。表明沉默F(xiàn)OXF1抑制了Huh7和MHCC-97H細(xì)胞凋亡。

與陰性對照組比較,* *P<0.01圖4 FOXF1 siRNAs對肝癌細(xì)胞周期的影響Figure 4 Effect of FOXF1 siRNAs on cell cycle of liver cancer cells

與陰性對照組比較,* *P<0.01圖5 FOXF1 siRNAs對肝癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 5 Effect of FOXF1 siRNAs on apoptosis of liver cancer cells

2.6 轉(zhuǎn)染FOXF1 siRNAs調(diào)控Wnt5a/β-catenin信號(hào)通路

為分析FOXF1作用的分子機(jī)制,采用Western blot分析沉默F(xiàn)OXF1對Huh7和MHCC-97H細(xì)胞FOXF1、Wnt5a、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和active Caspase-3表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與陰性對照組相比,siRNA-1組和siRNA-2組Wnt5a、β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達(dá)均升高(P<0.01),FOXF1和active Caspase-3表達(dá)降低(P<0.01,見圖6)。

3 討論

FOX蛋白是一個(gè)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子超家族,它在人體發(fā)育和癌癥發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用[1,5,6]。FOXF1是forkhead轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝等作用,其在某些類型的癌癥的進(jìn)展中也起著關(guān)鍵作用[7]。FOXF1通過調(diào)節(jié)肺癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞來刺激癌細(xì)胞遷移和腫瘤生長[8]。FOXF1在小鼠乳腺上皮細(xì)胞系中的過表達(dá)與上皮-間皮轉(zhuǎn)化表型和侵襲潛力有關(guān)[9]。在乳腺癌中FOXF1表達(dá)降低是其發(fā)生的主要原因,主要機(jī)制為FOXF1通過阻斷G1-S細(xì)胞周期進(jìn)程來抑制乳腺癌細(xì)胞系的生長和致瘤性[10]。一項(xiàng)結(jié)直腸腺癌研究表明,結(jié)直腸癌的不良預(yù)后與過度表達(dá)的FOXF1的細(xì)胞質(zhì)錯(cuò)誤定位有關(guān)[11]。但FOXF1在肝癌中的作用機(jī)制仍不是很清楚,因此研究FOXF1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)和功能很重要。

為了研究FOXF1在肝癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期級凋亡中的表達(dá)和功能,我們用siRNA沉默F(xiàn)OXF1基因表達(dá)。通過本研究發(fā)現(xiàn)與陰性對照相比,沉默F(xiàn)OXF1基因的G0/G1期肝癌細(xì)胞會(huì)更多地向S期轉(zhuǎn)化,肝癌細(xì)胞在48 h和72 h時(shí)增殖能力顯著增強(qiáng),肝癌細(xì)胞早晚期凋亡數(shù)量顯著降低。表明FOXF1具有抑制肝癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換、抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。為了解其分子機(jī)制我們利用Western blot分析沉默F(xiàn)OXF1對肝癌細(xì)胞Wnt5a、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和active Caspase-3表達(dá)的影響。研究表明Wnt5a參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、代謝和炎癥,其信號(hào)的異常激活或抑制發(fā)揮致癌和腫瘤抑制作用[12]。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分,其在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄活性等方面具有重要作用[13]。c-Myc是原癌基因家族之一,其具有誘導(dǎo)基因過度表達(dá)影響基因組穩(wěn)定性的作用,在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[14]。Cyclin D1是CCND1基因編碼的蛋白質(zhì),位于11q13染色體上,是細(xì)胞周期生理調(diào)控的關(guān)鍵成分,可促進(jìn)細(xì)胞不受控制地增殖[15]。active Caspase-3是公認(rèn)的細(xì)胞凋亡早期和晚期的生化指標(biāo),是檢測細(xì)胞凋亡的重要方法[16]。本研究發(fā)現(xiàn),沉默F(xiàn)OXF1后與陰性對照相比Wnt5a、β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達(dá)均升高,FOXF1和active Caspase-3表達(dá)降低。這表明在肝癌細(xì)胞中沉默F(xiàn)OXF1表達(dá),可促進(jìn)Wnt5a/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)肝癌進(jìn)展。

與陰性對照組比較,* *P<0.01圖6 FOXF1 siRNAs對Wnt5a/β-catenin信號(hào)通路的影響Figure 6 Effect of FOXF1 siRNAs on Wnt5a/β-catenin signalling pathway

通過本研究發(fā)現(xiàn),FOXF1在肝癌細(xì)胞過度表達(dá),通過上調(diào)Wnt5a、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1等蛋白表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌變并促進(jìn)其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等,通過下調(diào)active Caspase-3蛋白表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞凋亡,上述機(jī)制都會(huì)增加肝癌的惡性度?？梢奆OXF1在肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中處于上游調(diào)控地位。通過本研究更清楚地闡明FOXF1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及功能,為肝癌治療提供新思路。