柯敏輝,李雪玉,許振國(guó)(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院肛腸科,福州 350003;福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院健康管理中心)

直腸黏膜內(nèi)脫垂(internal rectal prolapse,IRP)是在排便過(guò)程中近側(cè)腸壁折入遠(yuǎn)側(cè)的肛管或腸腔中,但未超出肛門(mén)外緣且在排便后仍然存在[1]。IRP是導(dǎo)致出口梗阻型便秘常見(jiàn)原因之一,可引起患者出現(xiàn)排便費(fèi)力或梗阻感、肛門(mén)墜脹、排便不盡感、大便次數(shù)增多等癥狀,并且隨著年齡增長(zhǎng)IRP的發(fā)病率也逐漸上升,IRP已成為影響中老年人群健康的常見(jiàn)病之一[2,3]。然而,關(guān)于IRP的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚,且臨床上缺乏有效的防治手段。鄭發(fā)鵑等[4]認(rèn)為因直腸黏膜層與肌層之間的結(jié)締組織出現(xiàn)松弛,支撐作用降低,黏膜層下移而發(fā)為本病。有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)締組織中膠原纖維的改變與脫垂的發(fā)生密切相關(guān),而CD68、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,BFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)水平則對(duì)膠原纖維的合成與分解起到重要的作用[5-8]。因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)IRP患者的直腸黏膜進(jìn)行Masson染色和免疫組化染色,觀察直腸組織膠原纖維的變化,并探討CD68、BFGF、VEGF在直腸黏膜內(nèi)脫垂組織中的表達(dá)及意義,有助于其發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究,從而為IRP的臨床防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年6月至2021年9月因直腸黏膜內(nèi)脫垂于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院行選擇性痔上黏膜切除術(shù)(tissue-selecting therapy stapler,TST)的患者50例為IRP組,同期Ⅱ～Ⅲ期內(nèi)痔(無(wú)合并IRP)行TST術(shù)的患者50例為對(duì)照組。IRP組中男性18例,女性32例,平均年齡(53.16 ±8.39)歲;對(duì)照組中男性21例,女性29例,平均年齡(52.61 ±9.81)歲。兩組患者的一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究已經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批且取得患者知情同意。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65歲；②術(shù)前IRP組患者均經(jīng)排糞造影明確有直腸黏膜內(nèi)脫垂，對(duì)照組患者均經(jīng)排糞造影明確無(wú)合并直腸黏膜內(nèi)脫垂。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有直腸外脫垂者；②孕婦及圍產(chǎn)期婦女；③合并潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等腸道感染性疾病者；④合并心腦血管、肝腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾?。虎輫?yán)重糖尿病、惡性腫瘤、精神病患者；⑥血友病患者，有出血傾向的患者。

1.3 主要試劑

Masson染色試劑盒、免疫組化染色試劑盒、兔抗人CD68抗體、兔抗人BFGF抗體、兔抗人VEGF抗體(均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 組織標(biāo)本采集及處理

所有患者均行TST術(shù)治療,術(shù)中收集吻合器截取的直腸組織固定于4%甲醛溶液中,常規(guī)石蠟包埋、切片,分別做Masson染色和免疫組化染色,觀察直腸組織中膠原纖維變化和CD68、BFGF、VEGF的表達(dá)情況并拍照記錄。

1.5 Masson染色

Masson染色后,膠原纖維呈藍(lán)色,肌纖維、紅細(xì)胞呈紅色,在40倍鏡下每個(gè)切片隨機(jī)選取黏膜肌層及黏膜下組織的3個(gè)視野,并使用圖像分析軟件Image J,第一步計(jì)算膠原纖維面積,打開(kāi)截取的Masson染色圖片,點(diǎn)擊Process 中Enhance Contrast增強(qiáng)對(duì)比度,然后點(diǎn)擊Image中Adjust的Threshold,調(diào)節(jié)Hue、Saturation和Brightness使藍(lán)色部分(膠原纖維)被選中,在點(diǎn)擊Threshold Color菜單下的Select后,點(diǎn)擊Analyze勾選Measure,得到膠原纖維面積;第二步計(jì)算組織總面積,點(diǎn)擊Image中Adjust的Threshold,調(diào)節(jié)閾值使組織全部被選中,點(diǎn)擊Analyze勾選Measure,得到組織總面積。膠原纖維所占面積比=膠原纖維面積/組織總面積,每個(gè)切片結(jié)果取3張圖片的平均值,對(duì)比IRP組和對(duì)照組患者直腸組織中膠原纖維的變化。

1.6 免疫組化染色

免疫組化染色檢測(cè)直腸組織CD68、BFGF、VEGF的表達(dá)情況,免疫組化染色結(jié)果由陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度乘以陽(yáng)性細(xì)胞百分比,陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度:無(wú)染色為0分;淡黃色為1分;深黃色為2分;棕黃色為3分;陽(yáng)性細(xì)胞百分比:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分;小于10%為1分;11%～25%為2分;26%～50%為3分;51%～75%為4分;大于76%為5分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 直腸組織中膠原纖維的變化

Masson染色結(jié)果顯示,相較于對(duì)照組,IRP組黏膜肌層及黏膜下組織膠原纖維顯著減少(P<0.05,見(jiàn)表1),且膠原纖維的排列紊亂,伴間質(zhì)疏松,血管擴(kuò)張,數(shù)量增多(見(jiàn)圖1)。

表1 兩組膠原纖維所占面積比的比較

圖1 兩組直腸組織中膠原纖維含量和結(jié)構(gòu)的改變 (Masson染色,×40)Figure 1 Changes of collagen fiber content and structure in rectal tissues in two groups (Masson staining,×40)

2.2 直腸組織CD68、BFGF、VEGF的表達(dá)水平

免疫組化染色結(jié)果顯示,IRP組CD68、BFGF、VEGF的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05,見(jiàn)表2和圖2)。

表2 兩組CD68、BFGF、VEGF表達(dá)水平的比較

圖2 兩組直腸組織中CD68、BFGF、VEGF的染色結(jié)果比較 (免疫組化染色,×40)Figure 2 Comparison of CD68, BFGF and VEGF expression in rectal tissues between the two groups (immunohistochemical staining,×40)

3 討論

關(guān)于直腸黏膜內(nèi)脫垂的病因尚未明確，但研究表明有長(zhǎng)期腹瀉或便秘、高齡、多產(chǎn)女性、飲酒、肥胖、嗜好油膩辛辣或低纖維食物等危險(xiǎn)因素的患者更易出現(xiàn)脫垂[9,10]。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制仍缺乏共識(shí)，目前較為流行的學(xué)說(shuō)有腸套疊學(xué)說(shuō)、滑動(dòng)性疝學(xué)說(shuō)、肛提肌功能障礙綜合征學(xué)說(shuō)、會(huì)陰下降綜合征學(xué)說(shuō)等[11-13]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為IRP屬中醫(yī)脫肛病范疇，其病機(jī)為“筋脈橫解，腸澼為痔”，其中“痔”為所有肛腸疾病的總稱，“筋脈”指直腸周?chē)慕罱?jīng)血脈，具有約束固定作用，“橫”為放縱、雜亂之義，“解”通懈，引申為損傷致斷裂、分離之意；“澼”同辟，通襞，為重疊、積結(jié)之義，全句指出直腸的筋經(jīng)血脈，因約束功能受損致雜亂松弛，甚至斷裂分離，腸壁重疊積聚而發(fā)為本病[14,15]。本實(shí)驗(yàn)中觀察IRP患者直腸黏膜下組織的間質(zhì)疏松，排列紊亂，血管擴(kuò)張的結(jié)果與此相符。而導(dǎo)致“筋脈橫解”的病因在《景岳全書(shū)》中有詳細(xì)的記載：“有因久瀉久痢，脾腎氣陷而脫者；有因中氣虛寒，不能收攝而脫者；有因勞役吐瀉，傷肝脾而脫者；有因酒濕傷脾，色欲傷腎而脫者；有因腎氣本虛，關(guān)門(mén)不固而脫者；有因過(guò)用寒涼，降多亡陽(yáng)而脫者；有因濕熱下墜而脫者”?？傊蹦c黏膜需依賴于其下的結(jié)締組織固定于肌層，但因久瀉、久痢、過(guò)勞、飲酒、濕熱等受到損傷，導(dǎo)致固攝失司，而致脫肛。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IRP患者的直腸黏膜肌層及黏膜下組織膠原纖維顯著減少。膠原纖維是結(jié)締組織的主要成分,它在含量、結(jié)構(gòu)、比例等方面的改變均可影響到結(jié)締組織的支撐作用[16,17]。而膠原纖維主要受成纖維細(xì)胞調(diào)控[18],已有研究發(fā)現(xiàn)脫垂組織中成纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,功能受損,以致膠原纖維合成與分解的平衡紊亂[19,20]。基于此推斷,結(jié)締組織中膠原纖維減少,是引起IRP的重要發(fā)病機(jī)制之一。

CD68為巨噬細(xì)胞膜表面分子,是檢測(cè)巨噬細(xì)胞的通用標(biāo)記物[21]。在本實(shí)驗(yàn)中,CD68表達(dá)水平明顯升高,膠原纖維束間有大量的巨噬細(xì)胞聚集,這與前期研究[22-24]發(fā)現(xiàn)IRP兔模型的直腸組織有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的研究結(jié)果相符。因局部炎癥環(huán)境是損傷修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素,當(dāng)受到損傷時(shí),先刺激組織釋放炎性因子,使巨噬細(xì)胞在損傷部位迅速被募集,在那里參與促炎、抗炎過(guò)程[25,26]。特別是巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的關(guān)系,在促炎階段,巨噬細(xì)胞具有加速成纖維細(xì)胞的凋亡和膠原纖維的分解的作用[27,28];而在抗炎階段,巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌抗炎細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,如BFGF、VEGF、IL-10等,從而啟動(dòng)修復(fù)信號(hào)[29,30]。其中BFGF作為調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞代謝的重要因子,具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、遷移和膠原纖維合成的作用[31],而VEGF則通過(guò)促進(jìn)新生血管,提高局部血管的通透性,為修復(fù)過(guò)程提供充足營(yíng)養(yǎng),加強(qiáng)成纖維細(xì)胞的活性,促進(jìn)膠原纖維的合成[32]。因巨噬細(xì)胞能隨微環(huán)境的變化,在促炎和抗炎兩個(gè)方向極化[33],故而當(dāng)IRP患者的膠原纖維含量明顯減少,刺激巨噬細(xì)胞分泌BFGF、VEGF,啟動(dòng)修復(fù)功能;但BFGF、VEGF均具有介導(dǎo)血管生成和擴(kuò)張的作用[34,35],因而IRP患者的直腸黏膜下層見(jiàn)大量新生毛細(xì)血管,伴血管擴(kuò)張充血,間質(zhì)水腫、疏松(見(jiàn)圖2)。Laplante等[36]研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞還可在特定刺激下從促炎型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡仔途奘杉?xì)胞,并有利于傷口修復(fù)?；诖?在臨床治療中,或可通過(guò)調(diào)控促炎與抗炎的反應(yīng)過(guò)程,誘導(dǎo)出更多的抗炎型巨噬細(xì)胞,促進(jìn)其分泌BFGF、VEGF,影響成纖維細(xì)胞的增殖、遷移,膠原纖維的合成、分解,達(dá)到治療IRP的目的。

綜上所述,直腸組織或因受到各種危險(xiǎn)因素的損傷刺激,導(dǎo)致膠原纖維減少,并促進(jìn)CD68、BFGF和VEGF分泌,毛細(xì)血管生成增多,但膠原纖維生成不足,結(jié)締組織的支撐作用下降,導(dǎo)致IRP的發(fā)生。